呂梁黑山羊成纖維細胞培養(yǎng)過程中霉菌污染的清除

吳蘇君，王 曦，李 希，羅惠娣，毛楊毅，賀東昌，周勝花，李春艷，張 麗，郭慧慧，薛麗娜，黨文慶

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

細胞培養(yǎng)作為一種體外增殖技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于教學(xué)、科研、臨床實驗、生物產(chǎn)品制備等領(lǐng)域，其雖然涉及因素繁多，但污染控制是其成功的關(guān)鍵?？赡芤l(fā)細胞發(fā)生污染的微生物有支原體、細菌、黑膠蟲、霉菌等，其中，霉菌污染在雨季或潮濕環(huán)境中尤為常見[1]。

細胞被霉菌污染后，其生長速度、細胞形態(tài)、生長特性均會受到不同程度的影響[2]。在霉菌污染發(fā)生早期，培養(yǎng)液變化肉眼幾乎不可見，倒置顯微鏡下觀察可見細胞間有樹枝狀的菌絲懸浮在培養(yǎng)液中[3]；在霉菌污染發(fā)生后期，肉眼可見培養(yǎng)液中有圓餅狀白色或淺黃色漂浮物，倒置顯微鏡下可見細胞間有縱橫交錯的菌絲，細胞生長分散、變圓漂起，脫落死亡[4]，這對細胞相關(guān)研究將產(chǎn)生嚴重影響。因此，發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)液被霉菌污染后應(yīng)盡快清除。常見的霉菌清除方法有動物體內(nèi)除菌法[5]、低速離心除菌法[6]、藥物除菌法[7]等，這些方法各有優(yōu)劣，本研究選用藥物除菌法。

呂梁黑山羊是山西省優(yōu)良的肉皮絨兼用地方品種，于1983 年被列入《山西省家畜家禽品種志》，是珍貴的畜種資源[8-9]。

本研究采集呂梁黑山羊耳部組織，體外培養(yǎng)耳源成纖維細胞[10-13]，添加不同濃度兩性霉素B 對細胞培養(yǎng)液中霉菌進行清除，比較不同濃度藥物的清除效果，進而構(gòu)建穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)體系，以期為后續(xù)研究呂梁黑山羊的種質(zhì)資源利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

呂梁黑山羊（0～3 月齡）耳緣組織采自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所克隆基地試驗羊場。

胎牛血清FBS 購自Hyclone 公司；DMEM 購自Gibco 公司；DPBS、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、Hoechst 33342，均購自Sigma 公司；兩性霉素B 溶液購自Biotopped 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。24 孔板及細胞培養(yǎng)皿購自Thermo 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 呂梁黑山羊耳緣成纖維細胞的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇 選擇0～3 月齡的呂梁黑山羊，獲取耳尖皮膚組織（1 cm2），4 h 內(nèi)帶回實驗室。將組織塊放入75%酒精中浸泡30 s 消毒，漂洗后剔除殘留毛發(fā)和軟骨組織剪成約1 mm2的小塊，均勻接種于60 mm 培養(yǎng)皿中，倒置培養(yǎng)4～6 h，待組織塊貼壁后，加入細胞培養(yǎng)液（DMEM＋1%雙抗＋15%FBS）3～4 mL，每隔2 d 更換一次培養(yǎng)液，5～7 d 后觀察組織塊周圍有無細胞遷出，待原代培養(yǎng)的單層細胞匯合度達到80%時，進行傳代培養(yǎng)或冷凍保存。細胞匯合度達到80%時，棄去培養(yǎng)液，DPBS 洗滌3 遍，加入0.2%胰蛋白酶消化細胞，終止消化后收集細胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，棄去上清液。如需傳代，加入細胞培養(yǎng)液重懸后均勻接種；如需凍存，加入預(yù)冷的凍存液（DMEM＋10%（V/V）DMSO＋15%（V/V）FBS，4 ℃保存）混勻，移入凍存管，在細胞程序降溫盒中－80 ℃冰箱過夜，后移至液氮罐中長期保存。細胞復(fù)蘇時，從液氮罐中取出凍存管，浸入37 ℃溫水中快速解凍，待完全融化后移入15 mL 離心管中加入細胞培養(yǎng)液至10 mL，1 000 r/min 離心5 min；棄上清液，加入細胞培養(yǎng)液重懸細胞，接種至60 mm 細胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃的5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，待細胞匯合度達到80%時即可傳代。

1.2.2 霉菌污染情況觀察 肉眼及高倍顯微鏡下觀察：疑為霉菌污染的細胞及對照組細胞在顯微鏡下直接觀察，根據(jù)培養(yǎng)液及細胞形態(tài)學(xué)變化，對比判斷有無污染。

1.2.3 霉菌污染后處理 疑為霉菌污染的細胞培養(yǎng)液中分別添加濃度為2.5，25，250 μg/mL 的兩性霉素B。細胞每天洗滌3 遍后更換培養(yǎng)液，正常培養(yǎng)傳代，在換液數(shù)小時后定時觀察細胞及培養(yǎng)液情況，連續(xù)處理14 d。

1.2.4 細胞生長曲線的測定 兩性霉素B 連續(xù)處理14 d 后，取霉菌污染消除且細胞恢復(fù)正常生長的試驗組和對照組，待細胞匯合度達到80%時，消化細胞，1 000 r/min 離心5 min 后棄上清液，加細胞培養(yǎng)液重懸，以1×104個/孔接種至24 孔板中培養(yǎng)。每24 h 計數(shù)細胞，每次計數(shù)重復(fù)3 次，取平均值，連續(xù)計數(shù)7 d 后，根據(jù)時間和細胞密度繪制細胞生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞原代、傳代培養(yǎng)及凍存、復(fù)蘇培養(yǎng)

通過組織塊貼壁培養(yǎng)法成功分離出呂梁黑山羊耳緣組織成纖維細胞，培養(yǎng)5～6 d 即可觀察到有細胞從組織塊邊緣向外遷出，培養(yǎng)10 d 后能清晰分辨出組織塊周圍有梭形且邊緣立體的成纖維細胞。形態(tài)學(xué)觀察可見細胞主要呈梭形、多角形或不規(guī)則形，細胞排列分散（圖1-A）；細胞傳代后生長狀態(tài)良好，形態(tài)正常（圖1-B）。

2.2 顯微鏡觀察霉菌污染情況

疑為霉菌污染的細胞肉眼下可觀察到淺黃色的漂浮物，呈薄蘑菇傘狀，有中心，可隨培養(yǎng)液晃動漂動，培養(yǎng)液有輕微渾濁；高倍顯微鏡下可觀察到從中心發(fā)散開去的菌絲，細胞分布稀疏，生長速度顯著降低，一些細胞變圓漂起，從皿底脫落。

2.3 藥物處理后霉菌及細胞狀態(tài)觀察

表1 3 組濃度兩性霉素B 處理霉菌污染的效果及細胞狀態(tài)

當(dāng)呂梁黑山羊細胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)霉菌污染時，對比不同濃度兩性霉素B 處理霉菌污染的效果及細胞狀態(tài)（表1）。由表1 可知，細胞培養(yǎng)液中兩性霉素B 的添加質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL 時，無法抑制培養(yǎng)液中霉菌繼續(xù)生長；兩性霉素B 的添加質(zhì)量濃度為250 μg/mL 時，細胞會大量死亡；兩性霉素B 的添加質(zhì)量濃度為25 μg/mL 時，既可抑制霉菌生長還可保持細胞活性，是發(fā)生霉菌污染時理想的使用濃度。

2.4 細胞生長曲線的繪制

選擇細胞培養(yǎng)液中添加兩性霉素B 質(zhì)量濃度為25 μg/mL 的試驗組和對照組繪制細胞生長曲線。根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，以單位細胞密度為縱坐標、培養(yǎng)時間為橫坐標繪制生長曲線，如圖2 所示，試驗組和對照組細胞生長曲線呈S 形分布，1～3 d 細胞處于適應(yīng)期，生長緩慢；3～6 d 細胞處于指數(shù)生長期，生長旺盛；6～7 d 細胞處于平臺期。試驗組細胞增殖能力剛開始稍弱于對照組，說明細胞需要一段時間逐漸恢復(fù)，之后恢復(fù)正常生長，霉菌污染已被去除。

3 結(jié)論與討論

細胞培養(yǎng)過程出現(xiàn)霉菌污染是常見且較難處理的問題。細胞被霉菌污染后，生長速度變慢，即使在不影響細胞存活率的條件下，霉菌產(chǎn)生的毒素也會破壞細胞DNA，對細胞造成損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，在短時間低劑量作用條件下，霉菌毒素并不會誘導(dǎo)DNA 出現(xiàn)損傷，而作用時間延長則可通過增加細胞內(nèi)活性氧含量造成氧化應(yīng)激，進而對DNA 造成損失，才顯示出其基因毒性，表明細胞對霉菌毒素有短期抵抗力。但霉菌毒素對動物機體的損傷比較明顯，它會增加動物相關(guān)臟器質(zhì)量和體質(zhì)量、引發(fā)胃腸功能紊亂，導(dǎo)致腹瀉、肝腫大和食欲減退[14-15]。細胞在霉菌污染后期，會由于毒性作用及營養(yǎng)耗盡而脫落死亡，對細胞相關(guān)研究產(chǎn)生嚴重影響。

通常情況下，細胞被霉菌污染后應(yīng)直接滅菌丟棄，但若細胞來源有限、難以替代或者污染不嚴重，就需要采取措施清除霉菌污染。對比清除霉菌的不同方法清除霉菌污染，各有優(yōu)缺點。楊衛(wèi)兵等[6]用低速多次離心去除法清除霉菌污染，對細胞損傷低，所需試驗條件簡單，但對人員要求較高，試驗中容易出現(xiàn)清除霉菌污染不徹底的現(xiàn)象。黃文敬等[16]在細胞培養(yǎng)基中加入適量的兩性霉素B，可以有效降低臍帶分離培養(yǎng)的污染率，且不影響臍帶間充質(zhì)干細胞的增殖和干性表達，但該試驗只針對霉菌污染的預(yù)防，未涉及霉菌污染的清除。趙世禎等[17]采用多次洗滌細胞和連續(xù)傳代的方法清除霉菌，簡單有效，但耗時長。吳介恒等[2]在培養(yǎng)液中添加正常劑量5 倍濃度的雙抗來清除早期的霉菌污染。田啟超等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在霉菌污染早期，細胞培養(yǎng)液中添加青霉素（100 IU/mL）、鏈霉素（100 IU/mL）、兩性霉素（10 μg/mL），隔天換液，重復(fù)2～3 次，同時細胞培養(yǎng)箱用飽和硫酸銅清潔后用過氧乙酸熏蒸，可有效控制霉菌污染，但操作繁雜，僅適用于霉菌污染發(fā)生早期。本研究為不影響后續(xù)細胞研究，徹底清除霉菌污染，采用細胞培養(yǎng)液中添加抗生素的方法。

多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素通過與細胞膜內(nèi)的固醇相互作用，改變細胞滲透性造成細胞內(nèi)容物外溢來發(fā)揮作用，對霉菌、絲狀真菌等有很好的抑制作用，且毒副作用較低[18]。其中，制霉菌素與兩性霉素B結(jié)構(gòu)類似，對真菌的敏感性較好[19]。制霉菌素多被用于抑制念珠菌，兩性霉素B 可廣泛用于抑制隱球菌、球孢子菌、念珠菌、毛霉、曲菌等，且毒性反應(yīng)較小[20]。由于霉菌種類鑒別耗時耗力，會延誤挽救細胞的時機，故本研究選用抗真菌范圍更廣的兩性霉素B 來清除細胞中的霉菌。黃文敬等[16]研究發(fā)現(xiàn)，將兩性霉素B 作為一種抗真菌、抗酵母菌以及抗霉菌制劑加入細胞培養(yǎng)液中使用時，通常有效的質(zhì)量濃度是25 mg/L，在30 mg/L 時有細胞毒性，會降低充質(zhì)干細胞的細胞增殖能力，但不影響細胞整體的增殖能力。楊衛(wèi)兵等[6]研究表明，兩性霉素B 使用濃度過高可致細胞死亡，濃度過低時則不能抑制霉菌生長。故本研究在細胞培養(yǎng)液中添加兩性霉素B時，設(shè)置3 組梯度濃度，結(jié)果顯示，在細胞培養(yǎng)液中加入2.5 μg/mL 的兩性霉素B，不能抑制霉菌生長，導(dǎo)致培養(yǎng)液隨時間延長而渾濁，細胞大量死亡；而加入250 μg/mL 的兩性霉素B 在抑制霉菌的同時還會導(dǎo)致細胞大量死亡，顯微鏡下可見大量細胞碎片，推測為兩性霉素B 濃度太高，對細胞生長不利；而在細胞培養(yǎng)液中加入25 μg/mL 的兩性霉素B，既可抑制霉菌生長還可保持細胞活性，是發(fā)生霉菌污染時理想的使用濃度。在細胞用兩性霉素B 處理14 d 后，繪制細胞生長曲線，發(fā)現(xiàn)細胞的生長和增殖速度均恢復(fù)正常。說明呂梁黑山羊成纖維細胞中的霉菌污染已被徹底清除，無復(fù)感。本研究在細胞被霉菌污染時及時使用兩性霉素B 對其進行清除，建立了一種細胞污染處理機制，在細胞培養(yǎng)實際工作中具有很高的操作性，實用性強，具有借鑒價值。

污染重在預(yù)防，在細胞培養(yǎng)過程中，要時刻警惕霉菌及其他污染，制定嚴格規(guī)范的細胞培養(yǎng)間日常管理消毒制度，定期對細胞、試劑、耗材、儀器進行污染檢測，規(guī)范實驗操作和記錄流程，把污染的可能性降到最低，提高試驗結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。