針刺治療大鼠酒精戒斷焦慮征的作用機(jī)制

邢宇雙，林娜，梁?jiǎn)⒊?，楊?，吳宜艷*

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

酒精依賴不僅損害個(gè)人健康，更是家庭暴力和犯罪的重要根源。焦慮和抑郁等為代表的酒精戒斷征是酒精依賴的主要負(fù)性強(qiáng)化效應(yīng)，是酒精成癮者復(fù)飲乃至嚴(yán)重依賴的重要誘因，因此緩解和防止酒精戒斷焦慮征一直被視為治療酒精依賴的最有效手段之一[1]。

針刺作為中醫(yī)的兩大支柱之一，具有療效穩(wěn)固，操作安全簡(jiǎn)單和無成癮性等優(yōu)點(diǎn)，自古以來被廣泛用于成癮藥物的脫敏和脫毒治療。近30年以Bullock等人為代表的一些國內(nèi)外學(xué)者們通過隨機(jī)對(duì)照臨床實(shí)驗(yàn)證明了針刺療法對(duì)酒精依賴的治療效果，并觀察到針刺人體一些特定穴位顯著減輕了酒精依賴者對(duì)酒精的渴望程度，同時(shí)明顯減少了他們的飲酒次數(shù)和飲酒量，為針刺療法在酒精依賴中的應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的臨床支持[2]。2005年，Kim等人報(bào)告了針刺足三里和三陰交穴位調(diào)節(jié)大腦紋狀體和伏隔核多巴胺神經(jīng)的興奮性，抑制大鼠過度運(yùn)動(dòng)，肌肉僵硬和震顫等酒精戒斷機(jī)體癥狀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[3]。最近幾年針刺治療酒精戒斷焦慮征的研究尤其受到我國學(xué)者們的重視，2010年,張雅紅等人在國家自然基金項(xiàng)目資助下，完成了電針治療改善酒精依賴住院患者情緒的研究[4]。

在焦慮樣癥狀的產(chǎn)生以及表達(dá)中，機(jī)體常伴隨著CRH-ACTH-腎上腺內(nèi)分泌反應(yīng)軸的功能亢進(jìn)。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放(Corticotropin releasing hormone，CRH)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、自主神經(jīng)、中樞神經(jīng)和行為反應(yīng)，是機(jī)體應(yīng)答應(yīng)激刺激的重要神經(jīng)肽。第二信使環(huán)磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的效應(yīng)元件作為順勢(shì)增強(qiáng)子位于CRH基因的上游調(diào)節(jié)區(qū)，與其轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)。由此我們假設(shè)：酒精戒斷過程中，cAMP和CRH的濃度上升終產(chǎn)生焦慮。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，焦慮癥之神志不安多由臟腑功能失調(diào)、氣機(jī)失常所致, 涉及到心、肝、脾以及腎。足三里為足陽明胃經(jīng)合穴，三陰交，足三陰經(jīng)的交會(huì)穴，起到疏肝調(diào)肝、健脾化痰、補(bǔ)虛培元，對(duì)治療焦慮癥狀具有非常重要的作用。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)欲在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平觀察和證明針刺三陰交、足三里對(duì)大鼠酒精戒斷焦慮樣癥狀的治療作用，探究其作用機(jī)制，為針刺療法防治酒精復(fù)飲提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，質(zhì)量合格證號(hào)：23001700000704。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，溫度(22.0±2.0)℃，食物和水供應(yīng)充足。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

cAMP酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所；CRH酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

針刺針(華佗牌)：廣州得源醫(yī)療器械有限公司； 電針儀(BT701-1B)：上海華誼醫(yī)用儀器有限公司； 旋渦混合器(XH-D)：上海比朗儀器有限公司；高架十字迷宮：上海欣軟信息科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；酶標(biāo)儀(M3)：MolecularDevices。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、酒精成癮模型的建立及治療

選取健康SD大鼠54只，隨機(jī)分為空白組(生理鹽水)，模型組(20%Eth)，電針兩穴組(20%Eth+電針單側(cè)足三里、三陰交)，針刺兩穴組(20%Eth+針刺單側(cè)足三里、三陰交)，三陰交組(20%Eth+針刺單側(cè)三陰交)，足三里組(20%Eth+針刺單側(cè)足三里)。除空白組外，其余5組每天腹腔內(nèi)注射20%(w/v)酒精1.5 mL/100 g，共28 d，制備酒精成癮模型[5]，撤酒精3 d，制備酒精戒斷焦慮征模型，撤酒精期間分別針刺相應(yīng)的穴位進(jìn)行治療，治療前先將大鼠固定在自制的綁鼠臺(tái)上，用酒精進(jìn)行消毒，電針兩穴組進(jìn)行治療時(shí)，針刺單側(cè)足三里、三陰交，針柄接上電針儀，選用疏密波，頻率為15/25 Hz，電流為1～2 mA，刺激的強(qiáng)度以大鼠被針刺側(cè)的下肢輕微顫抖為度。每天進(jìn)行1次，每次針刺30 min，連續(xù)治療3 d，空白組和模型組在相同的時(shí)間進(jìn)行與針刺組相同的固定，但不進(jìn)行針刺治療。

2.2 行為學(xué)指標(biāo)測(cè)試

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)光線昏暗并保持恒亮，室溫24℃，保持安靜。將每只大鼠置于高空十字架(EPM)的正中央釋放，每只大鼠測(cè)試時(shí)間為5 min。每一只動(dòng)物完成測(cè)試后，清理糞便，并對(duì)裝置用酒精進(jìn)行徹底清潔消毒。

測(cè)試指標(biāo)：進(jìn)入到開放臂次數(shù)(OE)：即進(jìn)入到任一開放臂的次數(shù)，以大鼠4個(gè)爪均進(jìn)入到臂內(nèi)開始，中途有1個(gè)爪從該臂中完全撤出，視為該次進(jìn)入活動(dòng)完成；進(jìn)入到開放臂時(shí)間(OT)：進(jìn)入到開放臂停留的時(shí)間，單位：秒(s)；進(jìn)入到閉合臂次數(shù)(CE)：即進(jìn)入到任一閉合臂的次數(shù)，以大鼠4個(gè)爪均進(jìn)入到臂內(nèi)開始，中途有1個(gè)爪從該臂中完全撤出，視為該次進(jìn)入活動(dòng)完成；進(jìn)入到閉合臂時(shí)間(CT)，進(jìn)入到閉合臂停留的時(shí)間，單位：秒(s)。由以上指標(biāo)分別計(jì)算出：①進(jìn)開放臂次數(shù)比例OE%=OE/(OE+CE)×100%；②開放臂停留時(shí)間比例OT%=OT/(OT+CT)×100%

2.3 ELISA測(cè)CRH、cAMP濃度

所有大鼠都完成高架十字迷宮(EPM)測(cè)試后，立即將每只大鼠斷頭處死，剪開顱蓋和腦膜，剝離組織后，將大腦放在冰盤上，迅速取出左右兩側(cè)海馬，稱重后，立刻放入-80℃的液氮中保存，之后轉(zhuǎn)移到-80℃低溫冰箱里存放。將試劑盒在室溫下平衡半小時(shí)。配置標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，濃度分別為480、240、120、60、30 nmol/L。取海馬，勻漿，離心，取上清，待測(cè)?？瞻卓撞患訕?，只加顯色劑A、B和終止液用于調(diào)零；標(biāo)準(zhǔn)品孔，每孔加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，零孔加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液50 μL，然后加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)試劑50 μL；樣品孔，加入樣品50 μL，然后加入HRP試劑50 μL。輕輕搖晃，蓋上封板膜，37℃培養(yǎng)箱中孵育60 min。洗滌5次，拍干。在每個(gè)孔內(nèi)先加入顯色劑A 50 μL，隨后加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩以混勻，37℃下避光顯色，顯色10 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光值(OD值)。測(cè)定在加入終止液后的10 min內(nèi)進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 針刺治療對(duì)大鼠OE%和OT%的影響

在高架十字迷宮測(cè)試中，與空白對(duì)照組相比，酒精戒斷大鼠在開放臂的逗留次數(shù)和時(shí)間明顯減少；與模型組相比，電針兩穴治療后可顯著增加在開放臂停留的次數(shù)、時(shí)間，針刺兩穴組能增加其逗留次數(shù)，而單穴位治療組作用效果不明顯。結(jié)果見表1。

表1 針刺對(duì)EPM大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)比(OE%)、開放臂停留時(shí)間比(OT%)的影響

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.01

3.2 ELISA 檢測(cè)cAMP結(jié)果比較

與空白組相比較，酒精成癮大鼠海馬中cAMP的濃度明顯升高，與模型組相比，電針兩穴組和針刺兩穴組能顯著的降低cAMP的濃度，單穴位治療組降低cAMP的趨勢(shì)不明顯。結(jié)果見表2。

表2 針刺對(duì)酒精戒斷大鼠cAMP濃度的影響

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

3.3 ELISA檢測(cè)CRH結(jié)果比較

與空白組相比，酒精成癮大鼠的海馬中CRH的濃度顯著升高，與模型組相比較，電針兩穴組與針刺兩穴組經(jīng)治療可明顯降低海馬中CRH的濃度，三陰交組和足三里組降低CRH濃度的趨勢(shì)不明顯。結(jié)果見表3。

表3 針刺對(duì)酒精戒斷大鼠CRH濃度的影響

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

4 討論

焦慮征大多是因?yàn)榕K腑功能失調(diào)、氣機(jī)失常而導(dǎo)致神志不安，足三里是足陽明胃經(jīng)合穴，三陰交是肝、腎、脾經(jīng)的交會(huì)穴，這兩個(gè)穴位既能調(diào)節(jié)所屬臟腑的經(jīng)氣，同時(shí)又針對(duì)了焦慮征的病理特點(diǎn)進(jìn)行治療。近年來，三陰交、足三里作為治療焦慮征的主要穴位，受到廣大學(xué)者的關(guān)注。有實(shí)驗(yàn)證明，電針三陰交可緩解自然更年期大鼠的焦慮行為[6]，針刺足三里可減輕海洛因戒斷后所產(chǎn)生的焦慮癥狀，且療效穩(wěn)定[7]。本實(shí)驗(yàn)中，我們選取了三陰交和足三里進(jìn)行針刺治療，觀察到通過同時(shí)針刺這兩個(gè)穴位可明顯緩解酒精戒斷所產(chǎn)生的焦慮癥狀，由此我們猜測(cè)針刺這兩個(gè)穴位可能存在相互作用而使治療效果得到加強(qiáng)。單穴位的治療效果并未如相關(guān)文獻(xiàn)中所了解的那么顯著，這可能是由于針刺的天數(shù)和時(shí)長(zhǎng)不同所導(dǎo)致。電針療法是應(yīng)用電針儀輸出脈沖電流，通過毫針作用于經(jīng)絡(luò)穴位以達(dá)到治療疾病目的的一種方法，它將毫針的刺激和電生理的效應(yīng)相結(jié)合，這種方法不僅可以提高針刺的治療效果，同時(shí)還增加了針刺的治療范圍，加強(qiáng)了針刺疏通經(jīng)絡(luò)的作用[8]。有文獻(xiàn)報(bào)道[9]，電針治療焦慮征的效果與抗焦慮藥物的治療效果相當(dāng)，且避免了藥物所帶來的依賴性等副作用。在本研究中，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了電針療法較普通針刺確有更好的療效。

大量的研究結(jié)果顯示，當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)外環(huán)境的刺激時(shí)，應(yīng)激反應(yīng)會(huì)表現(xiàn)出一系列的神經(jīng)內(nèi)分泌物質(zhì)的變化，主要表現(xiàn)為HPA軸的興奮。下丘腦室旁核是HPA-神經(jīng)內(nèi)分泌軸的中樞位點(diǎn)，CRH則是HPA軸激活的關(guān)鍵性物質(zhì)。適量的CRH的增多可使機(jī)體處于興奮的狀態(tài)，但CRH的含量過高時(shí)，則可引起適應(yīng)性的機(jī)制障礙，進(jìn)而引發(fā)多種癥狀的發(fā)生，其中包括焦慮、抑郁等。有研究表明，在應(yīng)激刺激下，CRH的濃度以及CRH mRNA的表達(dá)均顯著增加[10]。在焦慮癥狀中所觀察到的激素含量的變化主要是由CRH的過度分泌所導(dǎo)致[11]。新近研究表明，CRH的受體拮抗劑可作為抗焦慮以及抗抑郁的神經(jīng)藥理學(xué)治療方法[12]。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們也觀察到，酒精戒斷焦慮征大鼠的海馬中CRH的濃度較空白組大鼠均增加，經(jīng)針刺治療后，其數(shù)值又下降至正常水平，由此證實(shí)了，CRH在焦慮的發(fā)生中占有重要的地位。

焦慮征受多種基因和多種環(huán)境因素的調(diào)控，目前發(fā)現(xiàn)其可能通過一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控。有研究表明，與G蛋白相偶聯(lián)的cAMP信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常與焦慮密切相關(guān)，這一論證從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得到了證實(shí)，酒精戒斷大鼠的cAMP的濃度升高，針刺治療后得到緩解。cAMP是體內(nèi)比較重要的第二信使，它對(duì)多種神經(jīng)遞質(zhì)的功能發(fā)揮起調(diào)節(jié)作用。近年來，有大量的研究結(jié)果證實(shí)，cAMP依賴的PKA信號(hào)通路在酒精依賴的形成過程中具有重要的作用。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)作為PKA重要的下游信號(hào)蛋白，在藥物的成癮中也起著尤為重要的作用，因此，近年，CREB在酒精成癮的相關(guān)研究中成為又一備受關(guān)注的研究熱點(diǎn)。CREB 通過結(jié)合 cAMP效應(yīng)元件(CRE)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，CRE是在各種基因調(diào)節(jié)區(qū)域中的順式增強(qiáng)子，CRH基因的上游調(diào)節(jié)區(qū)中存在CRE序列，而且已經(jīng)證實(shí)，CRE的功能與CRH的轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)，由此為我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供證據(jù)：針刺抗焦慮的作用可能通過調(diào)節(jié)cAMP-CRH相互作用，終使酒精戒斷焦慮征得到緩解。同時(shí)由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了cAMP、CRH之間可能確存在某種聯(lián)系，共同調(diào)節(jié)酒精戒斷焦慮征的發(fā)生。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)探究了針刺可緩解酒精戒斷期間的焦慮樣行為，初步證實(shí)針刺可能通過cAMP-CRH相互作用來緩解酒精戒斷焦慮樣癥狀，為針刺療法開發(fā)成為防治酒精復(fù)飲的有效治療手段提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，也為綜合利用中醫(yī)療法治療其他毒品成癮提供強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)支持。