紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物制備及其與花色苷相互作用研究

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(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023;2.湖北省農業(yè)科學院糧食作物研究所,湖北武漢 430064)

紫薯(Purple sweet potato),是果肉性狀呈紫色的薯類,屬于一種特殊的甘薯品種[1]。紫薯中蛋白質含量豐富[2-3],每100 g干物質紫薯中,粗蛋白含量約1.2～10 g。紫薯中同時具有游離態(tài)花色苷和聚合態(tài)花色苷,聚合態(tài)花色苷主要是以紫薯蛋白花色苷復合物的形式呈現(xiàn),即紫薯蛋白與花色苷通過共價鍵或非共價鍵結合形成新的生物大分子物質[4]。美拉德反應是蛋白質分子中ε-氨基與還原糖分子羰基發(fā)生的羰氨反應[5]。與原蛋白相比，蛋白質-多糖美拉德產物在溶解性、乳化性、起泡性、熱穩(wěn)定性、抗氧化性等理化性質上通常能夠得到增強,具有更好的應用價值[6-7]。

近年來,關于花色苷與蛋白質的相互作用報道很多。Arroyo-Maya等[8]研究了乳球蛋白、乳清蛋白和酪蛋白與花色苷的相互作用。王丹等[9]研究表明牛血清蛋白(BSA)與花色苷結合后,花色苷的穩(wěn)定性得以提升。郭瑩[10]等通過熒光猝滅法揭示了紫薯蛋白與紫薯花色苷的結合機理。但目前對于蛋白質糖基化產物結合花色苷的研究缺乏深入報道,探討兩者的相互作用對自然環(huán)境中紫薯蛋白花色苷復合物的形成具有比較參考價值。本文采用反應過程綠色且有效的干法美拉德反應制備改性紫薯蛋白。運用聚丙烯酰胺凝膠電泳、紅外光譜、差示量熱掃描和熒光光譜法研究紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物性質及其與花色苷之間的相互作用。通過研究紫薯花色苷與紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物之間的相互作用為紫薯蛋白質花色苷復合物的形成提供比較參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫薯品種 為鄂薯12號,由湖北省農業(yè)科學院提供;紫薯花色苷(其中芍藥素-3-(6′咖啡酰-6″阿魏酰槐糖苷)-5-葡糖苷占總花色苷含量的37%) 實驗室自制[10];pH7.0 Tris HCl 索萊寶科技有限公司;葡萄糖 上海安耐吉化學有限公司;十二烷基硫酸鈉 碧云天試劑公司;鹽酸、溴化鉀 國藥集團化學試劑有限公司;交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(crosslinking polyvingypyrrolidone,PVPP) 上海阿拉丁試劑有限公司;透析袋(壓平寬度10 mm,截留分子質量3500 D) 美國Viskase公司;所有試劑 均為分析純。

AL204電子分析天平 梅特勒儀(上海)有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;Mini-Protean-3電泳儀配電泳槽 美國Bio-Rad公司;DSC-Q2000差示熱量掃描儀 美國TA儀器有限公司;F-4600熒光光譜儀 日本日立公司;NEXUS670傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物制備

1.2.1.1 紫薯蛋白花色苷復合物的制備 紫薯蛋白花色苷復合物的制備(Purple Sweet Potato Protein-Anthocyanin Complexs,PSPP-AC):稱取1.25 kg新鮮紫薯,清洗打漿,按料液比1∶8加入水(pH6.5),在40 ℃下水浴超聲提取90 min,提取液在4000 r/min條件下離心30 min,去除殘渣。冰浴控制提取液溫度為4 ℃條件并緩慢添加硫酸銨粉末至飽和度60%,并在此條件緩緩攪拌1 h,4000 r/min條件下離心30 min,收集沉淀,少量蒸餾水稀釋后透析除去硫酸銨,冷凍干燥后即得復合物。

1.2.1.2 紫薯蛋白的分離純化 紫薯蛋白(Purple Sweet Potato Protein,PSPP)的分離純化[11-12]:取紫薯蛋白花色苷復合物0.2 g溶于50 mL去離子水中,攪拌30 min使其充分溶解,加入2 g交聯(lián)聚乙烯比咯烷酮(PVPP)渦旋混勻,靜置1 h,在4000 r/min、室溫條件下離心30 min。取上清液,濃縮上清液至20 mL,等待上樣。DEAE-52陰離子交換層析柱填料活化裝填并采用去離子水平衡后,將處理過的紫薯蛋白花色苷復合物溶液上樣,用含0.3 mol/L NaCl的50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)進行洗脫,流速為1 mL/min,使用紫外檢測器在波長280 nm處在線檢測,收集對應峰組分,置于透析袋中透析24 h,冷凍干燥得到紫薯蛋白粉末。

1.2.1.3 紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物的制備 紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物(Purple Sweet Potato Protein Maillard Product,PSPPMP)的制備[13]。干法制備美拉德產物:稱取0.1 g紫薯蛋白粉末,溶解于50 mL去離子水中,加入同等質量的葡萄糖粉末,攪拌30 min使其充分溶解混合,冷凍干燥后,均勻平鋪在直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中,置于溫度為60 ℃,相對濕度為78.9%的反應環(huán)境中,分別在反應6、12、18、24 h后取出樣品,用少量去離子水溶解,透析12 h除去未參與反應的葡萄糖分子,冷凍干燥,置于-20 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

濕法制備美拉德產物:稱取0.1 g紫薯蛋白粉末,溶解于50 mL pH為7的磷酸鹽緩沖液中,加入同等質量的葡萄糖,再加入0.02%的疊氮化鈉,攪拌30 min使其充分溶解并混合均勻。置于60 ℃的恒溫箱中反應24、48 h后取出,透析冷凍干燥即得濕法美拉德產物。

1.2.2 美拉德產物SDS-PAGE分析 紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析參考Laemmli[14]報道的方法,并稍作改進。選擇12%濃度的分離膠,5%濃度的濃縮膠。取10 mg紫薯蛋白、紫薯蛋白花色苷復合物、紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物樣品用去離子水溶解定容到10 mL,配制成濃度為1 mg/mL的樣品溶液。按照4∶1的體積比將樣品溶液加入到蛋白上樣緩沖液(5×)中,充分混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液,沸水浴10 min,冷卻至室溫后上樣,上樣量為10 μL。在60 V電壓條件下電泳40 min,然后在120 V電壓條件下電泳1 h左右,當溴酚藍指示劑到達距離凝膠底部0.5 cm處時停止電泳。取下電泳凝膠,浸泡在0.25%的考馬斯亮藍R-250溶液中染色2 h,然后取出置于含50%乙酸的甲醇溶液中脫色12 h,取出使用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠拍照。

1.2.3 美拉德產物紅外光譜(FTIR)分析 參考文獻[15],取一定量紫薯蛋白、紫薯蛋白花色苷復合物、紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物按質量比1∶100的比例與溴化鉀粉末混合,充分研磨混勻,在保持干燥的條件下壓成透明薄片,進行紅外光譜掃描,掃描波數(shù)范圍為4000～400 cm-1,分辨率為4 cm-1,重復掃描16次。

1.2.4 美拉德產物差式掃描量熱(DSC)分析 參考文獻[16]方法,并略做改進。稱取(5±0.2) mg紫薯蛋白、紫薯蛋白花色苷復合物、紫薯蛋白-葡萄糖美拉德反應產物粉末分別放入鋁盒中,加蓋壓實,以空鋁盒作為空白對照,溫度測定范圍為25～150 ℃,升溫速率為5 ℃/min,控制氮氣流速為20 mL/min,測定樣品變性峰溫度及熱焓值變化。

1.2.5 美拉德產物與花色苷相互作用

1.2.5.1 熒光光譜 參考文獻[17]中的方法,配制0.5 mg/mL的紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物溶液和濃度為4×10-3mol/L的紫薯花色苷溶液,向2 mL的美拉德產物溶液中加入不同量的紫薯花色苷溶液,使花色苷與蛋白的濃度比分別為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,充分混勻,然后分別在25、30、35 ℃水浴鍋中恒溫,測定混合液的熒光發(fā)射光譜。

1.2.5.2 同步熒光光譜 參考文獻[18]中的方法配制0.5 mg/mL的紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物溶液和濃度為4×10-3mol/L的紫薯花色苷溶液,向2 mL的美拉德產物溶液中加入不同量的紫薯花色苷溶液,使花色苷與蛋白的濃度比分別為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,充分混勻。固定激發(fā)波長為280 nm,發(fā)射波長范圍為290～500 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm,并分別測量Δλ=15 nm條件下激發(fā)波長為250～500 nm的同步熒光光譜,Δλ=60 nm條件下激發(fā)波長為200～440 nm處的同步熒光光譜。

2 結果與分析

2.1 美拉德產物SDS-PAGE分析

紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜如圖1所示。條帶1、2、3、4代表紫薯蛋白與葡萄糖通過干法美拉德反應6、12、18、24 h的產物的特征條帶,隨著紫薯蛋白與葡萄糖美拉德反應時間的增加,美拉德反應產物分子量也逐漸增大。條帶5和條帶6分別為紫薯蛋白與葡萄糖通過濕法美拉德反應24、48 h得到的產物的條帶?？梢钥吹?干法反應情況下,在反應前紫薯蛋白染色帶主要集中在20 kDa,反應后分子量漸漸增大,染色帶逐漸接近紫薯蛋白花色苷復合物分子量的染色帶為25 kDa。據(jù)研究,紫薯蛋白含有58 kDa分子量的蛋白質,從美拉德反應條帶中可以看到在接近標準蛋白63 kDa的染色帶處有新的染色帶產生,并逐漸達到63 kDa,可以說明,干法美拉德反應形成了分子量更大的接枝產物。在濕法美拉德反應情況下,紫薯蛋白的分子量并沒有增加,沒有形成較大分子量的染色帶,即葡萄糖分子與紫薯蛋白產生接枝反應程度非常小。經過對比,紫薯蛋白與葡萄糖的干法美拉德反應中,確實發(fā)生了以共價鍵形式結合為基礎的接枝反應,并且生成了相對分子質量較大的物質,因此選擇干法美拉德反應制備紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物。

2.2 美拉德產物紅外光譜(FTIR)分析

圖2 各樣品的紅外面光譜圖Fig.2 FTIR spectra of samples注:a. 紫薯蛋白;b. 紫薯蛋白花色苷復合物;c. 紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物。

傅里葉紅外光譜廣泛地應用在蛋白質二級結構的測定中。不僅能夠對蛋白質的空間結構進行反映,而且可以提供蛋白質分子中的氨基基團。N-H伸縮振動與酰胺A有關,其吸收峰出現(xiàn)在3400～3440 cm-1范圍內,當它與氫鍵締合后,會向低波數(shù)發(fā)生位移[19],從圖2可以得到,紫薯蛋白、復合物、美拉德產物的酰胺A分別出現(xiàn)在3405.67、3388.32、3405.67 cm-1。紫薯蛋白、復合物、美拉德產物分別在2962.13、2925.48、2923.56 cm-1處有弱吸收,是由酰胺B的CH2不對稱伸縮引起的,其中復合物、美拉德產物與紫薯蛋白相比略有紅移。相較于紫薯蛋白、復合物在1641.13處的吸收強度,美拉德產物吸收較低,這是來自酰胺I帶的C=O伸縮振動。三種物質分別在1538.92、1513.83、1511.84 cm-1處的吸收是酰胺II帶的特征吸收峰。紫薯蛋白在1457.92 cm-1及復合物在1450.21、1384.64 cm-1、美拉德產物在1402.00、1240.00 cm-1處的吸收可能是甲氧基中C-H面內彎曲振動吸收峰。紫薯蛋白在1112.73 cm-1處的吸收低于復合物及美拉德產物分別在1076.08 cm-1處的吸收強度,這一部分的吸收可能是由C-O-C伸縮振動引起的。

2.3 美拉德產物差式掃描量熱(DSC)分析

蛋白質的變性熱能夠反映蛋白質在溫度變化較大時其維持空間結構及次級鍵(主要是氫鍵)不被破壞、不斷裂的穩(wěn)定性的能力[20]。差式量熱掃描法是檢測包括蛋白質在內的物質的熱性質的一種技術方法,工作原理是在控溫程序下,測量升溫、降溫、恒溫過程中樣品與參比物之間的熱量差與溫度的關系。圖3所示為紫薯蛋白、紫薯蛋白花色苷復合物、紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物的差式掃描量熱圖譜。從圖3中可以看出,這三種物質在室溫下就已經呈現(xiàn)變性趨勢,表明這三種物質在室溫下穩(wěn)定性較差。紫薯蛋白和復合物的變性峰溫度相差不多,分別為73.08、73.93 ℃。而紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物的變性峰溫度有所提高,為76.00 ℃,這表明糖基的接入改變了紫薯蛋白的結構和構象,形成了變性峰值更大的新的物質。紫薯蛋白、紫薯蛋白花色苷復合物、紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物的變性焓值分別為554.8、466.1、366.7 J/g。說明自然環(huán)境中,紫薯蛋白結合了花色苷之后穩(wěn)定性有所增強,制備的紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物穩(wěn)定性比紫薯蛋白有所降低。

圖3 DSC分析圖譜Fig.3 DSC spectra of samples

2.4 紫薯花色苷對紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物的熒光光譜影響

熒光是光致發(fā)光現(xiàn)象。一般蛋白質都具有熒光特性,是因為蛋白質中的色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)殘基具有熒光特性,這種熒光特性屬于內源熒光特性,并且這三種殘基具有不同的熒光光譜[21]。其中色氨酸殘基的熒光強度最大,所以通常利用Trp的熒光性質來研究蛋白分子與猝滅劑之間的相互作用。由圖4可以看到,美拉德產物的發(fā)射波長在310、340 nm左右出現(xiàn)峰值,其中310 nm處是由酪氨酸殘基產生的,340 nm處是由色氨酸殘基產生的,但340 nm處的峰值明顯高于310 nm處的峰值。表明紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物的熒光特性主要來源于色氨酸殘基。隨著不同濃度花色苷的加入,色氨酸殘基與酪氨酸殘基的熒光性減弱,熒光強度不斷降低。這證明花色苷與紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物之間產生了相互作用,對美拉德產物熒光形成了動態(tài)猝滅或者靜態(tài)猝滅。

圖4 紫薯花色苷與紫薯蛋白-葡萄糖產物相互作用的熒光光譜圖Fig.4 Flourescence spectra of PSPA-PSPPMP systems注:a→n:c花色苷濃度/c美拉德產物濃度=1～12。

2.5 熒光猝滅機制

熒光猝滅機制有三種:動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅、非輻射能量轉移。在動態(tài)猝滅機制下,當熒光物質體系中加入猝滅劑后,猝滅劑會與處于激發(fā)態(tài)的熒光物質接觸并發(fā)生碰撞,從而產生能量和電子轉移,使熒光物質回到基態(tài)不再發(fā)射光子。這一過程跟時間相關。靜態(tài)猝滅機制下,猝滅劑加入到熒光體系后會與基態(tài)熒光物質接觸并發(fā)生反應,生成新的基態(tài)復合物,復合物吸收光子后并不發(fā)射熒光。熒光猝滅機制的判定一般通過Stern-Volmer方程(2-1)來確定[22]。

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

式(1)

F0和F分別是美拉德產物加入花色苷前后的熒光強度;KSV、Kq、τ0、[Q]依次為猝滅常數(shù)、猝滅速率常數(shù)、不含猝滅體時生物大分子的平均熒光壽命(通常τ0=10-8s)和猝滅體的濃度[23]。一般,靜態(tài)猝滅主要是因為形成了復合物,隨著溫度的升高復合物穩(wěn)定性會下降,靜態(tài)猝滅常數(shù)也會因此下降;動態(tài)猝滅主要是因為分子間的相互碰撞及擴散引起的,隨著溫度的升高,動態(tài)猝滅常數(shù)也會升高。通過這種溫度的特點,可以判斷猝滅機制。

根據(jù)Stern-Volmer方程,分別在298.15、303.15、308.15 K三個溫度下測定計算了美拉德產物與花色苷的猝滅常數(shù)。結果見圖6和表1。

一般,當熒光物質為生物大分子時,其最大擴散碰撞猝滅常數(shù)為2×1010L·mol-1s-1,當Kq>2×1010L·mol-1s-1時,屬于靜態(tài)猝滅,反之,則屬于動態(tài)猝滅[24-25]。由表1可知,花色苷對美拉德產物的猝滅常數(shù)遠大于2×1010L×mol-1s-1,且KSV值隨溫度的升高而減小。圖5中擬合曲線并不是一條直線,是一條彎曲向上的上升曲線,這表明體系中既存在靜態(tài)猝滅也存在動態(tài)猝滅。由此說明,紫薯花色苷對美拉德產物的猝滅主要是形成了新的復合物引起的靜態(tài)猝滅。

圖5 不同溫度下紫薯花色苷與美拉德產物相互作用的Stern-Volmer曲線Fig.5 Stern-Volmer plots of PSPPMP interacting with PSPA at different temperatures

圖6 不同溫度下紫薯花色苷與美拉德產物相互作用的模擬曲線Fig.6 Fitting curve of PSPPMP interacting with PSPA at different temperatures

T(K)KSV(×104 L/mol)Kq(×1012 L/mol/s)R2298.153.0503.0500.9986303.153.0143.0140.9996308.152.9912.9910.9977

2.6 結合常數(shù)和結合位點數(shù)的確定

結合常數(shù)和結合位點數(shù)的確定采用雙對數(shù)曲線方程得出,方程如下[26]:

lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlg[Q]

式(2)

Ka:結合常數(shù);n為結合位點數(shù)。以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作出擬合曲線如圖7。結合常數(shù)及結合位點見表2,紫薯花色苷與紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物在不同溫度下的結合位點數(shù)分別為1.273、1.336、1.323,溫度變化對其影響很小,表明紫薯花色苷與紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物之間的相互作用力很強。

圖7 不同溫度下紫薯花色苷與美拉德產物相互作用的雙對數(shù)曲線Fig.7 The double logarithm regression plots of PSPPMP interacting with PSPA at different temperatures

表2 不同溫度下紫薯花色苷與美拉德產物相互作用結合常數(shù)Table 2 The binding constants of PSPPMP interacting with PSPA at different temperatures

2.7 熱力學參數(shù)和作用力分析

分子間的作用力主要有范德華力、疏水作用力、靜電引力和氫鍵等。一般通過反應熱力學參數(shù)來確定作用力類型,比如通過反應前后熱力學參數(shù)焓變和熵變的大小就可判斷主要作用力類型。當ΔH>0、ΔS>0時,作用力為疏水作用力;當ΔH<0、ΔS>0時,為靜電作用力;當ΔH<0、ΔS<0時,為范德華力和氫鍵作用力,這說明分子間作用力也可能存在多種作用力作用的情況[27-28]。

當溫度變化不大時,ΔH可看成是一常數(shù),熱力學參數(shù)和小分子與蛋白質之間的作用力關系可通過以下方程計算得出:

式(3)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnKa

式(4)

根據(jù)公式(2～4)及上述所得Ka,可以計算出花色苷與美拉德產物相互作用的熱力學函數(shù)值,結果見表3。紫薯花色苷與美拉德產物的相互作用的ΔG<0,表明該反應可自發(fā)進行;ΔH<0,ΔS<0表明花色苷與美拉德產物結合的作用力主要表現(xiàn)為范德華力和氫鍵作用力。

表3 不同溫度下紫薯花色苷與美拉德產物相互作用的熱力學參數(shù)Table 3 The thermodynamics parameters of PSPPMP interacting with PSPA at different temperatures

2.8 同步熒光光譜分析

測定熒光光譜時,色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸殘基的激發(fā)和發(fā)射光譜都不完全相同,譜圖之間會產生干擾,所以不能同時測定。一般通過固定激發(fā)和發(fā)射單色器的波長差Δλ來測定單一的不同氨基酸殘基,得到同步熒光光譜,同步熒光光譜可以反映生色團分子周圍環(huán)境的信息。當Δλ=15時,可測定酪氨酸殘基熒光吸收光譜;當Δλ=60時,可測定色氨酸殘基的熒光吸收光譜。由熒光吸收光譜可以判斷蛋白質中氨基酸殘基微環(huán)境的變化[29-30]。由圖8可知,隨著花色苷濃度的不斷增加,紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物中酪氨酸、色氨酸殘基的同步熒光強度均逐漸減弱。其中酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長并未發(fā)生明顯變化,而色氨酸殘基的最大發(fā)射波長發(fā)生了輕微的藍移,這說明紫薯花色苷的加入,使紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物的構象發(fā)生了變化,使色氨酸殘基處的微環(huán)境改變。色氨酸殘基最大發(fā)射波長的藍移以及色氨酸殘基熒光猝滅程度大于酪氨酸殘基表明,紫薯花色苷與紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物的結合位點更接近色氨酸殘基。這一點與本實驗室郭瑩等研究的紫薯花色苷與紫薯蛋白的相互作用一致[10]。

圖8 紫薯花色苷和紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物反應的同步熒光光譜圖Fig.8 Synchronous scanning fluorescence spectra of PSPPMP interacting with PSPA注:1:Δλ=15 nm;2:Δλ=60 nm;a→n:c花色苷濃度/c美拉德產物濃度=1→12。

3 結論

以紫薯蛋白和葡萄糖為原料,通過美拉德反應制備紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物,并研究產物的理化性質及其與花色苷的相互作用。研究結果表明,紫薯蛋白-葡萄糖美拉德反應主要產物的分子量約為25 kDa。美拉德產物的紅外光譜吸收強度低于紫薯蛋白花色苷復合物,尤其于酰胺I帶處的紅外吸收強度。紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物變性峰溫度為76 ℃,高于紫薯蛋白、紫薯蛋白花色苷復合物;三者變性焓值分別為554.8、466.1、366.7 J/g。紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物的最大熒光發(fā)射波長是340 nm,紫薯花色苷對其猝滅機理屬于動靜態(tài)聯(lián)合猝滅,靜態(tài)猝滅起主導作用。二者之間的作用力屬于強作用力,主要表現(xiàn)為范德華力和氫鍵?；ㄉ张c紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產物的結合位點更靠近色氨酸殘基。改性后的紫薯蛋白其溶解性、乳化性、起泡性等功能特性后續(xù)將進一步研究探討。