澤瀉不同部位提取物體外抗氧化活性的比較研究

楊利利，藍(lán)夢柳，陳國翔，許 文，吳水生

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

澤瀉（Alismatis Rhizoma）來源于澤瀉科澤瀉屬植物澤瀉［Alisma orientale（Sam.）Juzep.］的干燥塊莖，其性寒，味甘，具有利濕、清熱、化濁降脂等功效［1-2］。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，澤瀉具有利尿［3］、降血糖［4］、降血脂、抗脂肪肝［5］及動(dòng)脈粥樣硬化［6］、抗腫瘤［7］等藥理作用。澤瀉主產(chǎn)地為福建、江西廣昌、四川等地，作為福建的道地藥材，以其生產(chǎn)歷史悠久、品質(zhì)優(yōu)良而被列為上品［8-9］。根據(jù)調(diào)研發(fā)現(xiàn)澤瀉花苔（澤瀉的花莖）常被當(dāng)?shù)鼐用裼脕硎秤谩Ｃ绹鴮W(xué)者Harman在1956年提出自由基學(xué)說，認(rèn)為生物體內(nèi)的多種代謝途徑都會產(chǎn)生高度氧化活性的自由基，自由基生成和消除通常處于平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體自由基過剩時(shí)，就會直接或者間接造成細(xì)胞活力下降，引起機(jī)體衰老、誘發(fā)細(xì)胞癌變等各種疾?。?0］。因此，抗氧化劑能夠減少自由基對機(jī)體氧化損傷，有效抑制疾病的發(fā)生，而現(xiàn)代藥理研究表明澤瀉塊莖具有抗氧化活性，但是對澤瀉不同部位，尤其澤瀉花苔體外抗氧化活性的評價(jià)研究未見報(bào)道。因此，為了解澤瀉塊莖、花苔、莖、葉等不同部位的抗氧化活性，本研究通過1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除法和鐵離子還原法（FRAP）［11-12］對比分析澤瀉不同部位提取物的體外抗氧化效果，以期為澤瀉花苔資源藥食兩用功能開發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 ME204E／02電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；KQ-200DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海-恒科技有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（帝肯奧地利有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥 ABTS試劑、FRAP試劑（碧云天生物技術(shù)）；S30629 DPPH（上海源葉生物科技有限公司）。原材料澤瀉10批樣品采自福建建甌的吉陽，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范世明高級實(shí)驗(yàn)師鑒別基原為［Alisma orientale（Sam.）Juzep.］，樣本寄存于福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室。澤瀉洗凈，分為塊莖、莖、葉、花苔不同部位，60℃烘干，粉碎后過80目，備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備 精密稱取1 g樣品粉末置于50 mL的錐形瓶中，加入25 mL甲醇，密封，稱重。超聲（250 W，40 kHz）提取 30 min。用甲醇補(bǔ)足失重，0.45 μm微孔濾膜過濾。

2.2 抗氧化能力測定

2.2.1 清除DPPH自由基 精密稱取DPPH粉末適量，加入甲醇溶解制成50 μg／mL的DPPH溶液，避光保存。在96孔板中加入100 μL DPPH溶液，再分別加入不同濃度的樣品液及VC標(biāo)準(zhǔn)品，最后加甲醇至每個(gè)檢測孔為200 μL，避光30 min。另將DPPH溶液換為甲醇溶液，重復(fù)上述操作，以甲醇做空白對照。利用多功能酶標(biāo)儀測定519 nm處的A值，計(jì)算清除率和IC50值。

As：樣品＋DPPH溶液；Ab：樣品＋甲醇溶液；Ac：DPPH 溶液；Ab'：甲醇溶液

2.2.2 清除ABTS自由基 取等體積ABTS溶液和氧化劑溶液混合，室溫避光保存16 h，得ABTS工作母液。用80%的無水乙醇稀釋ABTS工作母液，使其在734 nm處的吸光度為0.65～0.75，相應(yīng)的405 nm處的吸光度在1.4左右。在96孔板中加入100 μL ABTS工作液，再分別加入不同濃度的樣品液及VC標(biāo)準(zhǔn)品，最后加甲醇至每個(gè)檢測孔為200 μL，室溫下孵育6 min。利用多功能酶標(biāo)儀測745 nm處的A值，計(jì)算清除率和IC50值。

A1：樣品的 A 值；A2：空白對照；A0：ABTS 工作液的A值

2.2.3 FRAP法測抗氧化能力 取TPTZ溶液、TPTZ稀釋液、檢測緩沖液按1∶10∶1的比例混勻，放入37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱孵育5 min。在96孔板中，加入100 μL已配制好的FRAP工作液，再分別加入不同濃度的樣品液、FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液及VC標(biāo)準(zhǔn)品，最后加甲醇至每個(gè)檢測孔為200 μL，室溫下孵育5 min。利用多功能酶標(biāo)儀測593 nm處的A值，以A值對不同濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算總抗氧化能力。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理書局。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均值，數(shù)據(jù)用（）表示。

3 結(jié) 果

3.1 清除DPPH自由基 澤瀉不同部位對DPPH自由基均有一定清除作用，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，清除率隨濃度增大而增大。澤瀉各個(gè)部位抗氧化能力大小依次為澤瀉花苔＞澤瀉莖＞澤瀉葉＞澤瀉塊莖。見表1。

3.2 清除ABTS自由基 澤瀉不同部位對ABTS自由基均有一定清除作用，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，清除率隨濃度增大而增大。澤瀉各個(gè)部位抗氧化能力大小依次為澤瀉花苔＞澤瀉葉＞澤瀉莖＞澤瀉塊莖。見表2。

表2 澤瀉不同部位對ABTS自由基清除率%

3.3 FRAP法測抗氧化能力 以A值對不同濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行線性擬合，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝0.005 1 X＋0.064 6，r＝0.999 3，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算澤瀉不同部位的FRAP值。澤瀉各個(gè)部位抗氧化能力大小依次為澤瀉花苔＞澤瀉莖＞澤瀉葉＞澤瀉塊莖。見表3。

表3 澤瀉不同部位的FRAP值

3.4 澤瀉不同部位抗氧化能力比較 IC50值是清除率為50%時(shí)的濃度值，由SPSS 20.0計(jì)算各個(gè)樣品的IC50值，結(jié)果如表4所示，IC50值越小，表明其抗氧化能力越強(qiáng)。FRAP法結(jié)果總抗氧化能力用FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來表示，F(xiàn)RAP值越大抗氧化能力越強(qiáng)。

4 討 論

本研究通過DPPH法、ABTS法和FRAP法三種抗氧化能力檢測方法比較，測定澤瀉不同部位對DPPH自由基、ABTS＋自由基的清除率及Fe3＋的還原能力，從而對澤瀉花苔、澤瀉塊莖、澤瀉莖、澤瀉葉的抗氧化能力進(jìn)行比較，結(jié)果表明抗氧化能力隨著濃度的升高而提高，且澤瀉不同部位對DPPH、ABTS自由基和Fe3＋表現(xiàn)出不同的抗氧化能力。在DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中，澤瀉各個(gè)部位抗氧化能力大小依次為澤瀉花苔＞澤瀉莖＞澤瀉葉＞澤瀉塊莖，在ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)中，澤瀉各個(gè)部位抗氧化能力大小依次為澤瀉花苔＞澤瀉葉＞澤瀉莖＞澤瀉塊莖，在FRAP法測抗氧化能力實(shí)驗(yàn)中澤瀉各個(gè)部位抗氧化能力大小依次為澤瀉花苔＞澤瀉莖＞澤瀉葉＞澤瀉塊莖。

表4 澤瀉不同部位的IC50值及FRAP值

澤瀉地上部分相較于塊莖均表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，澤瀉花苔的抗氧化活性在3種檢測方法中均有最強(qiáng)的抗氧化能力，提示澤瀉花苔有一定的藥用價(jià)值，具有很好的開發(fā)前景，值得深入研究。