外周血成纖維細(xì)胞激活蛋白表達(dá)水平在冠心病診斷中的作用及臨床意義

陳 濤 孟祥平 余 明 張 歡 范穌圳 蔣學(xué)俊 徐 林

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease，CAD)是一類以動(dòng)脈粥樣硬化為基礎(chǔ)的慢性炎性疾病，依據(jù)血管內(nèi)斑塊情況及患者臨床表現(xiàn)等可以分為穩(wěn)定性冠心病(stable coronary artery disease, SCAD)、急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)兩大類。近年來(lái)，ACS的發(fā)生率明顯增高，ACS及其遠(yuǎn)期并發(fā)癥(如心力衰竭、惡性心律失常等)已成為發(fā)達(dá)國(guó)家人群死亡的主要原因。臨床實(shí)踐中，早期血運(yùn)重建是公認(rèn)治療ACS的有效手段，但在冠狀動(dòng)脈斑塊破裂導(dǎo)致狹窄甚至閉塞過(guò)程中，心肌缺血持續(xù)存在的，心肌損傷是不斷進(jìn)展的，而嚴(yán)重缺血造成的心肌損傷不可逆轉(zhuǎn)[1]。因此，ACS的快速診斷方法、ACS確診后如何判斷心肌損傷程度及ACS患者預(yù)后評(píng)估仍是臨床研究的重點(diǎn)。

成纖維細(xì)胞激活蛋白(fibroblast activation protein，F(xiàn)AP)是一種具有二肽酶和Ⅰ型膠原酶活性的跨膜蛋白，最早因其大量表達(dá)于成纖維細(xì)胞膜表面而得名。除明膠和Ⅰ型膠原纖維外，其底物還包括α2-抗纖溶酶、B型利鈉肽、Y型神經(jīng)肽、P物質(zhì)等多種神經(jīng)肽[2～4]。研究表明，F(xiàn)AP的升高與胚胎形成、癌癥、特發(fā)性肺纖維化、肝硬化、愈合傷口和關(guān)節(jié)炎中間充質(zhì)組織的活性重塑有關(guān)[5]。國(guó)外研究也發(fā)現(xiàn)在心肌梗死后活化的心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中均有FAP的表達(dá)，在外周血中以非膜上的可溶性FAP(soluble FAP，sFAP)形式循環(huán)[2，6～8]。因此，本研究旨在研究外周血FAP(circulating FAP，cFAP)在不同類型冠心病患者中的表達(dá)情況及其相關(guān)性，并進(jìn)一步探討cFAP作為ACS快速診斷、心肌損傷程度判斷及疾病預(yù)后評(píng)估指標(biāo)的可行性，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

1.研究對(duì)象:經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。選取2018年6～12月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科住院并確診的 CAD 患者109例，其中SCAD組22例，ACS組87例，包括不穩(wěn)定型心絞痛(UA)26例，非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)16例，ST段抬高型心肌梗死(STEMI)45例。另選取同時(shí)期就診于筆者醫(yī)院的排除冠心病診斷的體檢者26例作為對(duì)照組。受試者的分類依據(jù)為WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)和我國(guó)冠心病分類標(biāo)準(zhǔn)，所有受試者均排除伴有感染性疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病(活動(dòng)期)、肝腎功能不全、惡性腫瘤、慢性阻塞性肺疾病、甲狀腺疾病等。同時(shí)收集患者一般臨床資料，包括性別、年齡、心率、吸煙史、飲酒史、糖尿病病史、高血壓病史、高脂血癥病史等。

2.研究方法：(1)標(biāo)本采集：所有受試者于入院當(dāng)天采集靜脈血5ml置于EDTA-K2抗凝管中，采集4ml置于無(wú)抗凝劑的紅頭管中，所有血標(biāo)本3000r/min離心10min，分離上清液并置于-20 ℃冰箱保存待測(cè)。(2)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo):采用全自動(dòng)血液分析儀(日本Sysmex公司，型號(hào)：XE-2100)檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞比率(NEU%)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)；采用西門子ADIVA2400全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇(Tch)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平；采用西門子ADVIA Centaur XP全自動(dòng)免疫分析檢測(cè)超敏肌鈣蛋白(ultra-TnI)。(3)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測(cè)cFAP：檢測(cè)標(biāo)本中的cFAP表達(dá)水平前將凍存標(biāo)本在室溫下放置2h，后應(yīng)用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自武漢大風(fēng)生物科技有限公司(編號(hào)：ab193701)，并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的資料兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；不符合正態(tài)分布的資料進(jìn)行非參數(shù)U檢驗(yàn)。利用受試者工作曲線(ROC)，對(duì)cFAP表達(dá)水平對(duì)不同類型冠心病的診斷進(jìn)行特異性和敏感度分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.3組患者一般臨床資料比較:3組患者的一般情況(性別、年齡、心率)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，ACS組吸煙史陽(yáng)性率、飲酒史陽(yáng)性率、高血壓病史陽(yáng)性率均高于對(duì)照組(P<0.05)；與SCAD組比較，ACS組吸煙史陽(yáng)性率更高(P<0.01)。3組患者糖尿病陽(yáng)性率、高脂血癥發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 3組患者一般臨床資料比較

2.3組患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)、cFAP表達(dá)水平比較:ACS組與對(duì)照組比較，白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比率、hs-CRP、ultra-TnI升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與SCAD組比較，白細(xì)胞計(jì)數(shù)、ultra-TnI升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3組患者間各項(xiàng)血脂水平(包括Tch、TG、HDL-C、LDL-C)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ACS組的cFAP表達(dá)水平(69.28±21.33ng/ml)顯著低于對(duì)照組(108.31±26.56ng/ml)及SCAD組(99.63±24.43ng/ml)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),對(duì)照組與SCAD組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表2)。

表2 3組患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)、cFAP比較

3.cFAP在CAD患者中的診斷價(jià)值:應(yīng)用ROC曲線模型分析，顯示cFAP的AUC為0.85(95%CI:0.78～0.92，P<0.05), 敏感度為79.2%，特異性為78.4%,提示cFAP表達(dá)水平的測(cè)定在排除ACS診斷中有一定的臨床價(jià)值(圖1)。

討 論

CAD是一種以動(dòng)脈粥樣硬化為病理基礎(chǔ)的典型慢性炎性疾病，其中冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜損傷是其始發(fā)因素，繼而由于機(jī)體血脂代謝紊亂，損傷處發(fā)生脂質(zhì)沉積，血管平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell，SMC)異常移行、增殖并形成纖維帽，此過(guò)程中伴有大量淋巴細(xì)胞、單核-吞噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[9]。CAD是心血管系統(tǒng)的高發(fā)疾病之一，隨著人群生活習(xí)慣的改變，其亞型之一的ACS發(fā)生率逐年增高，且愈顯年輕化，即便在各類冠脈血運(yùn)重建技術(shù)日益發(fā)展的今天，ACS患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)也依舊居高不下，因此ACS的早期識(shí)別十分重要。

FAP最早被發(fā)現(xiàn)為一種細(xì)胞表面糖蛋白，含有由絲氨酸蛋白酶的催化結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和短細(xì)胞質(zhì)尾組成的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，與二肽酶4 (DPPIV)屬于同科酶蛋白，除了二肽酶活性，還具有Ⅰ型膠原酶活性，能夠降解基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteases, MMPs)預(yù)裂解后的Ⅰ型膠原纖維，而Ⅰ型膠原纖維是各類組織細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的主要成分[10]。

既往研究表明，F(xiàn)AP富含于胚胎時(shí)期的間充質(zhì)組織，成年后其表達(dá)水平逐漸下降，但當(dāng)機(jī)體發(fā)生慢性炎癥、纖維化、傷口愈合等組織損傷、修復(fù)過(guò)程時(shí)，會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)組織的ECM重構(gòu)，組織中成纖維細(xì)胞(fibroblast，F(xiàn)b)活化，F(xiàn)AP表達(dá)升高，表明FAP與各類組織的纖維化存在相關(guān)性，這一觀點(diǎn)在腫瘤相關(guān)纖維化、肝纖維化及肺臟相關(guān)纖維化等相關(guān)研究中均已得到證實(shí)，F(xiàn)AP可作為一種纖維化標(biāo)志物用于評(píng)估相關(guān)疾病的纖維化程度[11～13]。而FAP本身具有降解膠原纖維的作用，這一點(diǎn)正是目前逆轉(zhuǎn)纖維化研究應(yīng)用的關(guān)鍵原理。Egger等[14]利用FAP抑制劑PT100治療小鼠肺纖維化模型，確證其抗纖維化作用。心肌梗死(myocardial infarction，MI)后，cFs大量增殖并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，沉積大量ECM蛋白以維持梗死心室的結(jié)構(gòu)完整性。Nagaraju等[15]在豬心肌梗死模型中發(fā)現(xiàn),梗死區(qū)近端較遠(yuǎn)端比較，間質(zhì)和血管周圍纖維化明顯、Ⅰ型膠原纖維沉積。其中涉及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)通過(guò)經(jīng)典的SMAD2/3信號(hào)調(diào)節(jié)cFs的增殖，且在梗死的心肌中,CFs可能會(huì)對(duì)活性氧和白細(xì)胞介素-1的刺激產(chǎn)生反應(yīng)，獲得一種促炎的表型，作為趨化因子和細(xì)胞因子的重要來(lái)源，更促進(jìn)CFs的增殖，CFs的增殖激活可致FAP表達(dá)增加[15,16]。

在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，Ⅰ型膠原約占ECM 的70%，已知在晚期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，纖維帽的變薄、破裂是ACS啟動(dòng)的關(guān)鍵，其中涉及的主要機(jī)制為血管的平滑肌細(xì)胞(SMC)的丟失與纖維帽中Ⅰ型膠原纖維的降解[17]。Brokopp等[7]發(fā)現(xiàn)FAP介導(dǎo)的膠原降解是由炎性信號(hào)誘導(dǎo)的，在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，F(xiàn)AP表達(dá)顯著增加并與MMPs協(xié)同作用降解粥樣硬化斑塊中的Ⅰ型膠原纖維，使得薄纖維帽型動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的Ⅰ型膠原纖維降解后斑塊穩(wěn)定性大大下降，更易破裂。在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中，二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase，DPPⅣ)抑制劑的使用可以減傷斑塊面積，增加膠原纖維的合成，使斑塊趨于穩(wěn)定，提示屬于同科酶蛋白的FAP同樣具備這方面的作用[18]。

本研究結(jié)果顯示，ACS組cFAP表達(dá)水平明顯低于SCAD組及對(duì)照組，這有別于既往研究中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、MI后心肌缺血部位的組織中FAP的高表達(dá)。解釋血清中檢測(cè)到cFAP的原因可能是由損傷部位的心肌組織釋放的，此過(guò)程涉及相應(yīng)區(qū)域的心肌細(xì)胞一定時(shí)間的缺血、缺氧后壞死致胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)釋放[4]。本實(shí)驗(yàn)中用于檢測(cè)的血液標(biāo)本是患者入院當(dāng)天采集的，此時(shí)可能僅有部分心肌細(xì)胞死亡、裂解，而大部分心肌細(xì)胞仍僅處于缺血階段。ACS患者cFAP濃度低可能反映的是在ACS事件發(fā)生前，ACS患者的cFAP水平處于一種低濃度穩(wěn)定狀態(tài)，可能是由于此時(shí)各類細(xì)胞向外分泌的FAP減少。cFAP隨血液循環(huán)可能流經(jīng)、聚集于局部損傷組織，參與組織損傷后的修復(fù)，促進(jìn)膠原蛋白降解；且心肌損傷后，為挽救損傷心肌，創(chuàng)傷愈合反應(yīng)中釋放的各類酶可能會(huì)降解cFAP，使得cFAP水平下降。據(jù)此，筆者猜想在ACS發(fā)生更長(zhǎng)的時(shí)間后，cFAP的水平可能逐日增加至受損心肌完全修復(fù)。本研究還發(fā)現(xiàn)，cFAP表達(dá)水平與 WBC計(jì)數(shù)、NEU%、hs-CRP以及ultra-cTnI呈負(fù)相關(guān)，而WBC、NEU%、hs-CRP以及ultra-cTnI作為臨床上常用的炎性反應(yīng)及心肌損傷的指標(biāo)，可能提示cFAP與此有關(guān)，一定程度上可以用于評(píng)估患者的預(yù)后。

綜上所述，F(xiàn)AP可以作為炎性疾病及纖維化相關(guān)疾病的診斷標(biāo)志物，也用于心臟纖維化程度及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的評(píng)估指標(biāo)。在外周血中檢測(cè)cFAP的難度遠(yuǎn)低于檢測(cè)相應(yīng)臟器組織中FAP的表達(dá)，大大提升了FAP檢測(cè)在臨床中應(yīng)用、推廣的可行性。對(duì)ACS患者來(lái)說(shuō)，cFAP的檢測(cè)可用于CAD患者中ACS的排除診斷，聯(lián)合WBC、NEU%、hs-CRP以及ultra-cTnI等指標(biāo)，可以在一定程度上反映炎性反應(yīng)強(qiáng)弱及心肌損傷程度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)患者疾病預(yù)后的判斷。當(dāng)然，F(xiàn)AP與ACS更深的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及FAP與其他類型心血管疾病的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。