胡椒油中萜類化合物對(duì)單增李斯特菌抑菌機(jī)理及在冷鮮肉中的應(yīng)用

李兆亭,陳文學(xué),韓迎潔,孫志昶

(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes),簡稱單增李斯特菌,在自然界中廣泛存在,是一種常見的食源性病原體。它具有很強(qiáng)的生存能力,可以在低溫、酸性和高鹽環(huán)境中繼續(xù)生長。對(duì)于低溫肉類產(chǎn)品,特別是依賴?yán)滏満蛧?yán)格衛(wèi)生條件的冷鮮肉以及熟肉制品,如果不進(jìn)行二次滅菌延長保質(zhì)期,很容易造成安全隱患[1]。

食品保鮮劑按來源可以分為化學(xué)合成保鮮劑和天然保鮮劑,目前市場(chǎng)上以化學(xué)抑菌劑為主,化學(xué)保鮮劑雖然能起到良好的保鮮效果,但一些化學(xué)保鮮劑本身存在著致畸致癌性,長期使用會(huì)對(duì)人體造成危害[2]。天然保鮮劑具有安全、無毒、廣譜抑菌等優(yōu)點(diǎn),在肉制品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。此外,隨著人們對(duì)健康的關(guān)注,消費(fèi)者對(duì)食品安全的要求不斷提高,尋找能替代化學(xué)保鮮劑的天然保鮮劑已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[4-5]。

胡椒屬于藥食同源的植物材料之一,胡椒中揮發(fā)油的含量達(dá)4.5%以上,胡椒揮發(fā)油對(duì)鼠傷沙門氏菌、葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用[6-7]。胡椒油主要成分為萜類化合物,占胡椒油的78.92%,具有抗病毒、細(xì)菌、真菌,抗腫瘤,預(yù)防心血管疾病以及松弛平滑肌等多種生物活性[8-9]。目前,大多數(shù)研究僅討論天然保鮮劑的宏觀抑菌性能,而關(guān)于胡椒中萜類化合物對(duì)單增李斯特菌的抑菌機(jī)理以及在冷鮮肉中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。因此,本研究將胡椒油中萜類化合物作為保鮮劑,探究其對(duì)單增李斯特菌的抑菌機(jī)理以及冷鮮肉的保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胡椒粉 海南省?？谑心蠂?冷鮮豬肉 羅牛山股份有限公司;單增李斯特菌(ATCC19115) 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB) 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;瓊脂 北京Solarbio科技有限公司;磷酸二氫鈉 山東西亞化學(xué)股份有限公司;磷酸氫二鈉、無水硫酸鈉 西隴科學(xué)股份有限公司;改良牛津培養(yǎng)基(MOX) 上海谷研實(shí)業(yè)有限公司。

TP-313電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;ZB125切碎機(jī) 諸城華杰機(jī)械有限公司;RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;DKZ電熱恒溫震蕩水槽 上海一恒科技有限公司;FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;S3000掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司;7890B-7000B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS) 美國安捷倫科技有限公司;UV752N紫外可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胡椒油中萜類化合物的提取 參考王延輝等[10]、鄒蘭等[11]的方法采用蒸餾萃取(SDE)法提取胡椒中的萜類化合物。SDE條件:取50 g胡椒粉末置于500 mL的圓底燒瓶中,加入200 mL超純水和少量玻璃珠。接收端裝90 mL沸程90～120 ℃石油醚,85 ℃恒溫水浴提取60 min。萃取后上層有機(jī)相過50 g無水硫酸鈉柱,濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后制得萜類化合物粗提物。

1.2.2 萜類化合物化學(xué)成分的測(cè)定 取0.1 mL胡椒油用正己烷定容至5 mL,取1.5 mL至進(jìn)樣瓶。參考Cui等[12]的方法,色譜柱:HP-5彈性石英毛細(xì)管(30 m×0.25 mm,0.33 μm);柱溫:60～200 ℃(5 ℃/min);汽化室溫度230 ℃;溶劑延遲4 min;傳輸線溫度230 ℃;進(jìn)樣量0.2 μL;載氣(He)流量2 mL/min;分流比40∶1。LS質(zhì)譜條件EI離子源;離子源溫度230 ℃;電離能量70 eV;發(fā)射電流34.6 μA;電子倍增器電壓120 V;質(zhì)量范圍:20～500 amu。使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)測(cè)定和分析胡椒油中的化學(xué)成分。

1.2.3 單增李斯特菌的活化 單增李斯特菌凍干粉和腦心浸液混勻后,取5 μL接種到含有5 mL滅菌TSB肉湯培養(yǎng)基的試管中。參考金源[13]的方法,將試管包裹后37 ℃恒溫振蕩(80 r/min)培養(yǎng)16 h。在TSB肉湯培養(yǎng)基中傳代三次后,通過平板劃線純化菌株。將菌落接種在瓊脂平板上,然后將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中16～24 h,挑取單個(gè)菌落并在無菌條件下接種到含有TSB肉湯培養(yǎng)基的試管中,再次培養(yǎng)過夜制得菌懸液,4 ℃存儲(chǔ)備用。

1.2.4 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 參考劉雪等[14]的方法將胡椒油加入含有TSB肉湯培養(yǎng)基的試管中,分別得到0.00625%、0.0125%、0.025%、0.05%、0.1%和0.2%(V/V)的濃度。隨后,取0.2 mL活化后的菌液于平板上涂布均勻。以無菌水作為空白對(duì)照,將各平板于37 ℃中倒置培養(yǎng)24 h,以完全不長菌的最小濃度確定為胡椒油對(duì)單增李斯特菌作用的MIC。

1.2.5 細(xì)胞裂解程度的測(cè)定 將活化后的單增李斯特菌在TSB中培養(yǎng),在37 ℃溫育24 h。將懸浮液在4 ℃條件下4000 r/min離心15 min并收集沉淀。將沉淀物用無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌三次并重懸浮以制備108CFU/mL(600 nm波長處的吸光值為0.1)的細(xì)菌懸浮液。根據(jù)1.2.4得出的MIC分別添加萜類化合物,使其濃度分別為0%、0.05%、0.10%、0.15%和0.20%,振蕩(150 r/min,37 ℃)培養(yǎng)20 h。將懸浮液在4 ℃下以4000 r/min離心15 min,并通過微孔膜濾器過濾上清液,通過紫外分光光度計(jì)在260 nm處測(cè)定濾液的吸光度[15-16]。

1.2.6 萜類化合物抑菌的最優(yōu)濃度 實(shí)驗(yàn)組用無菌PBS將胡椒油稀釋到試管中,分別得到濃度為0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的萜類化合物,對(duì)照組用等量蒸餾水代替萜類化合物。隨后,參考Nakayama等[17]的研究方法,取1.2.5中菌液(108CFU/mL),用無菌鹽水稀釋至103CFU/mL,取1 mL接種在瓊脂培養(yǎng)基中,并在150 r/min和37 ℃下培養(yǎng)。通過平板計(jì)數(shù)的方法,分別在培養(yǎng)的0、1、2、4、8、16 h計(jì)數(shù)活細(xì)菌的數(shù)目。

1.2.7 掃描電子顯微鏡(SEM)觀測(cè) 參考Diao等[18]的方法,通過SEM觀察單增李斯特菌形態(tài)。取活化后的單增李斯特菌菌液0.1 mL接種于200 mL TSB液體培養(yǎng)基中,根據(jù)1.2.5和1.2.5中得出萜類化合物抑菌的最優(yōu)濃度,在實(shí)驗(yàn)組加入0.2 mL胡椒油并在搖床上振蕩培養(yǎng)(37 ℃、150 r/min、24 h),對(duì)照組不添加胡椒油。取培養(yǎng)12和24 h的菌懸液,6000 r/min離心10 min收集菌體。先后用0.1 mol/L PBS、20%、40%、60%、80%的乙醇和無水乙醇進(jìn)行洗脫。脫水后的樣品在-20 ℃條件下預(yù)凍12 h后冷凍干燥12 h,SEM觀察其細(xì)胞形態(tài)。

表1 胡椒油中主要萜類化合物的化學(xué)組成Table 1 Chemical composition of major terpenoids in pepper oil

表2 胡椒油中萜類化合物最小抑菌濃度的測(cè)定Table 2 Determination of minimum inhibitory concentration of terpenoids in pepper oil

注:-代表無菌落;+代表少量菌落;++代表較多菌落;+++代表大量菌落。

1.2.8 菌液電導(dǎo)率的測(cè)定 參考張新虎等[19]的方法,取活化后的單增李斯特菌用無菌PSB(pH=7.4)洗滌3次,根據(jù)1.2.5和1.2.6中得出萜類化合物抑菌的最優(yōu)濃度,取菌液與0.1%胡椒油溶液混合作為試驗(yàn)組(EG),對(duì)照組(CG)不添加胡椒油,每隔2 h測(cè)定1次電導(dǎo)率,連續(xù)12 h。

1.2.9 胡椒油中萜類化合物對(duì)冷鮮肉中的保鮮作用 取60 g冷鮮肉,加入140 mL 生理鹽水,用均質(zhì)機(jī)制成勻漿,煮沸2 min后過濾,每10 mL濾液分裝于試管中,121 ℃ 15 min高溫滅菌后各加入10 μL菌懸液。隨后,根據(jù)1.2.5和1.2.6中得出萜類化合物抑菌的最優(yōu)濃度,實(shí)驗(yàn)組(EG)添加10 μL胡椒萜類化合物,對(duì)照組(CG)加入10 μL蒸餾水。將樣品在4 ℃條件下存儲(chǔ)24 h,每隔6 h取100 μL溶液至MOX選擇性培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h以計(jì)數(shù)單增李斯特菌。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。方差分析:SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn);圖形制作:Origin 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡椒油化學(xué)成分分析

胡椒揮發(fā)油的提取方法有冷壓榨法、有機(jī)溶劑浸取法、水蒸氣蒸餾法、索氏提取法、超聲波法、超臨界CO2萃取等[20-22]。蒸餾-萃取法是近些年來發(fā)展起來的揮發(fā)性成分分離方法,具有設(shè)備簡單、操作容易、溶劑用量小、揮發(fā)油的回收率較高等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用蒸餾萃取的方法提取黑胡椒中的揮發(fā)油,鑒定出14個(gè)化合物,其中萜類化合物12種,占總檢出量的77.60%，主要萜類化合物組成及比例見表1。其中檸檬烯主要存在于橘皮精油中的單環(huán)單萜烯，常溫下是一種無色至淡黃色油狀液體,具有特異的檸檬樣香氣,不溶于水,易溶于乙醇等有機(jī)溶劑。

2.2 胡椒油中萜類化合物對(duì)L. Monocytogenes的MIC

表2可知,胡椒油中萜類化合物對(duì)單增李斯特菌具有較強(qiáng)抑菌作用,MIC為0.05%,隨著萜類化合物濃度的提高,其抑菌能力增強(qiáng)。細(xì)菌經(jīng)萜類化合物作用后外膜分解,細(xì)胞壁大幅度增厚或分解,表面的粗糙度增加,細(xì)胞質(zhì)減少。檸檬烯可透過線粒體膜,使菌體的細(xì)胞器和相同離子滲出過程中的滲透率更大[23]。有關(guān)研究指出檸檬烯對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.05%,10 mL/L的檸檬烯可顯著抑制銅綠假單胞菌生長[14,24]。

2.3 胡椒中萜類化合物對(duì)單增李斯特菌細(xì)胞裂解程度的影響

用萜類化合物處理細(xì)菌后,測(cè)量其在260 nm處的吸光度作為細(xì)菌裂解的指標(biāo)[25]。如圖1所示,隨著萜類化合物濃度的增加,單增李斯特菌的吸光度增加,即細(xì)菌裂解程度增加。0.10%萜類化合物處理后的吸光度顯著高于對(duì)照組和0.05%萜類化合物處理組(P<0.05),而與0.15%和0.25%萜類化合物處理后吸光度沒有顯著差異,這說明萜類化合物對(duì)單增李斯特菌的最優(yōu)抑菌濃度為0.10%,可使得維持細(xì)菌生命所需的細(xì)胞內(nèi)成分流失,最終導(dǎo)致菌體死亡。

圖1 胡椒油中萜類化合物處理后L. monocytogenes菌懸液吸光度的變化Fig.1 Changes in absorbance of L. monocytogenes suspension after treatment with terpenoids in pepper oil注:圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 胡椒油中萜類化合物的抗菌活性

加入不同濃度萜類化合物后0～16 h內(nèi)單增李斯特菌的生長曲線如圖2所示,萜類化合物對(duì)單增李斯特菌具有良好的抗菌活性。從圖2中可以看出,對(duì)照組中單增李斯特菌的菌落數(shù)不斷增加,實(shí)驗(yàn)組單增李斯特菌的菌落數(shù)先增加后減少。在處理4 h后,0.1%、0.15%和0.2%之間的菌落數(shù)無顯著差異,但均顯著低于0.05%的菌落數(shù)(P<0.05)。

圖2 胡椒油中萜類化合物對(duì)L. monocytogenes的抗菌活性Fig.2 Antibacterial activity of terpenoids in pepper oil against L. monocytogenes

2.5 掃描電鏡下單增李斯特菌的形態(tài)

由SEM的結(jié)果可以清楚地看到單增李斯特菌在萜類化合物作用前后結(jié)構(gòu)的變化(圖3)。SEM顯示不與萜類化合物相互作用的細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)是完整的。萜類化合物處理12 h后,單增李斯特菌之間相互黏連,24 h后細(xì)菌大面積溶解,基本無法看到完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。這可能是由于檸檬烯的親脂活性,結(jié)合細(xì)胞膜上的磷脂從而使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[26]。有關(guān)報(bào)告指出植物精油能夠破壞微生物DNA的結(jié)構(gòu),進(jìn)而抑制基因表達(dá),影響微生物的正常生命活動(dòng)及繁殖[27]。但目前植物精油對(duì)微生物DNA的影響還處于初步研究階段,具體的作用位點(diǎn)和作用方式還不明確,有待進(jìn)一步的研究[28]。

圖3 掃描電鏡下單增李斯特菌的形態(tài)Fig.3 L. monocytogenes morphology under scanning electron microscope注:A、B分別表示12和24 h對(duì)照組細(xì)菌形態(tài),C、D分別表示12和24 h實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌形態(tài)。

2.6 萜類化合物對(duì)單增李斯特菌電導(dǎo)率的影響

在細(xì)菌受到強(qiáng)抑菌物質(zhì)的作用時(shí),菌體的細(xì)胞膜遭到破壞,失去原有保護(hù)能力,細(xì)胞內(nèi)有帶電離子等溶出,內(nèi)部電解質(zhì)向外泄露到培養(yǎng)液中,導(dǎo)致培養(yǎng)液的電導(dǎo)率增加。因此,細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化可以通過菌液電導(dǎo)率值的變化來反映[29]。由圖4可知,隨著時(shí)間的增加,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組單增李斯特菌菌液的電導(dǎo)率均增加。這意味著細(xì)胞膜的滲透性增加,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)成分的滲漏,特別是電解質(zhì)的損失。在6～12 h,添加0.1%萜類化合物菌液電導(dǎo)率顯著高于對(duì)照組(P>0.05),原因可能是0.1%的萜類化合物對(duì)細(xì)胞膜的破壞使電解質(zhì)大量外滲。王亞麗等[30]的研究顯示,藍(lán)莓葉多酚也能夠增加單增李斯特菌細(xì)胞膜的通透性。王帆等[31]指出,茶樹精油會(huì)導(dǎo)致單核細(xì)胞增生李斯特菌的穿孔膜損傷,并大大改變膜的滲透性。

圖4 胡椒油中萜類化合物對(duì)單增李斯特菌電導(dǎo)率的影響Fig.4 Effect of terpenoids in pepper oil on the conductivity of L. monocytogenes

2.7 胡椒油中萜類化合物對(duì)冷鮮肉的保鮮作用

冷鮮肉在分割和貯存過程中很容易被致病菌污染。0.10%萜類化合物對(duì)冷鮮豬肉的抗菌活性如圖5所示。結(jié)果表明,萜類化合物對(duì)冷鮮肉中的單增李斯特菌抑制作用明顯,與對(duì)照組相比,加入萜類化合物后冷鮮肉中的單增李斯特菌生長緩慢。此外,對(duì)照組的菌落數(shù)在冷藏12 h后已超過冷鮮肉國家標(biāo)準(zhǔn)(菌落總數(shù)大于6.0 lg CFU/g為變質(zhì)肉),但在加入0.10%萜類化合物后24 h仍然處于較低水平。

圖5 胡椒油中萜類化合物對(duì)冷鮮肉菌落總數(shù)的影響Fig.5 Effect of terpenoids in pepper oil on the total colony number of fresh meat

3 結(jié)論

本研究探討了胡椒油中萜類化合物對(duì)單增李斯特菌抑菌活性的影響,發(fā)現(xiàn)胡椒揮發(fā)油中含有12種萜類化合物，其MIC為0.05%，0.1%萜類化合物對(duì)單增李斯特菌顯示出非常好的抑菌活性。萜類化合物使得單增李斯特菌的細(xì)胞膜通透性增加,細(xì)胞內(nèi)容物大量外溢,細(xì)胞破碎溶解。萜類化合物在冷鮮肉中抑菌效果明顯，加入0.1%萜類化合物后菌落數(shù)在冷藏后24 h仍然處于較低水平。胡椒作為一種天然安全植物的香料,在制備保鮮劑方面具有廣闊的應(yīng)用前景。