尖頂羊肚菌原基形成過程顯微觀察與分析

石建森，郭明慧，郭 尚，周 偉，王志偉，武 旭，李云霞

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)研究中心，山西太原030031）

羊肚菌（Morchella spp.）是一種非常珍貴的食用菌，隸屬于子囊菌亞門（Ascomycota）盤菌綱（Discomycetes）盤菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae）[1]。很久以來，人們一直致力于羊肚菌人工栽培的研究，并且不斷地取得一些技術(shù)上的進(jìn)步，使羊肚菌的大田栽培得以實(shí)現(xiàn)。2015 年以來，我國的羊肚菌栽培規(guī)模迅速擴(kuò)張，目前已達(dá)0.67 萬hm2左右。但遺憾的是，由于羊肚菌理論研究方面的欠缺，造成無法制定出精準(zhǔn)的栽培工藝流程，產(chǎn)量一直徘徊在750～2 250 kg/hm2的水平，80%～90%的種植戶處于虧本狀態(tài)。

在羊肚菌的理論方面，原基的形成過程是一個(gè)有爭議的關(guān)鍵問題。大部分人認(rèn)為，羊肚菌原基形成與平菇、香菇等擔(dān)子菌的原基形成大體類似，是由菌絲扭結(jié)形成原基的。這個(gè)理論的代表人物有OWER 等[2-6]，他們提出了以菌核為中心的羊肚菌生活史，即由菌絲形成菌核，適宜條件下菌核又萌發(fā)形成菌絲，再由菌絲扭結(jié)成原基。但是有許多試驗(yàn)證明，菌核的有無與出菇與否以及產(chǎn)量高低之間沒有必然的聯(lián)系，有菌核產(chǎn)生的菌株不一定出菇，很少形成菌核的菌株同樣也可以出菇[7-9]。到目前為止，尚無菌核萌發(fā)成原基的直接證據(jù)。在后來的科學(xué)研究中，趙永昌等[9]研究發(fā)現(xiàn)，原基的形成數(shù)量與分生孢子形成相關(guān)，沒有分生孢子的都未形成原基。石建森等[10]的研究結(jié)果支持以上觀點(diǎn)，他們指出分生孢子與原基形成存在著正相關(guān)的關(guān)系，即分生孢子多的地方原基發(fā)生就多，分生孢子少的地方原基就少。

關(guān)于分生孢子在羊肚菌發(fā)育過程中的作用，國外研究者OWER 等[2，5，11]做了大量的工作，結(jié)果表明，羊肚菌的分生孢子單獨(dú)培養(yǎng)不能萌發(fā)[2-9]。JACOBS 等[12]及我國學(xué)者劉偉等[13]研究指出，羊肚菌的無性孢子像多數(shù)真菌的小分生孢子均難以萌發(fā)，功能上可充當(dāng)有性繁殖中的不動(dòng)精子的作用，而非傳統(tǒng)意義上的無性孢子繁殖體作用。這就暗示了分生孢子在羊肚菌的發(fā)育過程中可能要參與一個(gè)有性繁殖的過程。2017 年譚昊等[14]研究認(rèn)為，羊肚菌分生孢子類似于花粉的作用，對出菇有重要意義。2019 年山西省農(nóng)科院食用菌研究所石建森等[10]在大量試驗(yàn)觀察的基礎(chǔ)上提出了一個(gè)新的理論，這個(gè)理論的主要觀點(diǎn)是羊肚菌原基是由分生孢子與活躍菌絲交配形成的。這個(gè)理論比較圓滿地解釋了分生孢子單獨(dú)不能萌發(fā)及分生孢子與原基形成的正相關(guān)關(guān)系。重要的是，這個(gè)理論把原基形成過程描述為分生孢子與活躍菌絲的有性交配過程，而非原來的無性菌絲扭結(jié)過程。

本研究對尖頂羊肚菌（Morchella conica）的原基形成過程進(jìn)行了詳細(xì)的顯微觀察，進(jìn)一步探討分析了分生孢子、活躍菌絲與原基形成的關(guān)系，是筆者所提出的羊肚菌生活史新模型的補(bǔ)充研究[10]，其目的是使人們從另一個(gè)角度來觀察羊肚菌原基的形成過程，從而得出更加科學(xué)的結(jié)論。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試栽培菌株為尖頂羊肚菌8 號(hào)，來自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所菌種保藏室。

1.2 試驗(yàn)方法

羊肚菌栽培試驗(yàn)在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽試驗(yàn)示范基地12 號(hào)、16 號(hào)大棚進(jìn)行。2018 年11 月19—20 日播種，播種后澆大水，3 d 后菌絲萌發(fā)。12 月1 日畦面上有大量氣生菌絲產(chǎn)生，12 月7 日棚內(nèi)有結(jié)冰，畦上形成大量菌霜。2019 年2 月25 日澆出菇水，3 月21 日開始大批量出菇，發(fā)現(xiàn)有小菇已達(dá)1 cm。

1.3 顯微觀察

從3 月21 日起，每隔3 d 取樣一次進(jìn)行顯微觀察，于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察與拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 活躍菌絲上芽基形成顯微觀察

試驗(yàn)結(jié)果表明，羊肚菌播種后在土壤中分化成2 種菌絲，菌絲大體上分化成2 種形態(tài)，一是土壤表面的氣生菌絲，這種菌絲在土壤表面迅速生成分生孢子，俗稱菌霜，然后氣生菌絲快速衰退；二是土壤中形成活躍菌絲，這種菌絲常呈網(wǎng)絡(luò)狀、顏色深、韌性強(qiáng)，生命周期比氣生菌絲長。活躍菌絲在前期外表光滑、透亮（圖1-A、B），后期在澆出菇水后，土壤表面潮濕，活躍菌絲上形成許多凸起，這些凸起有的不規(guī)則，有的呈球狀（圖1-C、D、E、F）。推測這些凸起物是分生孢子與活躍菌絲接觸相互作用后有絲分裂形成的，是原基形成的最初期，暫命名為芽基。

2.2 菊花期顯微觀察

從芽基四周輻射長出新的菌絲，與活躍菌絲比較，這些菌絲呈現(xiàn)出顏色淺、較細(xì)、有相當(dāng)?shù)囊恢滦?，可以看出，是從芽基上延伸出來的。這些新生的菌絲宛如花瓣一樣，從側(cè)面觀察就像一朵菊花，常常連成一片，將其命名為菊花期（圖2），這是原基形成的第2 個(gè)時(shí)期。還可以觀察到在一根活躍菌絲上可以串聯(lián)形成多個(gè)原基（圖2），在某一點(diǎn)上也可形成2 個(gè)或2 個(gè)以上的原基。

2.3 原基分化顯微觀察

在菊花期后，緊挨土壤的新菌絲逐漸向下長入土壤中，從土壤中吸取營養(yǎng)，以后形成羊肚菌的假根。相對向上的一面顏色逐漸變深，由淡墨色變成深黑色，伸長形成羊肚菌的子囊果部分（圖3）。

還可以觀察到，羊肚菌原基起初在活躍菌絲的表面某一點(diǎn)或多點(diǎn)生成，隨著原基長大，活躍菌絲被原基包裹于根部，后來形成由一根菌絲串連多個(gè)原基的狀況（圖3），說明這些活躍菌絲不僅在原基形成時(shí)起著重要的作用，而且可能在假根形成前擔(dān)負(fù)著給原基輸送營養(yǎng)、水分的任務(wù)。

3 結(jié)論與討論

關(guān)于羊肚菌子實(shí)體的形成機(jī)制與過程是羊肚菌理論方面的一個(gè)重大問題，OWER 等[2，5]首先提出羊肚菌的子實(shí)體是由菌核長出來的，VOLK 等[3]在OWER 理論的基礎(chǔ)上提出一個(gè)完整的生活史模型，至今這個(gè)理論被人們廣為接受。但是在這個(gè)理論中把分生孢子完全排除在外，被后來學(xué)者的研究認(rèn)為是不妥當(dāng)?shù)摹Ｚw永昌等[9-10]都觀察到羊肚菌原基的數(shù)量與分生孢子存在著正相關(guān)的關(guān)系。在生產(chǎn)實(shí)踐中人們常常見到的“邊緣效應(yīng)”更直觀的看到了分生孢子的聚集區(qū)域會(huì)有大量原基產(chǎn)生。這一點(diǎn)可以作為分生孢子參與原基形成的直接證據(jù)。石建森等[10]提出了一個(gè)新的羊肚菌生活史模型，在這個(gè)模型中羊肚菌分生孢子與活躍菌絲相互作用才能產(chǎn)生原基的理論也許可以讓人們對羊肚菌原基形成機(jī)制有一個(gè)更加科學(xué)的認(rèn)識(shí)。

本研究通過對羊肚菌活躍菌絲及原基形成過程的詳細(xì)觀察分析，更為明確的闡述了羊肚菌原基形成是一個(gè)分生孢子與活躍菌絲相互作用后的有絲分裂過程，而非無性的單一菌絲扭結(jié)過程。這個(gè)結(jié)論與CARRIS 等[11-13]關(guān)于羊肚菌的分生孢子在形態(tài)特征上類似于其他真菌的小分生孢子，多數(shù)真菌的小分生孢子均難以萌發(fā)，功能上可能充當(dāng)有性繁殖中不動(dòng)精子的作用，而非傳統(tǒng)意義上的無性孢子的繁殖作用的推論相吻合。MOLLIARD 等[5，2，11]的試驗(yàn)均證實(shí)，羊肚菌的分生孢子均不能單獨(dú)萌發(fā)，也從另一個(gè)側(cè)面支持了本研究結(jié)果。

盡管在羊肚菌原基形成方面進(jìn)行了大量的研究工作，但是還需要在細(xì)胞學(xué)水平對分生孢子、活躍菌絲、芽基、菊花期等階段的核型進(jìn)行分析與研究，以進(jìn)一步完善所提出的新理論。