標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊藥效學(xué)研究

石 菊，高 陸，許艷茹，曲笑鋒，白 冰，李 敏，宮海全，徐 建

六味地黃是滋陰補(bǔ)腎之首方，用于治療腎陰虧損、腰膝酸軟等癥［1-2］，按中醫(yī)理論，這些疾病可歸結(jié)為腎陰虛［3］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)則認(rèn)為腎陰虛與人體下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）、性腺（HPGA）軸以及免疫密切相關(guān).因此，本研究深入探討標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊對腎陰虛大鼠血清中cAMP、cGMP、ACTH、Cor.、SOD、MDA，腎陰虛小鼠血清中IgG、IgM、廓清指數(shù)K、吞噬指數(shù)α和淋巴細(xì)胞增殖能力的影響［4-5］，并與六味地黃膠囊比較，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料

1.1 動物

ICR小鼠、Wistar大鼠，雄性，6周齡，體重：20±2 g，200±20 g，長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，合格證號：SCXK（吉）2016-0003.

1.2 藥品、試劑和儀器

（1）藥品.標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊，批號：171001，修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；六味地黃膠囊，批號：151001，修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；杞菊地黃膠囊，批號：160101，重慶賽諾生物藥業(yè)股份有限公司.

（2）試劑.氫化可的松注射液，批號：151214，吉林省華牧動物保健品有限公司；免疫球蛋白IgM和IgG試劑盒，批號：201707；環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)鳥苷酸（cGMP）、睪酮（T）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、皮質(zhì)醇（Cor.）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD），批號：201708.

（3）儀器.SMP-500-18272-LSI0型酶標(biāo)儀（Designed in California USA）；6100型 CO2培養(yǎng)箱，日本SANYAN公司；CDS-1型倒置顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠；AB204-E分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司.

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊對腎陰虛大鼠下丘腦-垂體-腎上腺、性腺軸的影響的檢測

（1）腎陰虛動物模型制備及分組［6］.雄性Wistar大鼠共100只，空白組大鼠腹腔注射生理鹽水，每天25 mg·kg-1；其余大鼠腹腔注射氫化可的松，每天25 mg·kg-1，連續(xù)注射7 d后停藥1 d，觀察大鼠一般形態(tài).凡出現(xiàn)雙目無神、精神不振、屈背蜷縮、大便稀爛、肛溫和肢端溫降低、飲水量減少，與正常對照組有顯著差異者為造模成功.隨機(jī)分為空白組、模型組、標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊高、中、低劑量組（216mg·kg-1、108mg·kg-1、54mg·kg-1）、六味地黃膠囊組（108 mg·kg-1）、杞菊地黃膠囊組（1 000 mg·kg-1），每組10只.造模成功后隔日開始藥物干預(yù)，空白組和模型組，常規(guī)喂養(yǎng)，灌喂0.4%CMC溶液10 mg·kg-1，1次/天，連續(xù)給藥14 d.

（2）指標(biāo)檢測.給藥14 d后，以水合氯醛3 mL·kg-1，腹腔注射，腹主靜脈取血，靜置30 min后，3 500 r·min-1離心 15 min，測血清中cAMP、cGMP、T、ACTH、Cor.、MDA、SOD 含量；解剖動物，無菌取腎上腺、睪丸，稱重并記錄.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊對糖皮質(zhì)激素腎陰虛小鼠免疫功能的影響的檢測［7-11］

（1）腎陰虛動物模型制備及分組.100只ICR小鼠分為空白組10只和造模組90只，造模組小鼠皮下注射氫化可的松1 mg/只，隔日1次，共3次；正常對照組，注射等量生理鹽水，頻率與模型組相同，第7 d造模組小鼠隨機(jī)分為：模型組、標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊高、中、低劑量組（400 mg·kg-1、240 mg·kg-1、80 mg·kg-1）、六味地黃膠囊組（240 mg·kg-1）、杞菊地黃膠囊組（2 100 mg·kg-1），連續(xù)給藥7 d.

（2）對腎陰虛小鼠體液免疫指標(biāo)測定.末次給藥1 h后，各組小鼠眼球取血，3 500 r·min-1離心15 min，測血清中IgM和IgG含量.

（3）對腎陰虛小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響.末次給藥后1h，稱體重，各鼠均按0.1mL/10 g劑量由尾靜脈注入印度墨汁（以生理鹽水按1∶5稀釋），注射后分別在1 min（t1）、10 min（t2）從小鼠眼眶靜脈叢取血20 μL溶于2.0 mL 0.1%Na2CO3溶液中搖勻，放置20 min后在680 nm波長處測其吸光度值（A），以0.1%Na2CO3溶液作空白對照，將小鼠處死后取肝臟、脾臟和胸腺，稱重，根據(jù)公式計算廓清指數(shù)K值和吞噬指數(shù)α值［12-13］.

式中：t1、t2分別為取血時間；A1、A2分別為在時間t1、t2時所取血樣對應(yīng)的吸光度.

（4）對腎陰虛小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響.取小鼠脾臟，研磨，獲取單個脾細(xì)胞，加至比重為1.08的淋巴細(xì)胞分離液上，2 000 r·min-1，20 min，密度梯度離心，吸取中間云霧狀細(xì)胞層，用10%FBS RPMI-1640洗滌2次，1 000 rpm離心10min，然后用完全營養(yǎng)液配成5×106個/mL.取1 mL加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入終濃度為5 μg·mL-1的ConA，培養(yǎng)48 h后，每孔加入100 μL MTT溶液，再繼續(xù)培養(yǎng)12 h.取出培養(yǎng)板，2 000 rpm離心5 min，棄去上清液，每孔加入DMSO 1 mL，于振蕩器上充分振蕩30 s.然后靜止20 min，在560 nm波長處比色分析.利用公式計算刺激指數(shù)，判斷淋巴細(xì)胞增殖情況［14］.

2.3 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用成組設(shè)計定量資料的t檢驗.

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊對腎陰虛大鼠下丘腦-垂體-腎上腺、性腺軸的影響

腎陰虛模型組大鼠出現(xiàn)煩躁、易激惹、拱背扎堆、毛發(fā)枯槁易脫落、大便干結(jié)、飲食增多等癥狀.與空白對照組比較，模型組血清cAMP、ACTH、Cor.、MDA含量升高（P＜0.05，P＜0.01），cGMP、T、SOD含量明顯降低（P＜0.01，P＜0.001）.與模型組比較，標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊高劑量組血清中cAMP、ACTH、Cor.、MDA含量降低（P＜0.05，P＜0.01），cGMP、T、SOD含量升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；中劑量組血清中 cAMP、ACTH、Cor.、MDA含量有所降低（P＜0.05，P＜0.01），cGMP、T、SOD含量升高（P＜0.05，P＜0.001）；低劑量組血清中cGMP含量升高（P＜0.05），Cor.含量降低（P＜0.05）；杞菊地黃膠囊血清中cAMP、ACTH、Cor.、MDA含量降低（P＜0.05，P＜0.001），cGMP、T、SOD含量升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）.表明標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊能抑制腎陰虛大鼠血清cAMP含量升高和cGMP含量下降，能明顯減緩腎陰虛模型大鼠血清ACTH、Cor.濃度上升的趨勢，使其血清T含量基本恢復(fù)到正常水平，調(diào)節(jié)機(jī)體生殖功能，降低自由基對細(xì)胞的傷害，調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化能力，標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊中劑量作用優(yōu)于六味地黃膠囊.結(jié)果見表1.

表1 標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊對腎陰虛大鼠血清中cAMP、cGMP、ACTH、Cor.、T、SOD、MDA含量的影響（±s，n=10）

表1 標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊對腎陰虛大鼠血清中cAMP、cGMP、ACTH、Cor.、T、SOD、MDA含量的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01，▲▲▲P ＜0.001；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001，與標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊中劑量比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001.

組別 劑量/（mg·kg-1）cAMP/（nmol·L-1）cGMP/（nmol·L-1）ACTH/（pg·mL-1）Cort./（ng·mL-1）T/（pg·mL-1）SOD/（U·mL-1）MDA/（nmol·mL-1）1.79±0.10 2.64±0.53▲2.35±0.19△△△2.47±0.34△△△1.82±0.17***1.92±0.14**2.00±0.15**空白組模型組杞菊地黃膠囊組六味地黃膠囊組— —標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊高劑量組中劑量組低劑量組1 000 108 216 108 54 5.14±0.69 7.09±1.07▲▲6.26±0.34*△△△6.49±0.43△△△5.29±0.31***5.35±0.31***5.44±0.40***8.18±0.51 6.85±1.49▲8.17±0.53*8.48±0.45**8.75±0.42**8.58±0.54**8.19±0.56*40.36±1.68 50.19±7.68▲▲▲44.59±2.03*45.29±2.03 43.04±5.38*44.29±2.24*47.29±3.26 77.07±2.98 99.23±30.48▲74.31±3.47*80.64±6.81 77.52±6.01*79.00±4.45*83.47±4.57 317.43±30.76 283.82±32.70▲319.88±13.93**321.16±19.25**346.44±22.40***340.19±75.72*300.60±28.62 5.18±1.06 4.08±0.98▲4.83±0.92 5.09±0.81*5.60±1.32*5.45±1.42*5.08±0.52*

3.2 標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊對腎陰虛小鼠體液、細(xì)胞和非特異性免疫功能的影響

與空白組相比，模型組鼠血清中IgG和IgM含量有所升高（P＜0.05），胸腺指數(shù)、廓清指數(shù)K顯著減?。≒＜0.01，P＜0.001），吞噬指數(shù)α有所降低（P＜0.001），刺激指數(shù)顯著降低；與模型組比較，標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊高、中劑量組血清中IgG和IgM含量降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），小鼠廓清指數(shù)K、吞噬指數(shù)α有所增加（P＜0.01，P＜0.001），T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)顯著增加，分別為158.2%、126.4%，標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊中劑量組與杞菊地黃膠囊作用相當(dāng)，優(yōu)于六味地黃膠囊.詳見表2～表4.

表2 標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊對腎陰虛小鼠血清中IgG和IgM含量的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，▲▲P ＜0.01，▲▲▲P ＜0.001；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001.

IgM/（μg·mL-1）805.38±106.62 1 262.80±344.38▲▲946.59±195.95*846.94±246.26**808.19±95.13***822.41±221.07**995.73±120.24*組別空白組模型組杞菊地黃膠囊組六味地黃膠囊組劑量/（mg·kg-1）— —標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊高劑量組中劑量組低劑量組2 100 240 400 240 80 IgG/（mg·mL-1）10.36±0.97 14.35±1.41▲▲▲10.91±1.28***10.99±1.07***10.59±1.23***10.75±0.68***10.93±2.07***

表3 標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊對腎陰虛小鼠臟器/體質(zhì)量比值的影響（±s，n=10）

表3 標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊對腎陰虛小鼠臟器/體質(zhì)量比值的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01，▲▲▲P ＜0.001；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001，與標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊中劑量比較，△△P ＜0.01.

吞噬指數(shù)/α 6.68±1.32 4.31±1.03▲▲▲6.42±1.08***5.70±1.52*6.26±1.05***6.12±0.47***4.39±3.03組別空白組模型組杞菊地黃膠囊組六味地黃膠囊組標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊劑量/（mg·kg-1）— —高劑量組中劑量組低劑量組2 100 240 400 240 80脾臟指數(shù)/（mg·g-1）5.5±1.32 8.85±4.75▲4.09±1.49**6.52±2.36 6.54±1.81 7.23±2.37 7.41±1.81胸腺指數(shù)/（mg·g-1）2.61±0.67 1.29±0.27▲▲▲1.81±0.19***△△2.03±0.79*2.70±0.58***2.50±0.65***2.12±0.82**廓清指數(shù)/K 0.069±0.02 0.039±0.01▲▲0.059±0.02*0.055±0.03 0.061±0.02**0.056±0.01**0.037±0.03

表4 標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊對腎陰虛小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響（±s，n=10）

表4 標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊對腎陰虛小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響（±s，n=10）

組別空白組模型組杞菊地黃膠囊組六味地黃膠囊組標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊劑量/（mg·kg-1）— —高劑量組中劑量組低劑量組2 100 240 400 240 80刺激指數(shù)/%100 23.7 126.0 97.1 138.2 124.6 85.2

4 討論

現(xiàn)在市場銷售不同廠家的六味地黃膠囊，其治療效果也是良莠不齊，根據(jù)《國家中醫(yī)藥管理局辦公室 國家發(fā)展改革委辦公廳關(guān)于做好中藥標(biāo)準(zhǔn)化項目管理工作的通知》（國中醫(yī)藥辦科技發(fā)［2017］4號），已將修正六味地黃膠囊列入中藥重點產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)品種之一［15］，通過對六味地黃膠囊生產(chǎn)工藝驗證、規(guī)程制定與SOP修訂，建立六味地黃膠囊生產(chǎn)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，使得六味地黃膠囊產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化，本研究采用糖皮質(zhì)激素腎陰虛動物模型，對標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊與六味地黃膠囊的滋陰補(bǔ)腎作用作對比研究，制定六味地黃膠囊生產(chǎn)規(guī)范和行業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化，以保證六味地黃膠囊臨床效應(yīng)的一致性.

HPA軸是由下丘腦、垂體與腎上腺構(gòu)成的調(diào)節(jié)人體多種生命活動的重要神經(jīng)內(nèi)分泌功能軸之一，HPA軸紊亂下丘腦分泌大量CRH，促使垂體分泌ACTH增加，進(jìn)而刺激腎上腺皮質(zhì)釋放GCS，使血清CORT水平明顯升高.結(jié)果表明，模型小鼠垂體ACTH和血清Cor.水平確實明顯升高.以氫化可的松注射液灌胃建立腎陰虛大鼠模型，模型組大鼠出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能紊亂，以血清中cAMP含量明顯升高、cGMP含量明顯降低表明模型建立成功，而各給藥組能抑制腎陰虛大鼠血清cAMP含量升高和cGMP含量下降，使其血清cAMP、cGMP含量基本恢復(fù)到正常水平，不同程度地提高了ATCH、Cort.的含量，改善HPA軸功能紊亂.與空白組比較，模型組腎上腺皮質(zhì)變薄，球狀帶、束狀帶變窄、結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞排列不規(guī)則，體積縮小，細(xì)胞質(zhì)呈空泡狀，細(xì)胞間隙變寬，局部有壞死及炎性細(xì)胞；標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊、杞菊地黃膠囊球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列有序，偶見炎性細(xì)胞，其中以標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊組織形態(tài)最接近空白組.HPGA軸是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分［16］.結(jié)果表明，外源性給予糖皮質(zhì)激素可以在HPGA軸的多個環(huán)節(jié)對其產(chǎn)生抑制作用［17-19］，標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊對腎陰虛大鼠受損性腺（睪丸、子宮）有修復(fù)作用，并能上調(diào)雄鼠血清T水平，說明標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊對HPGA軸功能紊亂有靶向調(diào)節(jié)作用.由于糖皮質(zhì)激素水平的升高誘導(dǎo)了胸腺細(xì)胞的凋亡，結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)化六味地黃膠囊對腎陰虛小鼠的體液免疫、細(xì)胞免疫及非特異性免疫有明顯的調(diào)節(jié)作用.即能促進(jìn)機(jī)體生成抗體，增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能.能在較短的時間內(nèi)使腎陰虛小鼠的免疫功能恢復(fù)到基本正常水平，調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫內(nèi)分泌系統(tǒng)，使免疫的病理狀態(tài)趨于正常，且作用優(yōu)于六味地黃膠囊.