黑猩猩腸道菌群高通量測序分析

(杭州動物園，浙江 杭州 310008)

隨著社會的進步與發(fā)展，動物園的職能發(fā)生了轉變，動物種群管理與建設變得日益重要，杭州動物園內現(xiàn)有7只成年黑猩猩(Pantroglodytes)，保護和壯大現(xiàn)有黑猩猩種群已成為工作的重點。黑猩猩與人同屬人科，是現(xiàn)存與人類親緣關系最近的動物，堿基對序列排列上98.77%部分完全相同。

腸道菌群是生存在機體腸道內的微生物群，種類多，數(shù)量大，與機體的食物消化、營養(yǎng)吸收、能量代謝、免疫應答等生理活動密切相關[1]。國內腸道菌群研究主要對象為家禽家畜，也有部分為珍稀動物，包括川金絲猴、大熊貓以及虎等[2-6]，尚未有對黑猩猩腸道菌群的多樣性分析。本試驗采用高通量測序技術對黑猩猩腸道菌群的多樣性進行分析，希望能在維持腸道菌群平衡、保證動物健康方面提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗動物 杭州動物園飼養(yǎng)的7只成年黑猩猩，編號1-7：1號20歲雌性，2號12歲雌性，3號10歲雄性，4號9歲雄性，5號9歲雌性，6號8歲雄性，7號8歲雌性。采樣前后食物譜、飼養(yǎng)條件一致，各黑猩猩身體健康。

1.2樣品處理、數(shù)據分析 糞樣采集前一天晚上7只黑猩猩單籠飼養(yǎng)，于早上8點取樣，挑取少量新鮮糞便于已消毒的采樣管中，7個糞樣立即于-40 ℃冰箱保存。委托上海派森諾生物科技股份有限公司對樣品進行前處理、Illumina Miseq高通量測序及數(shù)據分析，測序片段為16S rDNA V3～V4可變區(qū)。主要利用FLASH軟件(v1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)，QIIME軟件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http://qiime.org/)對測序序列進行處理和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1有效序列與不同分類地位OTU數(shù) 表1中7個樣品測序獲得有效序列40622-55923條，從門到種的OTU(操作分類單元)數(shù)為1473-2145，1412-2082，1406-2076，1080-1768，425-1079，175-548，各樣品間波動較大，個體間差異明顯。7號樣品有效序列和各分類地位OTU均最少，門、綱、目、科水平OTU最高為5號樣品，有效序列最多為1號樣品，屬、種水平OTU最多的為1號樣品，有效序列量也最多。有效序列與各水平OTU有一定關聯(lián)性。

表1 有效序列與不同分類地位OTU數(shù)

2.2菌群微生物多樣性分析 從圖1可以看出，稀釋曲線隨著測序深度增加逐漸上升，并趨于平緩，說明測序結果能夠反映當前樣本所包含的多樣性。Shannon和Simpson為多樣性指數(shù)，Shannon和Simpson值越大，說明群落多樣性越高[7-9]。Chao1和ACE為豐富度估計指數(shù)，指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高[10-11]。各樣本的多樣性指數(shù)見表2，Shannon值在7.09-8.52之間，Simpson值在0.938380-0.987122之間，Chao1值在1475.00-2658.01之間，ACE值在1475.35-2682.28之間。7號樣品Simpson，Chao1和ACE值均為最小，分別為0.938380，1475.00和1475.35，Shannon值最小的為6號樣品，5號樣品的各指數(shù)值均最高，表明5號樣品的腸道菌群豐富度和多樣性最高，與有效序列和各水平OTU結果一致。

注：橫坐標為樣本抽取的有效序列數(shù)，縱坐標為OTU數(shù)目。圖1 稀釋曲線

樣品SimpsonChao1ACEShannon10.9579042248.222456.297.4020.9601082220.302386.697.2830.9690271753.001753.007.8740.9800091666.001667.117.9050.9871222658.012682.288.5260.9432662147.362217.667.0970.9383801475.001475.357.21

2.3門屬分類水平微生物組成分析

2.3.1門水平的微生物類群 所有樣品共含有14個菌門，平均含量前五的菌門為擬桿菌門(39.5%)，厚壁菌門(36.7%)，變形菌門(0.6%)，WPS-2(7.4%)，螺旋體(3.5%)，除2號和5號樣品的最優(yōu)勢菌群為厚壁菌門，其余個體均為擬桿菌門。2號和5號樣品沒有纖維桿菌門，僅3號，5號和6號樣品沒有互養(yǎng)菌門， 7號樣品僅有TM7， 4號和6號樣品僅有迷蹤菌門，除這四種菌門外其它均為共有，含量各異。

圖2 門水平的微生物類群組成

2.3.2屬水平的微生物類群 7個樣品中平均含量前七的菌屬為普氏菌屬(24.6%)，未分類瘤胃菌屬(12.6%)，琥珀酸弧菌屬(8.6%)，未分類WPS-2(7.4%)，未分類擬桿菌屬(4.9%)，未分類梭菌屬(4.9%)，未分類BS11(4.3%)，未分類的菌屬占比很大。2號樣品的最優(yōu)勢菌屬為未分類擬桿菌屬(18.4%)，7號樣品的最優(yōu)勢菌屬為未分類 BS11 (29.9%)，其它樣品的最優(yōu)勢菌屬均為普氏菌屬(23.6-34.3%)。

注：僅標注平均含量前七屬，共有102個屬較多不好標注。圖3 屬水平的微生物類群組成

2.4基于UniFrac距離的樣本聚類分析 各樣品的聚類分析見圖4，樣品間的分枝長度越短，兩樣本越相似，3和6號樣品相似度最高，其次為4和5號，2和7號，但3和6號，2和7號的多樣性指數(shù)相差較大，4和5號序列量、OTU數(shù)相差較大。

圖4 基于Unweighted UniFrac距離矩陣的UPGMA聚類分析圖

3 討論

7個樣品測序獲得有效序列40622-55923條，從門到種的OTU數(shù)為1473-2145，1412-2082，1406-2076，1080-1768，425-1079，175-548，多樣性指數(shù)Shannon值在7.09-8.52之間，Simpson值在0.938380-0.987122之間，Chao1值在1475.00-2658.01之間，ACE值在1475.35-2682.28之間，各樣品間波動較大，個體間差異明顯。樣品共含有14個菌門，11個菌門為共有，3個非共有菌門在各樣品中的含量各異，除2號和5號樣品的最優(yōu)勢菌門為厚壁菌門，其余個體均為擬桿菌門，2號和7號樣品的最優(yōu)勢菌屬分別為未分類擬桿菌屬、未分類 BS11，其它樣品的最優(yōu)勢菌屬均為普氏菌屬。聚類分析也體現(xiàn)出腸道菌群相似性中有差異性，引起差異性的原因可能是個體特異性，性別和年齡[12]，其差異性也體現(xiàn)了腸道菌群的復雜性。