慢性房顫犬脂肪墊Notch-1表達變化

班努·庫肯，買力旦木·艾克拜，鐘小蘭*

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 1.心內(nèi)科;2.心電圖室，新疆 烏魯木齊830028)

心房顫動(簡稱房顫)是臨床上最常見的快速心律失常，60歲以上人群中發(fā)生率高達1%，并且有很高的致殘率和致死率[1]。雖然房顫病因和發(fā)生機制的研究已經(jīng)取得了較大進展，治療卻依然令人棘手。心臟內(nèi)源性自主神經(jīng)系統(tǒng)主要由位于心臟表面、大血管附近的神經(jīng)節(jié)叢以及連接神經(jīng)叢的神經(jīng)纖維互相連接構(gòu)成。內(nèi)源性自主神經(jīng)系統(tǒng)的活性增高能夠極大地改變心房肌細(xì)胞的電生理特征，可增加房顫誘發(fā)的幾率，其中脂肪墊神經(jīng)叢在房顫的發(fā)生和維持中具有重要意義。Notch信號通路是一個高度保守的信號系統(tǒng)，在心血管發(fā)育等生理、病理過程中有重要的作用。Notch有4個Notch同源基(Notch1-4)和5個配體，Notch與配體 Jagged /Delta結(jié)合后，形 成 NICD進入細(xì)胞核，與RBP-Jκ結(jié)合一起激活下游靶基因Hes、Hey等靶基因的轉(zhuǎn)錄[2]。 Notch的激活與表達變化是否是房顫電重構(gòu)和神經(jīng)重構(gòu)中的一種普遍參與機制至今未見相關(guān)報道。本項目擬基于慢性起搏犬左心房致房顫模型的建立，研究慢性房顫犬竇房結(jié)脂肪墊(Sinoatrial node fat pad，SAN-FP)神經(jīng)叢中Notch-1蛋白表達變化及Notch-1、NICD含量變化，進一步闡明SAN-FP神經(jīng)叢Notch信號通路與房顫的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1研究對象 健康比格犬，體重18±2.66 kg，年齡7-9歲，雌雄不拘。動物質(zhì)量屬于一級標(biāo)準(zhǔn)。實驗設(shè)計及實施均經(jīng)過動物倫理委員會的審核批準(zhǔn)。

1.1.2實驗動物分組 實驗動物隨機分為2組，假手術(shù)組(n=5)：行微創(chuàng)開胸術(shù)，但不植入起搏器。房顫組(n=5)：微創(chuàng)開胸術(shù)，左心耳植入起搏器起搏8W。

1.2 實驗方法

1.2.1持續(xù)快速心房起搏(rapid atrial pacing，RAP)犬致房顫模型制作

術(shù)前動物禁食水12 h。常規(guī)消毒手術(shù)器械、手術(shù)服及手術(shù)環(huán)境。嚴(yán)格按照無菌技術(shù)要求操作。鹽酸氯胺酮注射液(20 mg/kg)肌肉注射基礎(chǔ)麻醉后，待犬的狀況穩(wěn)定后行氣管插管，呼吸機輔助呼吸，調(diào)節(jié)氧流量4-6 L/min，潮氣量為20 mL/kg，呼吸壓力0-2 Kpa。應(yīng)用LEAD-2000多道電生理記錄儀動態(tài)記錄犬正常II導(dǎo)聯(lián)心電圖。犬右側(cè)臥位，左側(cè)胸部剪除犬毛，用碘酒、酒精消毒切口后，應(yīng)用微創(chuàng)心臟外科技術(shù)作左腋下小切口，長約5-7 cm左右，以4-5肋的肋間隙為切口，逐層切開皮膚、皮下肌層，用合適的開胸器撐開切口，逐層開胸打開心包，暴露左心耳，采用荷包縫合，將起搏電極縫合固定于左心耳的底部，起搏電極用人的心房翼狀起搏電極，然后將電極尾端與實驗用動物埋藏式高頻心臟起搏器相連，將起搏器埋藏于胸部皮下囊袋內(nèi)，逐層縫合肌肉及皮下組織、皮膚。無菌紗布包扎切口。觀察犬的癥狀及體征。犬的一般情況穩(wěn)定，傷口拆線后開啟起搏器予以連續(xù)起搏8周。房顫定義為心房無序的電活動，心電圖表現(xiàn)為P波消失，代之以大小不等間隔不均，形態(tài)不一的 f 波，頻率 450-600次/分，RR間期不等，持續(xù) 10 s 以上。

脂肪墊定位：成年犬在術(shù)前12 h禁食，6 h禁飲，手術(shù)前洗澡。肌注氯胺酮(15 mg/kg)基礎(chǔ)麻醉，然后以3%的戊巴比妥鈉(20 mg/kg)靜脈注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上，分別在雙后肢、雙前肢和胸前刺入自制銀質(zhì)針頭，按照標(biāo)準(zhǔn)連接心電圖導(dǎo)線，動態(tài)記錄體表導(dǎo)聯(lián)心電圖。氣管插管后，剪除犬毛。取右側(cè)位，沿左側(cè)第4肋間剪開皮膚，分離皮下和肌肉組織，開胸器順肋間橫向撐開胸廓，切開心包制作心包吊籃，暴露心臟左心房和左上下肺靜脈，在主動脈根部和上腔靜脈中部之間可見一脂肪墊(SVC-Ao FP)，進行電生理測試之后將左側(cè)切口縫合。取左側(cè)臥位，沿右側(cè)第4肋間剪開皮膚，分離皮下和肌肉組織，開胸器順肋間橫向撐開胸廓，制作心包吊籃，在左心房和右上肺靜脈之間可見一脂肪墊(SAN- FP)。進行電生理測試之后將右側(cè)切口縫合。電生理測試：使用自制電極刺激心臟神經(jīng)叢的神經(jīng)元。參數(shù)如下：刺激頻率 20 Hz，脈沖持續(xù)時間 0.1 ms，刺激時間 50 ms，電壓1.6-2.4 V。此高頻刺激不會興奮心房，當(dāng)心率逐漸減慢達50%為脂肪墊所在位置。

1.2.2HE染色 (1)取2組SAN-FP組織切片烘片20分鐘后，二甲苯20分鐘，依次放入梯度乙醇中。(2)入蘇木精液染色5分鐘，加入1%鹽酸乙醇液分化數(shù)秒鐘，切片變紅。自來水沖洗；(3)切片置入75%乙醇伊紅液數(shù)秒鐘后，放入梯度乙醇中數(shù)秒脫水；(4)滴加中性樹膠于組織上，取清潔蓋玻片覆蓋，顯微鏡下觀察組織像。

1.2.3免疫組化測定 兩組實驗犬SAN-FP石蠟包埋，切片。采用SP免疫組化染色法對Notch-1染色。陰性對照以PBS代替一抗，Notch-1著色表現(xiàn)為胞漿染成棕褐色為陽性結(jié)果，分別計算陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.4雙抗體夾心法(ELISA)測定組織中Notch-1和NICD含量 用犬蛋白抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔板中依次加入犬心臟脂肪墊組織蛋白，再與HRP標(biāo)記的蛋白抗體結(jié)合，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD)值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中犬蛋白的濃度。

2 結(jié)果

2.1 模型制作完成情況手術(shù)完畢時及起搏8周后，房顫組制作犬慢性房顫模型成功率達到100%。起搏器開啟后，經(jīng)心電圖檢測，房顫組犬經(jīng)快速起搏左心耳均可成功誘發(fā)房顫。

2.2 脂肪墊定位及組織學(xué)特點電極刺激心臟脂肪墊后，假手術(shù)組實驗犬均未出現(xiàn)房顫，房顫組均出現(xiàn)房顫圖形，如圖1。將SAN-FP定位后行HE染色后可見脂肪細(xì)胞中散在分布的神經(jīng)叢，如圖2。

2.3 2組Notch-1表達變化假手術(shù)組SAN-FP蛋白表達呈深棕色，部分表達呈斑點分布在心臟表面神經(jīng)元。房顫組SAN-FP蛋白表達呈深棕色。2組SAN-FP 蛋白陽性表達計數(shù)結(jié)果顯示，假手術(shù)組有少量Notch-1蛋白表達。與假手術(shù)組比較，房顫組Notch-1蛋白表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；如圖3和表1。

圖1 房顫組犬SAN-FP刺激后電生理圖

圖2 SAN-FP的HE染色(×400) 圖3 2組SAN-FP內(nèi)Notch-1表達變化

表1 2組SAN-FP Notch-1蛋白陽性表達計數(shù)(個/視野，

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05。

2.4 2組SAN-FP內(nèi)Notch-1和NICD含量變化與假手術(shù)組比較，房顫組基線水平Notch-1和NICD濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗8周后，與假手術(shù)組相比，房顫組Notch-1和NICD濃度顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；如表2。

3 討論

心臟脂肪墊是一種具有調(diào)節(jié)器官生物活性的代謝器官，由于心外膜脂肪墊與心肌直接毗鄰，且兩者共用一套微循環(huán)系統(tǒng)，故心外膜脂肪墊產(chǎn)生的因子可以通過內(nèi)分泌或旁分泌機制直接作用于心房肌，對心外膜脂肪墊進行干預(yù)將可調(diào)節(jié)心臟內(nèi)在自主神經(jīng)系統(tǒng)的活性。長期持續(xù)性房顫使心房和脂肪墊自主神經(jīng)相關(guān)纖維、神經(jīng)節(jié)、受體等空間分布和遞質(zhì)發(fā)生變化，促進局部心肌發(fā)生結(jié)構(gòu)及神經(jīng)重構(gòu)，參與房顫發(fā)生或維持。Notch信號通路相關(guān)蛋白在心臟中均有表達，其過表達與缺乏均可造成心臟發(fā)育異常[3]。Notch 信號下游基因轉(zhuǎn)錄蛋白與心肌富含的心肌轉(zhuǎn)錄因子( GATA) 相結(jié)合，可抑制GATA介導(dǎo)的心肌基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)心臟基因的表達。GATA-4 直接影響心臟結(jié)構(gòu)基因的表達，包括α-肌球蛋白重鏈、肌鈣蛋白 C、心房利鈉肽、腦利鈉肽等，以及通過其鋅指結(jié)構(gòu)與其他心臟特異性的轉(zhuǎn)錄因子如 Nkx2-5、TBX5、胚胎成纖維細(xì)胞等相互作用形成復(fù)合物發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[4，5]。有研究證明，Notch信號通路在促進受損后心肌保護和心肌再生中發(fā)揮重要作用[6]。Yang等[7]研究顯示，在心肌缺血時Notch信號通路激活能夠顯著提高心臟收縮功能，減少梗死面積，抑制心肌細(xì)胞凋亡并促進新生血管的生成。同時研究證實，血管損傷后Notch受體和下游靶基因都會發(fā)生特征性的改變。Brandt等[8]研究顯示，在血管損傷實驗?zāi)Ｐ椭?，Notch信號通路中許多分子都發(fā)生了時序性改變，包括Notch1-3、Jagged1-2、Hey1-2。Gude等[9]研究顯示，Notch信號通路相關(guān)蛋白在心臟中均有表達，其過表達與缺乏均可造成心臟發(fā)育異常。Li等[10]提出了Notch募集干細(xì)胞、促進新生血管形成及介導(dǎo)細(xì)胞進一步分化等機制。Gude NA[11]等研究認(rèn)為Notch 信號途徑對心肌細(xì)胞具有保護作用，該作用是 Notch/Hey上調(diào)磷酸化AKt的表達，激活了磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKt/PKB)傳導(dǎo)途徑而實現(xiàn)的。Notch1信號通過與Akt、ERK、NRG1-ErbB 等信號通路相互作用而在心肌缺血損傷和心肌保護中發(fā)揮重要作用。上述國內(nèi)外資料顯示，Notch信號通路在心肌缺血和新生血管形成、心功能改善等方面發(fā)揮保護作用，使人們開始認(rèn)識到Notch信號通路可能參與了房顫的發(fā)生與維持。但在房顫發(fā)生中作用如何，干預(yù)其信號通路激活是否會產(chǎn)生抑制/啟動房顫作用?目前國內(nèi)外各種研究資料尚未有相關(guān)報道。本研究成功建立慢性房顫犬模型，結(jié)合電刺激SAN-FP定位，組織學(xué)切片顯示SAN-FP由大量的脂肪細(xì)胞、散在分布的神經(jīng)叢組成。免疫組化結(jié)果顯示SAN-FP神經(jīng)叢中可見Notch-1蛋白表達，房顫組SAN-FP內(nèi)Notch-1顯著表達，同時ELISA法顯示SAN-FP內(nèi)Notch-1和NICD含量明顯升高，結(jié)果顯示房顫發(fā)生發(fā)展過程中SAN-FP神經(jīng)叢內(nèi)Notch-1與配體結(jié)合后以NICD形式活化進而影響下游靶基因。同時Notch-1可能在房顫發(fā)生的不同時期表達，并受到SAN-FP內(nèi)脂肪細(xì)胞因子和神經(jīng)相關(guān)因子的調(diào)節(jié)，從而對心肌細(xì)胞的離子通道、功能蛋白分子發(fā)揮作用。

表2 2組Notch-1和NICD濃度變化

注 ：與基線水平比較，*P<0.05；與假手術(shù)組比較，#P<0.05。

Notch信號通路是高度保守的信號系統(tǒng)，通過Notch 配體與受體的相互作用而轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信號，從而精確調(diào)控心肌細(xì)胞的分化，在心血管發(fā)育等生理、病理過程中有重要的作用。心外膜脂肪墊自主神經(jīng)在房顫的發(fā)生或維持中所起的作用并不一定是“促進”，而更傾向于“協(xié)調(diào)”作用。本實驗將進一步研究：心臟脂肪墊內(nèi)神經(jīng)叢功能和結(jié)構(gòu)復(fù)雜，快速持續(xù)高頻電刺激心房肌可導(dǎo)致刺激脂肪墊內(nèi)神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)活性和功能及Notch信號通路中哪些靶基因發(fā)生量變和功能改變。