腫瘤微環(huán)境中CD4+Foxp3+Treg對(duì)鼻咽癌患者預(yù)后影響

張 勇

(洛陽(yáng)市中心醫(yī)院 耳鼻喉科,河南 洛陽(yáng)471000)

鼻咽癌為臨床常見(jiàn)一種頭頸部惡性腫瘤，具有種族性、地域性特點(diǎn)，因鼻咽癌經(jīng)治療后仍存在高復(fù)發(fā)傾向，對(duì)此篩選有效可影響預(yù)后因素對(duì)提高治療效果具有重要意義，傳統(tǒng)放化療效果有限，目前臨床以特異性免疫治療為探索新方向[1,2]。相關(guān)研究指出，免疫功能狀態(tài)為影響預(yù)后重要因素，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作為以免疫調(diào)節(jié)為主要功能細(xì)胞，在機(jī)體中發(fā)揮維持免疫、預(yù)防疾病發(fā)生等重要作用，F(xiàn)oxp3分子為T細(xì)胞中具有特異性標(biāo)志分子，輔助性T 細(xì)胞17(T helper type 17 cells，Th17)細(xì)胞歸為CD4+T細(xì)胞亞群，其中IL-17作為主要效應(yīng)分子起促炎癥作用[3,4]。為探究機(jī)體免疫反應(yīng)與鼻咽癌間的關(guān)系，本研究對(duì)患者血清以及癌組織中可反映免疫反應(yīng)的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年2月-2013年2月于我院收治的127例鼻咽癌患者作為研究對(duì)象，病理類型：泡狀核細(xì)胞癌29例，未分化鱗癌98例；T分期：T1期32例，T2期35例，T3期31例，T4期29例；N分期：N1期35例，N2期41例，N3a期13例，N3b期38例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均經(jīng)病理以及影像學(xué)檢查首次診斷為鼻咽癌；(2)臨床資料完整且配合檢查；(3)經(jīng)倫理會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽訂知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重心、肝、腎等功能不全者；(2)免疫系統(tǒng)疾病者；(3)合并其他惡性腫瘤者；(4)死于其他疾病以及意外死亡者。依據(jù)CD4+/CD8+值有無(wú)倒置分為異常組(CD4+/CD8+值<1.0)與正常組(CD4+/CD8+值≥1.0)，其中異常組78例，男41例，女37例，年齡28-63歲，平均(54.28±5.91)歲；正常組49例，其中男27例，女22例，年齡24-66歲，平均(54.16±5.47)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1血清免疫指標(biāo)監(jiān)測(cè)

清晨空腹抽取患者治療前以及對(duì)照組靜脈血3 ml，應(yīng)用貝克曼流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、Th17在CD4+T細(xì)胞比例等指標(biāo)，試劑盒由B&D公司提供并嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2癌組織標(biāo)本監(jiān)測(cè)

應(yīng)用免疫組化雙染法檢測(cè)CD4、Foxp3以及IL-17。把組織置于56℃恒溫箱并烘片約30 min，隨后進(jìn)行常規(guī)脫蠟、脫水、抗原修復(fù)，PBS清洗3次分別進(jìn)行滴加Ⅰ抗、Polymer/HRP37℃孵育30 min、滴加顯色劑DAB顯色。PBS清洗5次后分別進(jìn)行雙染阻斷劑室溫孵育4 min、滴加Ⅱ抗、室溫孵育11 min、Polymer/AP37℃孵育30 min、滴加顯色劑Permanment Red顯色。最后使用蘇木素復(fù)染1 min，利用自來(lái)水終止顯色并采用鹽酸酒精分化，再次使用蘇木素復(fù)染，待晾干后封片。應(yīng)用雙盲法由3名對(duì)病例資料不知情醫(yī)師對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判斷，CD4陽(yáng)性信號(hào)在淋巴細(xì)胞胞膜、Foxp3陽(yáng)性信號(hào)在淋巴細(xì)胞胞核以及IL-17陽(yáng)性信號(hào)在淋巴細(xì)胞胞漿，隨機(jī)選取5個(gè)不同并具有代表性的視野，在400倍高倍顯微鏡對(duì)視野下陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)并取平均值，統(tǒng)計(jì)各免疫細(xì)胞亞群密度。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)比較兩組患者血清免疫功能指標(biāo)。(2)觀察CD4、Foxp3及IL-17在癌組織表達(dá)情況，并分析CD4+Foxp3+Treg與患者無(wú)瘤生存時(shí)間、總體生存時(shí)間之間的關(guān)系。(3)分析CD4+/CD8+異常組與正常組生存率。(4)分析影響鼻咽癌預(yù)后因素。(5)分析CD4+Foxp3+Treg與臨床參數(shù)間相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CD4+/CD8+正常與異常兩組血清免疫功能指標(biāo)比較

異常組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、Th17在CD4+T細(xì)胞比例顯著低于正常組，CD8+顯著高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 兩組血清免疫功能指標(biāo)比較

2.2 CD4、Foxp3及IL-17在組織表達(dá)情況

CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞多表達(dá)于腫瘤間質(zhì)，其中位數(shù)為2.0/HPF，腫瘤癌巢浸潤(rùn)表達(dá)極少，而CD4與IL-17共定位未明確表達(dá)(詳見(jiàn)圖1、2)。以ROC曲線建立的CD4+Foxp3+Treg截?cái)嘀禐?.3，將巨噬細(xì)胞分為低表達(dá)組(n=45)與高表達(dá)組(n=82)。CD4+Foxp3+Treg與患者無(wú)瘤生存時(shí)間呈顯著正相關(guān)(P=0.031)，與總體生存時(shí)間呈正相關(guān)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.271)，詳見(jiàn)圖3，4。

2.3 患者CD4+/CD8+異常組與正常組KM生存率統(tǒng)計(jì)

對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪5年，CD4+/CD8+異?；颊?5例死亡，5年總生存率67.95%，正?；颊?例死亡，5年總生存率為89.80%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034)，詳見(jiàn)圖5。

圖1-2 CD4+Foxp3+ Treg、CD4+Foxp3+TH17細(xì)胞分別在鼻咽癌間質(zhì)中表達(dá)

圖3CD4+Foxp3+Treg與無(wú)瘤生存時(shí)間累積生存曲線 圖4CD4+Foxp3+Treg與總體生存時(shí)間累積生存曲線 圖5CD4+/CD8+異常組與正常組生存率比較

2.4 影響鼻咽癌預(yù)后因素COX回歸模型分析

以患者無(wú)瘤生存時(shí)間為因變量，性別、年齡、病理類型、N分期不是影響鼻咽癌預(yù)后獨(dú)立影響因素，T分期、CD4+/CD8+表達(dá)水平以及Th17是影響鼻咽癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素(均P<0.05)，詳見(jiàn)表2。

表2 影響鼻咽癌預(yù)后因素COX回歸模型分析

2.5 CD4+Foxp3+Treg與臨床參數(shù)間相關(guān)性

CD4+Foxp3+Treg與腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)密切相關(guān)，其低表達(dá)組轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率44.4%(20/45)顯著高于高表達(dá)組的25.6%(21/82)(P<0.05)。而與性別、年齡、T分期、N分期無(wú)顯著關(guān)系(P>0.05)，詳見(jiàn)表3。

表3 CD4+Foxp3+Treg與臨床參數(shù)間相關(guān)性

3 討論

鼻咽癌發(fā)病部位主要位于鼻咽黏膜被覆上皮，目前關(guān)于其發(fā)病原因尚未明確，多認(rèn)為與遺傳因素、吸煙飲酒、EB病毒等因素相關(guān)[5]。臨床一般采用放射治療措施，該治療措施具有較好局部控制率，可改善患者臨床癥狀，但因鼻咽位置特殊且較為隱蔽，早期臨床癥狀表現(xiàn)并不明顯，若未及時(shí)發(fā)現(xiàn)，易導(dǎo)致區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，生存質(zhì)量明顯降低[6]。目前可結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查等方式進(jìn)行鼻咽癌診斷，其中以病理學(xué)檢查為主，但仍存在漏診或誤診，基于此，臨床應(yīng)選擇有效指標(biāo)以判斷預(yù)后，從而采取針對(duì)性治療措施，提高患者生存率。

現(xiàn)代腫瘤免疫學(xué)顯示，腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等行為不僅與腫瘤細(xì)胞所發(fā)生分子事件有關(guān)，也與腫瘤微環(huán)境的生物學(xué)環(huán)境有關(guān)，還可以是腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境間相互作用形成[7]。因機(jī)體免疫功能低下可促使腫瘤發(fā)生發(fā)展，同時(shí)又可發(fā)揮抗腫瘤作用，其免疫狀態(tài)是由細(xì)胞免疫與體液免疫所決定的，其中細(xì)胞免疫反應(yīng)中的T細(xì)胞亞群在抗腫瘤免疫反應(yīng)中起主導(dǎo)作用，其功能復(fù)雜且數(shù)量較多，而CD4+與CD8+為反映T細(xì)胞亞群主要表面標(biāo)志，CD4+發(fā)揮重要調(diào)控作用在整個(gè)免疫系統(tǒng)功能中[8，9]。在正常狀態(tài)下，CD4+/CD8+比值保持平衡并決定免疫反應(yīng)總效應(yīng)，若比值失衡則表明免疫功能處于失調(diào)狀態(tài)。此外，T細(xì)胞中均表達(dá)Foxp3分子，其作為叉頭樣核轉(zhuǎn)錄因子家族成員，位于X染色體，是賦予T細(xì)胞免疫抑制功能主要分子[10，11]。T淋巴細(xì)胞可以在不同細(xì)胞因子影響下劃分CD4+T淋巴細(xì)胞亞型，并在TGF-β與IL-6共同存在影響下劃分為Th17細(xì)胞，可影響機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)[12，13]。大量臨床研究表明卵巢癌、肝癌等部分腫瘤患者外周血、腫瘤組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)可檢測(cè)到Th17細(xì)胞，而關(guān)于其在腫瘤中作用的意見(jiàn)則存在差異，部分研究認(rèn)為Th17細(xì)胞發(fā)揮抑制腫瘤作用，而有些則認(rèn)為Th17細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，甚至還有人認(rèn)為其未在腫瘤作用中發(fā)揮作用，僅起旁觀者作用。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞與其周邊組織組成，可以為腫瘤生長(zhǎng)、侵襲與轉(zhuǎn)移提供必要基礎(chǔ)[14，15]。因免疫耐受現(xiàn)象存在致使突變細(xì)胞未能對(duì)免疫監(jiān)視功能產(chǎn)生反應(yīng)，可進(jìn)一步引發(fā)腫瘤細(xì)胞逃逸。既往研究報(bào)道，T淋巴細(xì)胞在大部分腫瘤患者的外周血、腫瘤組織的數(shù)目與比例呈升高趨勢(shì)，并與患者預(yù)后相關(guān)性較強(qiáng)，鼻咽癌患者的腫瘤組織中也存在大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，影響疾病發(fā)生發(fā)展[16-18]。

本研究結(jié)果顯示，CD4+/CD8+異常組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、Th17在CD4+T細(xì)胞比例顯著低于正常組，CD8+顯著高于正常組，提示鼻咽癌患者免疫功能明顯下降，而Th17發(fā)揮著積極抗腫瘤作用，其免疫功能失常也可是導(dǎo)致鼻咽癌免疫耐受存在原因之一，推測(cè)其原因?yàn)槟[瘤產(chǎn)生免疫抑制，又受外界因素刺激，并且T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)是以腫瘤組織相溶性復(fù)合體分子抗原為基礎(chǔ)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，而這一特異反應(yīng)未能發(fā)揮應(yīng)有作用，從而為腫瘤發(fā)生發(fā)展提供有利環(huán)境，促使病情繼續(xù)發(fā)展。另應(yīng)用免疫組化法對(duì)鼻咽癌組織中的CD4+Foxp3+Treg與CD4+IL-17+Th17細(xì)胞表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，主要以腫瘤間質(zhì)中CD4+Foxp3+Treg為主，而CD4+IL-17+Th17較少表達(dá)，CD4+Foxp3+Treg與患者無(wú)瘤生存時(shí)間呈顯著正相關(guān)，與總體生存時(shí)間呈正相關(guān)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CD4+Foxp3+Treg也可作為臨床判斷鼻咽癌患者預(yù)后重要指標(biāo)，其表達(dá)水平越高，無(wú)瘤生存時(shí)間相應(yīng)也就越長(zhǎng)，在機(jī)體中發(fā)揮促免疫應(yīng)答功能作用，因此觀察患者鼻咽原發(fā)腫瘤微環(huán)境中免疫反應(yīng)可為判斷患者預(yù)后提供可靠參考價(jià)值，但本研究因選取病例數(shù)較少，仍需對(duì)預(yù)后進(jìn)一步觀察。此外，觀察CD4+/CD8+異常狀況對(duì)患者的生存情況影響，對(duì)患者隨訪5年，其結(jié)果顯示，CD4+/CD8+異?；颊叩?年總生存率67.95%顯著低于正?；颊?年總生存率89.80%，提示CD4+/CD8+低于正常者預(yù)后效果較差，也證明CD4+/CD8+可作為反映患者預(yù)后有效指標(biāo)，并且在治療前后醫(yī)護(hù)人員還應(yīng)當(dāng)重視對(duì)患者免疫功能狀態(tài)的觀察，采用可提高患者免疫功能狀態(tài)相應(yīng)治療措施，通過(guò)實(shí)施免疫調(diào)節(jié)治療以改善患者免疫功能的恢復(fù)。本研究還對(duì)影響患者預(yù)后情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示T分期、CD4+/CD8+表達(dá)水平以及Th17是影響鼻咽癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素，提示臨床應(yīng)及早對(duì)鼻咽癌進(jìn)行診斷，同時(shí)隨時(shí)監(jiān)測(cè)機(jī)體免疫功能以采取針對(duì)性治療措施改善預(yù)后。在此次研究中，結(jié)果還顯示CD4+Foxp3+Treg與腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)密切相關(guān)，可見(jiàn)其數(shù)量的增多在一定程度上可降低局部復(fù)發(fā)，但關(guān)于其是否可以降低死亡率仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。