鹽酸小檗堿聯(lián)合甘草酸二銨對非酒精性脂肪性肝病患者Th17/Treg細(xì)胞失衡及腸道菌群的影響

黃佩佩 胡云明 吳建勝

非酒精性脂肪性肝病以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕±硖卣鳎◤膯渭兏沃咀冃缘椒蔷凭灾拘愿窝祝恍┗颊咦罱K可演變?yōu)楦斡不踔粮渭?xì)胞癌[1]。據(jù)報道一般人群的非酒精性脂肪性肝病發(fā)生率為10%～16%，而在肥胖患者中發(fā)生率高達(dá)38%，近年來隨著人們工作壓力的增加，飲食、生活習(xí)慣不規(guī)律，非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生率呈逐年上升趨勢[2]。目前臨床對非酒精性脂肪性肝病尚缺乏特效治療藥物，治療方法主要是改變患者的生活方式、減輕體質(zhì)量等[3]。鹽酸小檗堿片是從中藥黃連根莖中提取的主要生物堿，對糖尿病、高脂血癥、肥胖癥等代謝綜合征起到了防治療效，也是一種治療非酒精性脂肪性肝病的藥物。甘草酸二銨腸溶膠囊能夠促進非酒精性脂肪性肝病患者的糖脂代謝好轉(zhuǎn)，有抗炎、改善胰島素抵抗以及保護肝細(xì)胞等作用[5]。然而目前采取水飛薊賓膠囊聯(lián)合鹽酸小檗堿片治療非酒精性脂肪性肝病的研究鮮見報道。非酒精性脂肪性肝病是一種多因素作用所導(dǎo)致的臨床病理綜合征，免疫功能失衡和腸道菌群紊亂在該病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[6,7]?；诖?，本研究選取溫州醫(yī)科大學(xué)附屬樂清醫(yī)院2017年2月～2018年8月收治的104例病例作為研究對象，觀察鹽酸小檗堿片聯(lián)合甘草酸二銨腸溶膠囊治療非酒精性脂肪性肝病的治療效果，并探討其對調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Treg)/輔助性T細(xì)胞17(Th17)平衡以及腸道菌群的影響。

對象與方法

1.研究對象: 104例非酒精性脂肪性肝病患者來源于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬樂清醫(yī)院2017年2月～2018年8月收治病例，非酒精性脂肪性肝病診斷參照《中國非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010 年修訂版)》擬定[8]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合非酒精性脂肪性肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)者；②患者年齡20～65歲；③丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)異常升高≥4周；④近1個月內(nèi)未給予相關(guān)藥物治療；⑤患者自愿參加，且簽署知情協(xié)議。排除標(biāo)準(zhǔn)：①飲酒史或乙醇量女性每周>70克/周，男性>140克/周；②伴病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝病、肝豆?fàn)詈俗冃圆〉绕渌尾?③對本研究藥物過敏者；④合并心腦血管、腎臟、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾??；⑤患精神疾病者。兩組治療過程中均未出現(xiàn)脫落病例，將104例患者按數(shù)字表法隨機分為對照組和觀察組，每組各52例。對照組男性31例，女性21例，年齡44～62歲，平均年齡55.17±7.12歲，病程3～7年，平均病程5.11±0.71年，體重指數(shù)25.15±3.04kg/m2；并發(fā)癥：2型糖尿病8例，高血壓15例，高脂血癥19例。觀察組男性33例，女性19例，患者年齡46～61歲，平均年齡55.39±7.04歲，病程2.5～7.0年，平均病程5.01±0.67年，體重指數(shù)25.09±3.04kg/m2；并發(fā)癥：2型糖尿病7例，高血壓13例，高脂血癥18例。上述基本臨床資料兩組患者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2.方法：(1)基礎(chǔ)治療：依據(jù)指南[8]給予非藥物干預(yù)措施。包括對患者進行健康教育；平衡膳食，控制體重；注意休息，適當(dāng)有氧運動(每周>4次，每次>30min)。對照組：采取甘草酸二銨腸溶膠囊(正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，批準(zhǔn)文號H20040628)，口服，3粒/次，3次/天。觀察組：在對照組治療基礎(chǔ)上給予鹽酸小檗堿片(南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司，批準(zhǔn)文號H32023081)，口服1～3片/次，3次/天。兩組療程均為12周。

3.觀察指標(biāo)：(1)肝功能：采取全自動生化分析儀(AU5800，美國Beckman Coulter公司)測定患者的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)以及谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)，在治療前及治療12周后各測1次。(2)血脂:采取全自動生化分析儀(AU5800，美國Beckman Coulter公司)檢測患者的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)以及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，在治療前及治療12周后各測1次。(3)兩組外周血輔助性T細(xì)胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)水平:清晨空腹下抽取患者的外周血3ml左右，常規(guī)離心后將其加入磷酸鹽緩沖液洗滌，制備細(xì)胞懸液；采取流式細(xì)胞儀(FC-500型，美國Beckman Coulter公司)在治療前及治療12周后測定，其中Th17細(xì)胞為CD4+白細(xì)胞介素(IL)-17+，Treg細(xì)胞為CD 4+CD25+CD127lowTreg。(4)兩組腸道菌群測定:標(biāo)本取樣：在治療前及治療結(jié)束后留取患者的自然排便新鮮糞便中段0.5g，置于樣本袋存于-4℃冰箱。標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA提取：取雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、腸球菌凍干粉各0.2g，溶解于磷酸緩沖液溶液中，采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA，采用紫外分光光度計定量，進行10倍稀釋，采用系統(tǒng)軟件分析循環(huán)閾值(Ct)，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算標(biāo)準(zhǔn)品PCR片段拷貝數(shù)。樣本細(xì)菌DNA提取、16SrDNA定量PCR：糞便樣本融凍，取0.2g以磷酸鹽緩沖液處理，1000r/min離心10min，取上清200μl，同標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA提取法提取樣本細(xì)菌DNA，以標(biāo)準(zhǔn)菌株16SrDNA V3區(qū)為PCR靶基因，采用Primer Premier 6.0引物設(shè)計軟件設(shè)計PCR引物，對樣本細(xì)菌DNA提取液施行PCR反應(yīng)，生成樣本細(xì)菌Ct值，計算樣本拷貝數(shù)。(5)療效評定標(biāo)準(zhǔn)[9]:根據(jù)患者的肝臟酶學(xué)改變制定。臨床控制：肝臟酶學(xué)恢復(fù)正常；顯效：肝臟酶學(xué)指標(biāo)降低≥50%；有效：肝臟酶學(xué)指標(biāo)降低<50%但≥30%；無效：肝臟酶學(xué)指標(biāo)降低<30%?？傆行?%)=(臨床控制+顯效+有效)人數(shù)/各組人數(shù)。

結(jié) 果

1.兩組肝功能比較：治療12周后，兩組患者肝功能AST、ALT、GGT水平明顯降低(P<0.01)；且觀察組治療后AST、ALT、GGT水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見表1。

表1 兩組肝功能比較

2.兩組LDL-C、TC、TG、HDL-C比較：治療12周后，兩組HDL-C明顯升高，LDL-C、TC和TG明顯降低(P<0.01)；且觀察組患者治療12周后 LDL-C、TC和TG少于對照組，HDL-C高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見表2。

表2 兩組LDL-C、TC、TG、 HDL-C比較

3.兩組肝臟酶學(xué)療效比較：治療12周后，觀察組總有效率為94.23%，顯著多于對照組(76.92%,χ2=4.986，P<0.05)，詳見表3。

表3 兩組肝臟酶學(xué)療效比較[n(%)]

4.兩組外周血Th17和Treg細(xì)胞水平比較：治療12周后，兩組患者外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞以及Treg/Th17比值顯著減少(P<0.01)；且觀察組治療12周后外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞以及Treg/Th17比值少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見表4。

表4 兩組外周血Th17和Treg細(xì)胞水平比較

5.兩組腸道菌群比較：治療12周后，兩組患者的雙歧桿菌、乳酸桿菌水平顯著升高，大腸桿菌明顯減少(P<0.01)，且觀察組患者的雙歧桿菌、乳酸桿菌顯著高于對照組，大腸桿菌明顯低于對照組(P<0.01)；兩組治療前腸球菌水平變化比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表5。

表5 兩組腸道菌群比較拷貝數(shù)/克)

討 論

非酒精性脂肪性肝病是臨床常見慢性肝病之一，患者常合并代謝綜合征，與胰島素抵抗、肥胖、遺傳易感等密切相關(guān)，但其發(fā)病機制尚待闡明。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)普遍認(rèn)為“二次打擊”學(xué)說是非酒精性脂肪性肝病發(fā)生、發(fā)展的主要機制之一，初次打擊為脂質(zhì)代謝紊亂和胰島素抵抗導(dǎo)致體內(nèi)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積形成單純性脂肪肝；第2次打擊為多種因素誘發(fā)氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化損害，從而損傷肝臟以及導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死，形成脂肪性肝炎[10,11]。

鹽酸小檗堿通過興奮胰島素受體mRNA轉(zhuǎn)錄以及蛋白激酶C依賴激活啟動子增加胰島素受體基因表達(dá)，促進胰島素受體的生成，進而增加胰島素的敏感度；同時也通過抑制線粒體和激活腺苷酸活化蛋白激酶，下調(diào)肝糖異生基因以及脂肪合成基因，調(diào)節(jié)異常脂質(zhì)代謝，達(dá)到降血脂、血糖的作用[12,13]。甘草酸二銨腸溶膠囊為甘草酸二胺和磷脂酰膽堿的新型復(fù)合物，甘草酸二胺有較強的抗炎、保護肝細(xì)胞及改善肝功能的作用；磷脂與肝細(xì)胞膜有較高的親和性，可維持細(xì)胞膜的流動性、保護肝細(xì)胞膜，磷脂中的膽堿對脂肪有一定的親和力，可有效降低血清甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇[14]。甘草酸二銨與磷脂結(jié)合以后，脂溶性明顯增高，生物利用度也明顯增加，產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，臨床可用于治療急、慢性病毒性肝炎等所引起的肝功能異常，亦能降低非酒精性脂肪性肝病患者的轉(zhuǎn)氨酶及血脂升高[15]。

本研究結(jié)果顯示，治療12周后，觀察組治療后AST、ALT、GGT水平以及LDL、TC和TG低于對照組，HDL-C高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示鹽酸小檗堿片聯(lián)合甘草酸二銨腸溶膠囊治療非酒精性脂肪性肝病可促進患者肝功能和血脂水平好轉(zhuǎn)。治療12周后療效統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，觀察組總有效率為94.23%，顯著多于對照組(76.92%)，說明鹽酸小檗堿片聯(lián)合甘草酸二銨腸溶膠囊治療非酒精性脂肪性肝病的療效更佳，值得臨床借鑒。

非酒精性脂肪性肝病的“二次打擊”學(xué)說認(rèn)為免疫系統(tǒng)激活是第2次打擊的主要參與因素之一，其中免疫微環(huán)境的改變是其重要病理特征，與免疫炎性細(xì)胞因子失衡有關(guān)[16]。Th17細(xì)胞均為CD4+淋巴細(xì)胞亞群，其主要分泌或誘導(dǎo)白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子-α 等促炎性細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎性反應(yīng)，造成肝組織損害[8]。Treg細(xì)胞也是CD4+淋巴細(xì)胞亞群之一，可通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β以及細(xì)胞直接接觸，并作為抗原呈遞細(xì)胞的各種免疫細(xì)胞發(fā)揮直接作用，促進肝臟發(fā)生纖維化[17]。Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞相互作用，在生理狀態(tài)下保持平衡以維持機體免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。唐濤等[18]研究發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪性肝病患者外周血中Th17和Treg細(xì)胞在T 淋巴細(xì)胞中的比例均顯著升高并且Th17/Treg的比例也明顯增加，與胰島素抵抗存在一定的相互作用，參與了非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究觀察組外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞以及Treg/Th17比值明顯少于對照組，提示鹽酸小檗堿片聯(lián)合甘草酸二銨腸溶膠囊可能通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞對非酒精性脂肪性肝病起到一定治療作用。

腸道與肝臟在結(jié)構(gòu)與功能上存在解剖學(xué)、病理生理聯(lián)系，腸道菌群的紊亂是非酒精性脂肪性肝病的病理機制之一。腸道有害細(xì)菌過多及益生菌減少，引起有害代謝物質(zhì)產(chǎn)生過多，并進入肝臟導(dǎo)致肝臟炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等，形成肝脂肪變性和纖維化；肝臟疾病患者的腸道菌群營養(yǎng)底物、膽汁分泌以及腸道內(nèi)膽鹽不足，門靜脈回流受阻，導(dǎo)致胃腸道淤血內(nèi)積，肝臟分泌大量炎性因子，加重腸道菌群失衡[19]。易艷容等[20]研究顯示，非酒精性脂肪性肝病患者的腸道有益菌雙歧桿菌及乳桿菌數(shù)量顯減少，有害菌腸桿菌和腸葡萄球菌數(shù)量明顯增加，使腸源性內(nèi)毒素增多，引起炎性介質(zhì)的大量釋放，進一步損害肝細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，觀察組的雙歧桿菌、乳酸桿菌顯著高于對照組，大腸桿菌明顯低于對照組。朱超霞等[21]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可能通過改善腸道菌群的結(jié)構(gòu)和減輕高脂飲食所致腸道黏膜損傷，對高脂飲食所誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病發(fā)揮治療作用。提示鹽酸小檗堿片聯(lián)合甘草酸二銨腸溶膠囊通過調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂可能是其治療非酒精性脂肪性肝病的有效途徑之一。

綜上所述，鹽酸小檗堿片聯(lián)合甘草酸二銨腸溶膠囊治療非酒精性脂肪性肝病可促進患者肝功能和血脂水平的改善，提高療效，調(diào)節(jié)Th17Treg細(xì)胞失衡和改善腸道菌群紊亂可能與上述治療效果有關(guān)。