不同炮制品組方的獨活寄生湯對大鼠佐劑性關節(jié)炎的作用及炎癥因子比較研究

李衛(wèi)先，王文翰，劉園園，王議憶

(湖南中醫(yī)藥高等?？茖W校，湖南 株洲 412012)

類風濕性關節(jié)炎,是一種以關節(jié)炎癥和骨質破壞為主的自身免疫性疾病。獨活寄生湯由中藥獨活、桑寄生、杜仲、牛膝、細辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防風、川芎、人參、甘草、當歸、芍藥和干地黃15味中藥組成[1],近代主要用該方治療痹證日久而致正氣不足者。臨床主要用于治療慢性關節(jié)炎、風濕性和類風濕性關節(jié)炎[2-5]。現(xiàn)代藥理學研究證實,該方具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調節(jié)等藥理作用[6-7]。方中杜仲有生杜仲、鹽杜仲，牛膝有生牛膝、酒牛膝，川芎有生川芎、酒川芎，當歸有生當歸和酒當歸，白芍有生白芍和酒白芍等炮制品。但原方并未闡明方中各藥所用的具體炮制品。故本研究采用佐劑性關節(jié)炎大鼠動物模型，從免疫器官、抗炎、調節(jié)炎癥因子等方面對不同炮制品組方的獨活寄生湯的藥效進行對比實驗研究，而探討獨活寄生湯臨床上用于治療佐劑性關節(jié)炎時杜仲、牛膝、川芎、當歸、白芍在獨活寄生湯配方中最佳的炮制品，為其臨床應用提供可靠的藥效學基礎。

1 材料

1.1 藥物與試劑

實驗所用藥材獨活、桑寄生、牛膝、細辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防風、川芎、當歸、干地黃、杜仲、人參、白芍、甘草等均由湖南中醫(yī)藥高等?？茖W校附屬一醫(yī)院提供，按《中國藥典》(2015一部)鑒定為合格藥材。弗氏完全佐劑( Freund scomplete adjuvant，F(xiàn)CA)為Sigma公司產(chǎn)品，試劑腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6) 酶聯(lián)免疫試劑盒購，購自上海科興商貿(mào)有限公司。

1.2 動物

清潔級SD大鼠225只，雌雄各半，鼠齡6周，體質量(200±20)g，均由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心代購,許可證編號：SCXK(湘)2015-0008。

1.3 儀器

中佳KLC-2046型低速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠),恒溫恒濕箱(上海一恒科學儀器有限公司),全自動酶標儀(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 樣品的分組及提取

2.1.1 樣品的分組

樣品中獨活寄生湯皆按《方劑學》教材規(guī)定的劑量稱取[1]，1組:組成成分為生品組方的獨活寄生湯的水煎液，具體組成為：獨活9 g，桑寄生6 g，杜仲6 g，牛膝6 g，細辛6 g，秦艽6 g，茯苓6 g，肉桂6 g，防風6 g，川芎6 g，人參6 g，甘草6 g，當歸6 g，白芍6 g，干地黃6 g；2組：杜仲鹽炙其它藥物均為生品組方的獨活寄生湯；3組：牛膝、川芎、當歸、白芍均酒炙，其它藥物均為生品組方的獨活寄生湯；4組：杜仲鹽炙、牛膝、川芎、當歸、白芍均酒炙，其它藥物均為生品組方的獨活寄生湯。以上各組各藥用量同1組。

2.1.2 樣品的提取

以上各組藥按量稱取各藥后常溫(25℃) 加蒸餾水2 000 mL浸泡30 min，煮沸后文火煎30 min過濾藥液，藥渣加1 000 mL蒸餾水再煎煮25 min，合并兩次濾液，濃縮至獨活寄生湯約0.5 g/mL，1.0 g/mL，2.0 g/mL，放入4℃冰箱備用。

2.2 動物造模

將225只大鼠適應性飼養(yǎng)一周后，隨機分為對照組，模型組，阿司匹林組，獨活寄生湯1、2、3、4 組的高、中、低劑量組(每組15只)15組。除對照組外，其余各組大鼠左后足常規(guī)消毒后，于左后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.1 mL 制備佐劑性關節(jié)炎模型，正常組注射相應體積生理鹽水。第7 d加強一針，復制佐劑性關節(jié)炎模型。以造模后12 d左右大鼠對側足跖明顯腫脹，行動不便并且體質量明顯下降為成功的判斷標準[8]。

2.3 給藥劑量及方法

不同炮制品組方的獨活寄生湯1、2、3、4組的高、中、低劑量各給藥組于大鼠造模前3天和造模后12 d按生藥量折算[9]每日灌胃給予獨活寄生湯0.85，1.7，3.4 g/kg相應藥, 陽性對照組灌胃給予0.2 g/kg的阿司匹林片，對照組和模型組小鼠給予等容量生理鹽水，連續(xù)給藥16 d，實驗期間正常飼養(yǎng)，自由飲水。

2.4 抗炎實驗

原發(fā)性及繼發(fā)性足腫脹度測定在大鼠踝關節(jié)處做標記，用大鼠足趾容積測量儀分別測量于致炎前每只大鼠左、右后肢足容積(mL)，分別于致炎后12、24、36、48 及72 h測定大鼠致炎側足容積，測量3次，以致炎前、后致炎足容積差平均值作為原發(fā)性腫脹度。分別于致炎第12、16、20、24、28 d用同樣方法測定大鼠非致炎側足容積，求出腫脹度平均值作為繼發(fā)性足腫脹度，以觀察佐劑性關節(jié)炎大鼠原發(fā)性和繼發(fā)性病變。

2.5 免疫實驗

各組胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)、體質量增長率測定上述2.4實驗中所有大鼠于致炎后28 d，禁食不禁水12 h，稱定質量后用乙醚麻醉，取胸腺及脾臟并稱重，分別計算胸腺及脾臟指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/體質量(g)；分別記錄大鼠體質量的變化情況，計算體質量增長率。體質量增長率=(給藥后體質量-造模前體質量)/造模前體質量×100%。采用t檢驗進行組間比較。

2.6 抗炎機制實驗

2.6.1 血清TNF-α及IL-6含量測定

上述2.5實驗中所有大鼠于致炎后28d，麻醉后，迅速剖腹，腹主動脈取血5 mL，靜置，4℃離心10 min，分離血清于-20℃保存待測。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法按照試劑盒操作測定血清TNF-α及IL-6含量。采用t檢驗進行組間比較。

2.6.2 關節(jié)液PGE2含量測定

上述2.5實驗中所有大鼠于致炎后28 d，麻醉后，于左側踝關節(jié)上0.5 cm處剪下炎性腫脹足，稱重、剪碎，生理鹽水5 mL浸泡2 h，取出足爪，2 500 r/min離心浸泡液10 min，取上清液0.3 mL，加入0.5 mol/L KOH甲醇溶液1.0 mL，50℃水浴20 min異構化，加甲醇2.5 mL，在278 nrn波長下進行比色，用吸光度(A)表示PGE2含量。采用t檢驗進行組間比較。

3 結果

3.1 不同炮制品組方的獨活寄生湯對大鼠原發(fā)性病變的影響

由表1可見，與正常組相比，模型組大鼠左足明顯腫脹(P<0.01),不同炮制品組方的獨活寄生湯從致炎后6 h開始發(fā)揮療效。各組灌胃給藥后，1組的中、高劑量組，2組中、高劑量組，3組中、高劑量組，4組中劑量組均可不同程度減輕大鼠原發(fā)性病變，左后足腫脹程度均明顯輕于模型組，與模型組比較有顯著的差異(P<0.05);第4組的高劑量組、阿司匹林組減輕大鼠原發(fā)性病變的作用與模型組比較有顯著的差異(P<0.01)且強于其他各組和生品組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3.2 不同炮制品組方的獨活寄生湯對大鼠繼發(fā)性病變的影響

由表2可見，與正常組相比，模型組大鼠在致炎后16 d右后足出現(xiàn)明顯腫脹，且持續(xù)到第28 d，各不同炮制品組方的獨活寄生湯口服給藥后，1組的中、高劑量組， 2組中、高劑量組，3組中、高劑量組，4組中劑量組均可不同程度減輕大鼠繼發(fā)性病變，右后足腫脹程度均明顯輕于模型組，與模型組比較有顯著的差異(P<0.05)；第4組的高劑量組、阿司匹林組減輕大鼠繼發(fā)性病變的作用與模型組比較有顯著的差異(P<0.01)且強于其他各組和生品組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 不同炮制品組方的獨活寄生物對佐劑性關節(jié)炎大鼠原發(fā)性足跖腫脹度的影響

注:與模型組比較,**P<0.01，*P<0.05；與生品組比較,△△P<0.01，△P<0.05

表2 不同炮制品組方的獨活寄生湯對佐劑性關節(jié)炎大鼠繼發(fā)性足跖腫脹度的影響

注:與模型組比較,**P<0.01，*P<0.05；與生品組比較,△△P<0.01，△P<0.05

3.3 不同炮制品組方的獨活寄生湯對大鼠胸腺、脾臟指數(shù)和體質量增長率的影響

由表3可見，模型組大鼠的胸腺指數(shù)明顯低于正常組(P<0.05); 與對照組比較，模型組大鼠體質量明顯下降(P<0.01);各組口服給藥后，1組的中、高劑量組，2組中、高劑量組，3組中、高劑量組，4組中劑量組與模型組比較均可明顯增加大鼠胸腺系數(shù)(P<0.05)和體質量(P<0.05)。4組高劑量組可顯著增加大鼠胸腺系數(shù)和體質量，與模型組比較，有顯著差異(P<0.01)且作用強于其他各組和生品組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。脾臟系數(shù)數(shù)值上無統(tǒng)計學意義，而阿司匹林對大鼠胸腺、脾臟指數(shù)和體質量無明顯影響。

表3 對佐劑性關節(jié)炎大鼠體質量增長率和臟器系數(shù)及大鼠血清IL-6、TNF-α及關節(jié)液PGE2水平的影響

注:與模型組比較,**P<0.01，*P<0.05；與生品組比較,△△P<0.01，△P<0.05

3.4 抗炎機制實驗

不同炮制品組方的獨活寄生湯對大鼠血清 TNF-α、IL-6及關節(jié)液PGE2水平的影響

由表3可見；模型組大鼠血清TNF-α、IL-6 及關節(jié)液PGE2水平均顯著高于正常組(P<0.01); 各組口服給藥后，1組的中、高劑量組，2組中、高劑量組，3組中、高劑量組，4組中劑量組與模型組相比較，均能不同程度降低 TNF-α、IL-6、PGE 2水平(P<0.05)。其中，第4組高劑量組與模型組比較能顯著降低 TNF-α、IL-6、PGE 2且作用強于其他各組和生品組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

4 討論

佐劑性關節(jié)炎分原發(fā)性反應期和繼發(fā)性反應期，原發(fā)性病變表現(xiàn)為致炎局部的炎癥反應，繼發(fā)性病變一般出現(xiàn)于致炎后10d左右，表現(xiàn)為雙側足腫脹進行性加重，活動受限，本病乃風寒濕邪痹著日久，導致肝腎不足，氣血兩虛而成的虛實夾雜之癥[10]。獨活寄生湯在臨床上應用廣泛，為治療痹證日久方[11]。本研究選擇獨活寄生湯全方生品1、部分炮制2、3、4等4個組，選擇全方生品，就是為了對比原方經(jīng)部分藥物炮制后藥效作用是否增強，為探討炮制的必要性提供依據(jù)。

本研究結果表明，佐劑性關節(jié)炎原發(fā)性、繼發(fā)性模型組大鼠精神萎靡、反應遲鈍、足腫脹非常明顯，各不同炮制品組方的獨活寄生湯治療組隨著治療的進行，各組大鼠佐劑性關節(jié)炎癥狀均有明顯改善作用，至服藥完畢時一般體征恢復正常，由不同炮制品組方的獨活寄生湯各組均優(yōu)于生品組。且由鹽炙杜仲、酒炙牛膝、酒川芎、酒當歸、酒白芍組方的獨活寄生湯高、中劑量組能顯著抑制佐劑性關節(jié)炎大鼠原、繼發(fā)性足跖腫脹程度，對大鼠佐劑性關節(jié)炎有明顯改善作用。胸腺和脾臟是機體質量要的免疫器官，因此動物免疫功能及炎癥情況在胸腺、脾臟指數(shù)方面有一定程度的表現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，由鹽炙杜仲、酒川芎、酒炙牛膝、酒當歸、酒白芍組方的獨活寄生湯的高、中劑量組能夠顯著促進大鼠免疫器官胸腺的發(fā)育，這對于增強大鼠機體免疫機能有積極意義。TNF-α、IL-6是佐劑性關節(jié)炎大鼠模型滑膜組織的促炎因子，會刺激滑膜組織，引起PGE2及NO大量合成和釋放，從而引起炎性細胞浸潤、滑膜組織異常增生導致組織損傷、關節(jié)腫脹的一種狀態(tài)[12]。

實驗結果顯示，由酒炙牛膝和鹽炙杜仲、酒川芎、酒當歸、酒白芍組方的獨活寄生湯的高、中劑量組可明顯降低佐劑性關節(jié)炎大鼠血清TNF-α、IL-6的水平并能能顯著抑制PGE2含量，且上述抗炎、提高免疫、降低炎性細胞因子的作用均優(yōu)于不同炮制品組方的其他組。由此推測降低佐劑性關節(jié)炎大鼠血清炎性細胞因子(TNF-α、IL-6)的水平及關節(jié)液中PGE2含量可能是獨活寄生湯治療佐劑性關節(jié)炎的機制之一，其詳細機制有待于深入研究。綜合文獻報道及我們的研究，證實獨活寄生湯用于治療佐劑性大鼠關節(jié)炎癥時，組方中牛膝和川芎、當歸、白芍等藥宜用酒炙品，杜仲宜用鹽炙品，這與文獻中記載[13-15]的杜仲鹽炙能引藥入腎，增強補肝腎，強筋骨，增強免疫、擴張血管，牛膝、川芎、當歸、白芍酒炙能增強活血通絡、抗炎、止痛的作用是一致的。