松江鱸魚線粒體Cytb基因分析及其在種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用

魏建軍 尤宏?duì)? 夏蘇東 范國偉 高哲穎

摘要：為研究松江鱸魚的遺傳變異情況，以期對(duì)該魚種質(zhì)鑒定探索依據(jù)，采用PCR方法對(duì)11尾松江鱸魚的線粒體Cytb基因進(jìn)行擴(kuò)增、測序的方法，進(jìn)而構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明松江鱸魚屬間遺傳距離明顯大于同一屬內(nèi)的種間遺傳距離，形態(tài)生物學(xué)與杜父魚類更加接近，進(jìn)一步驗(yàn)證了松江鱸的分類地位為硬骨魚綱、鲉形目、杜父魚科，而并非是鱸形目的種類。松江鱸魚Cytb基因序列的測出為遺傳多樣性和種質(zhì)鑒定方面提供了參考數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：松江鱸魚（TrachidermusfasciatusHeckel）;線粒體Cytb基因;種質(zhì)鑒定

松江鱸魚（TrachidermusfasciatusHeckel），隸屬于鲉形目，杜父魚科，松江鱸魚屬，又名四鰓鱸、花鼓魚、媳婦魚等，主要分布于中國、菲律賓、日本以及朝鮮半島[1]。松江鱸魚味道鮮美，有著“江南第一名魚”之美稱，而且醫(yī)用價(jià)值極高，《本草綱目》中有“松江鱸魚，補(bǔ)五臟，益筋骨，和腸胃，益肝腎，治水氣，安胎補(bǔ)中，多食宜人”[2-3]。因此，松江鱸魚市場售價(jià)高達(dá)4000～6000元/kg，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高。但是，近幾十年由于野生資源遭到嚴(yán)重破壞[4]，松江鱸魚已被列為中國優(yōu)先保護(hù)魚類一級(jí)動(dòng)物名錄[5]，是國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物[1]。

細(xì)胞色素b（Cytochromeb，Cytb）是一種蛋白質(zhì)，它是由線粒體基因編碼而成，并且進(jìn)化的速度較為適中，學(xué)者們一致認(rèn)為它是解決分類和系統(tǒng)進(jìn)化問題相當(dāng)可信的一種分子標(biāo)記，所以說線粒體Cytb基因是研究各種魚類系統(tǒng)發(fā)育最普遍的分子標(biāo)記[6]。

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)用松江鱸魚于2017年8月采自天津水產(chǎn)研究所淡水試驗(yàn)站，試驗(yàn)魚體長5～7cm，體重20～25g，共11尾，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2實(shí)驗(yàn)方法

取松江鱸魚肌肉組織100mg左右，采用DNA提取試劑盒DNeasyBlood&TissueKit（德國，Qigen），按照試劑盒使用說明進(jìn)行基因組DNA提取，并將沉淀后的DNA溶解于蒸餾水（100μL）中，以4℃的條件進(jìn)行保存。用于擴(kuò)增松江鱸魚線粒體DNACytb基因的引物為SJ2F（5‘-ATCCCTGCTACAACCACCAA-3），SJ2R（5‘-GTAAAGTTGTCTGGGTCGCC-3）。PCR反應(yīng)體系如表1所示。

PCR的反應(yīng)條件：在95℃的環(huán)境下運(yùn)行5min，30s后退火，在72℃的環(huán)境下運(yùn)行1min，具體反應(yīng)體系見表1，總共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃的環(huán)境下終延伸10min。選擇擴(kuò)增產(chǎn)物（2μL）于瓊脂糖凝膠（1%）進(jìn)行電泳分析，并委托北京中美泰和科技有限公司進(jìn)行測序。

1.3數(shù)據(jù)處理

將測得的Cytb基因片段序列用MEGA5.2軟件中ClustalW方法進(jìn)行比對(duì)，并輔以人工校正。從GenBank庫中下載10種杜父魚的線粒體Cytb基因序列，以鱸魚Cytb基因序列作為外圍群，序列信息見表2。取下載物種Cytb基因5‘端756bp基因序列用于后續(xù)分析。使用DNAspv.5（LibradoandRozas2009）軟件計(jì)算變異位點(diǎn)，簡約信息位點(diǎn)數(shù)。使用MEGA5（Tamuraetal，2011）計(jì)算所得單倍型的堿基組成、單倍型間的轉(zhuǎn)換顛換頻率比值。利用MEGA5基于JC模型（Jukes-cantormodel，JC）計(jì)算遺傳距離，并利用MEGA5中的鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建基于JC模型的進(jìn)化樹。利用MEGA5基于HKY+G模型（Hasgawa-Kishino-Yanomodel，GammaDistributed）計(jì)算各種間的遺傳距離，并利用MEGA5中的鄰接法（Maximumlikelihood）構(gòu)建基于HKY+G模型的系統(tǒng)進(jìn)化樹，可靠性檢驗(yàn)（Bootstrap）次數(shù)為1000次。

2結(jié)果

2.1松江鱸魚Cytb序列

經(jīng)測序得到11尾試驗(yàn)松江鱸魚的Cytb基因5‘端756bp的核酸序列（圖1），該段序列共編碼252個(gè)氨基酸（圖2）。

2.2序列特征分析

松江鱸魚的Cytb基因結(jié)構(gòu)和一般的魚類相似，A、C、G、T的相對(duì)平均值依次為23.4%、32.1%、16.8%、27.7%。通過對(duì)基因序列進(jìn)行分析，可見松江鱸魚的Cytb基因嘧啶比例顯著大于嘌呤，且第2位密碼子嘧啶含量顯著大于嘌呤含量，具體見表3。第3位密碼子表現(xiàn)出反G偏倚，恰恰顯示出了脊椎動(dòng)物的屬性。

獲得的11條松江鱸魚序列共含有保守位點(diǎn)750個(gè)，占序列長度的99.2%。變異位點(diǎn)6個(gè)，其中簡約信息位點(diǎn)和單變異位點(diǎn)各占3個(gè)。這些基因序列共有6個(gè)位點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)換，0個(gè)位點(diǎn)發(fā)生顛換，與Cytb基因具有遺傳保守性相吻合，為種質(zhì)鑒定提供必要條件。

2.3遺傳距離

本試驗(yàn)采用Mega5軟件，通過Kimura2-parameter雙參數(shù)進(jìn)化模型計(jì)算出杜父魚科魚類和鱸魚Cytb基因序列的遺傳距離，具體可見表4。結(jié)果顯示，床杜父魚屬的棘頭床杜父魚和短角床杜父魚的遺傳距離最小（為0.061），其次為裸棘杜父魚屬的凹尾裸棘杜父魚和寬額裸棘杜父魚（為0.077）。吉氏雜鱗杜父魚與鱸魚的遺傳距離最大（0.253）。松江鱸魚與杜父魚科的其他魚類遺傳距離較近，在0.166～0.206之間，與鱸形目鰭科鱸魚的遺傳距離較遠(yuǎn)（0.237）。以上結(jié)果表明松江鱸魚屬間遺傳距離明顯大于同一屬內(nèi)的種間遺傳距離。

2.4系統(tǒng)發(fā)育樹

通過鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，詳細(xì)見圖3。結(jié)果表明，鱸魚作為外圍群自成一支，松江鱸魚與其他杜父魚科魚類聚成一支。在杜父魚科中，松江鱸魚組成了一個(gè)自展數(shù)據(jù)支持率高達(dá)100%的分支，恰恰說明了松江鱸魚和試驗(yàn)所選擇的杜父魚親緣較近，而與鱸魚的“關(guān)系”最遠(yuǎn)。松江鱸常常被大家叫為鱸魚，但實(shí)際上它與鱸魚的形態(tài)生物學(xué)差異很明顯，實(shí)則與杜父魚類更加接近。試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了松江鱸的分類地位為硬骨魚綱、鲉形目、杜父魚科，而并非是鱸形目的種類。

3結(jié)論

松江鱸魚Cytb基因序列的測出意義深遠(yuǎn)，尤其是為遺傳多樣性和種質(zhì)鑒定方面提供了參考數(shù)據(jù)，促進(jìn)該魚的種質(zhì)資源保護(hù)。本試驗(yàn)的成果也為其他魚類的種質(zhì)鑒定方法提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]汪松.中國瀕危魚類動(dòng)物紅皮書（魚類）[M].北京：科學(xué)技術(shù)出版社，1998.240-243.

[2]邵炳緒.松江鱸的生態(tài)初步觀察.復(fù)旦大學(xué)學(xué)報(bào)[J].1959（2）：213-218.

[3]邵炳緒.唐子英，孫幗英.松江鱸魚繁殖習(xí)性的調(diào)查研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1980，4（1）：81-86.

[4]趙建國，盛伯生，顧紅林，等.松江鱸魚（四鰓鱸）的人工繁殖試驗(yàn)[J].水產(chǎn)科技情報(bào)，1974（6）：12-15.

[5]“中國生物多樣性保護(hù)行動(dòng)計(jì)劃”總報(bào)告編寫組.中國生物多樣性保護(hù)行動(dòng)計(jì)劃[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，1994：83-84.

[6]章唯才，周曉平，陳小麟.基于細(xì)胞色素b基因的彩鷸系統(tǒng)分類研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，47：250-258.

（收稿日期：2019-07-29）