Mas 受體激動(dòng)劑激活RAS 非經(jīng)典通路對(duì)db/db 糖尿病小鼠胰島α細(xì)胞功能的影響

張 珍，云 鵬，柳 丹，劉春燕，黃辛煒，湯嘉豪，胡 丹，李芳萍

0 引 言

糖尿病的患病率逐年升高，給國(guó)民健康及社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成巨大危害。Unger 等［1］提出的“雙激素異常假說(shuō)”越來(lái)越受到研究者的關(guān)注，該假說(shuō)以為糖尿病是由于胰島素內(nèi)源性生成不足或胰島素抵抗與胰高血糖素不適當(dāng)分泌共同作用的結(jié)果。胰高血糖素不適當(dāng)分泌在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。如能發(fā)現(xiàn)調(diào)控胰高血糖素分泌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，將為防治糖尿病提供新的方法與手段。

經(jīng)典的腎素血管緊張素系統(tǒng)（renin angiotensin system，RAS）是氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)的重要來(lái)源。ACE2-Ang（1-7）-Mas非經(jīng)典通路是近年發(fā)現(xiàn)的RAS的新通路，與經(jīng)典Ang-AngⅡ-AT1R 通路相互制約，維持RAS 的自穩(wěn)調(diào)節(jié)和相對(duì)平衡。血管緊張素1-7（angiotensin1-7，Ang1-7）是該通路的主要效應(yīng)分子，主要由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin converting enzyme2，ACE2）水解AngⅡ產(chǎn)生，通過(guò)作用于Mas受體，發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗纖維化、舒張血管等拮抗ACE/AngII/AT1R 通路的功能［2-3］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典RAS 通路ACE/AngII/AT1R 對(duì)胰島α 細(xì)胞胰高血糖素分泌具有重要調(diào)控作用［4］，但RAS新通路ACE2-Ang（1-7）-Mas對(duì)胰高血糖素分泌有何影響仍然未知。AVE 0991為2002年合成的非肽類Mas受體激動(dòng)劑，化學(xué)名為5-甲酸基-4-甲氧基-2-苯基-1［［4-［2-乙胺羰基磺胺］-5-異丁烯-3-噻吩］-苯基］-甲基］-咪唑，分子式為C29H31N4NaO5S2，與Ang（1-7）作用位點(diǎn)相同，可模擬Ang（1-7）的諸多生物學(xué)效應(yīng)［5］。本研究擬采用db/db糖尿病小鼠，探討Mas受體激動(dòng)劑AVE0991對(duì)胰島α細(xì)胞胰高血糖素分泌功能的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8 周齡雄性2 型糖尿病db/db 小鼠，體重35～40 g，30 只及同周齡同窩出生的2 型糖尿病db/m 小鼠（diabetes misty mouse），體重20～25 g，15 只，由南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK 蘇2016-0012。飼養(yǎng)條件：SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度保持在23 ℃，相對(duì)濕度60%～70%，12～12 h亮暗周期，自由飲食飲水。動(dòng)物的處置均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物看護(hù)原則（NIH Publication no.85-23，修訂于1985年）。

1.2 主要儀器及試劑血糖儀（One Touch Ultra 美國(guó)Johnson）；CO2培養(yǎng)箱（BPN-170RWP，上海一恒）；熒光顯微鏡成像系統(tǒng)（CX41，日本Olympus）；微量注射 泵（日 本Terumo）；離 心 機(jī)（美 國(guó)Thermo）；9700PCR 儀（美國(guó)ABI）；Trizol 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Morinaga）；胰島素、胰高血糖素ELISA 試劑盒（日本Morinaga）；BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（日本Morinaga）；豚鼠抗人胰島素抗體、兔抗人胰高血糖素抗體、熒光標(biāo)記二抗、兔抗豚鼠GCK 一抗、羊抗兔GCK 二抗（美國(guó)Santa Cruz）；Ⅳ型膠原酶（美國(guó)Sigma）；AVE0991（美國(guó)MCE）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及干預(yù)30 只db/db 小鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為AVE 組和模型組，每組15 只。AVE 組每日固定時(shí)間給予AVE0991（20 mg/kg，等滲鹽水溶解為2 mg/mL）灌胃，模型組給予等容量的等滲鹽水灌胃，連續(xù)給藥6周。15只同周齡同窩出生的db/m 小鼠作為正常組，給予等滲鹽水灌胃。試驗(yàn)期間未使用胰島素及其他降糖藥。

1.3.2 生理生化指標(biāo)檢測(cè)每周監(jiān)測(cè)體重和隨機(jī)血糖，灌胃前和灌胃6周后鼠尾取血測(cè)定空腹血糖、空腹胰島素及胰高血糖素，血糖測(cè)定使用One Touch血糖儀，血漿胰島素、胰高血糖素測(cè)定使用ELISA法。

1.3.3 腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)灌胃6 周后，禁食15 h，每組取5 只行腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT）：給予500 mg/kg 葡萄糖腹腔注射，于0、30、60、120 min 采集鼠尾靜脈血測(cè)定胰高血糖素及血糖。

1.3.4 體外胰島灌流IPGTT 后各組小鼠行苯巴比妥麻醉后夾閉膽總管十二指腸乳頭開(kāi)口，體視顯微鏡下行膽總管穿刺后注射1 mg/mL 濃度的IV 型膠原酶2 mL，逆行進(jìn)入胰管使胰腺膨大后，迅速分離胰腺。將胰腺置于含Ⅳ型膠原酶1 mg/mL 的Hanks平衡液中消化40 min，去除膠原成份后多次振蕩洗滌，顯微鏡下成功分離胰島。鏡下手檢胰島，每孔50 個(gè)胰島，置于裝有Hanks 平衡液24 孔板中于CO2溫箱孵育2 h。將體外胰島灌流系統(tǒng)置于37℃水浴槽［6］，并將微量泵輸注系統(tǒng)與其連接。先使用含2.8 mmol/L 葡萄糖（低糖）的KRB 溶液充填至整個(gè)管道系統(tǒng)，在層析柱中加入100μL 預(yù)先配置好的葡聚糖凝膠，蓋緊硅膠塞密閉胰島艙。連接微量泵，先給予2.8 mmol/L 葡萄糖的KRB，以0.5 mL/h 速度灌流，30 min 后給予含16.7 mmol/L 葡萄糖（高糖）的KRB，以1 mL/h 速度灌流，每20 s 收集灌出液保存，5 min后改為每分鐘收集1 次灌出液，留待ELISA 法測(cè)定胰高血糖素水平。根據(jù)胰高血糖素濃度繪制胰高血糖素動(dòng)態(tài)分泌曲線。

1.3.5 免疫組化測(cè)定投藥6周后，每組選取5只小鼠，給予苯巴比妥鈉麻醉，經(jīng)心臟灌注等滲鹽水和4%多聚甲醛固定，剝離胰腺后置于4%多聚甲醛液中4～6 h，石蠟包埋，5μm厚度切片后于0.01 mmol/L的PBS中清洗3次。加入一抗（豚鼠抗人胰島素抗體1∶100 和兔抗人胰高血糖素抗體1∶400）后4 ℃孵育過(guò)夜（14 h），加入二抗（Cy3 熒光標(biāo)記山羊抗豚鼠IgG 抗體1∶100 和FITC 熒光標(biāo)記羊抗兔IgG 1∶100）室溫避光孵育1 h，PBS 沖洗后加入熒光抗萃滅封片劑后封片。顯微共聚焦熒光顯微鏡觀察胰島素和胰高血糖素染色情況。所有切片經(jīng)觀察拍照獲得數(shù)字照片后，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析。每只小鼠隨機(jī)選取15張胰島照片，每組分析至少45張胰島照片。計(jì)算胰島α（或β）細(xì)胞含量的公式如下：

1.3.6 GCK mRNA 表達(dá)檢測(cè)每組選取5 只小鼠，采用qRT-PCR 法檢測(cè)胰島GCKmRNA 的表達(dá)。引物設(shè)計(jì)根據(jù)GeneBank提供的基因序列：GCK上游5′-GTGGTGCTTTTGAGACCCGTT-3′，下 游5′-TTCGATGAAGGTGATTTCG-3′；β-actin 上 游5′-TCATCACTATCGGCAATG-3′，下游5′-ACAGCACTGTGTTGGCAT-3′，由Invitrogen公司合成。提取胰島并勻漿化，Trizol 法提取總RNA。cDNA 合成條件為：37 ℃15 min，85 ℃5 s。按照PCR試劑盒配置反應(yīng)體系后進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃60 s，預(yù)變性；95 ℃15 s、60 ℃15 s、72 ℃45 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3.7 GCK 蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blot 方法檢測(cè)。將分離的胰島勻漿化，PBS 清洗2 次，使用細(xì)胞溶解液消化1 h，1000 r/min 離心10 min（離心半徑3 cm），收集上清液，采用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白質(zhì)樣品稀釋至相同且合適的濃度后行SDS-PAGE 電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上在5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉1 h，加入兔抗豚鼠GCK 抗體（1∶800），室溫培育1 h 后加入羊抗兔IgG 二抗（1∶2000），室溫培育2 h。最后加入ECL顯色液置于UVP 圖像成像儀中觀察并分析結(jié)果。條件設(shè)置為曝光124 minCCD 自動(dòng)獲取圖像。以β-actin 作為內(nèi)參對(duì)照。以目的條帶的灰度對(duì)β-actin 灰度的比值代表組織中目的蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生理生化指標(biāo)AVE0991干預(yù)前，AVE組和模型組小鼠體重、空腹血糖、空腹胰島素及胰高血糖素水平均高于正常組（P＜0.05）。干預(yù)6 周后，AVE組小鼠空腹血糖、空腹胰島素水平均明顯低于模型組（P＜0.05），但高于正常組（P＜0.05）。正常組干預(yù)前后體重、空腹血糖、空腹胰島素及胰高血糖素水平均無(wú)明顯改變（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組干預(yù)前后生理生化指標(biāo)()Table 1 Physiological and biochemical indicators before and after intervention()

表1 各組干預(yù)前后生理生化指標(biāo)()Table 1 Physiological and biochemical indicators before and after intervention()

與正常組干預(yù)前比較，*P＜0.05；與模型組干預(yù)后比較，#P＜0.05

組別n 體重（g） （m血mo糖l/L） （胰m島U/素L）胰（高p m血ol糖/L）素正常組干預(yù)前1523.7±0.76.1±0.65.2±0.521.4±2.6干預(yù)后1526.5±0.56.3±0.5#5.7±0.3#19.4±1.5模型組干預(yù)前1537.2±0.3*17.5±2.4*15.1±1.0*28.5±3.2*干預(yù)后1542.2±1.225.3±3.017.3±1.829.1±1.7 AVE組干預(yù)前1537.5±0.2*18.2±2.7*15.3±1.2*28.1±2.8*干預(yù)后1541.3±0.819.1±0.8#14.1±0.527.7±2.0#

2.2 糖耐量及胰高血糖素分泌功能在糖負(fù)荷后30、60 和120 min，AVE 組血糖值和胰高血糖素水平均低于模型組，但仍高于正常組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 體外胰島胰高血糖素分泌功能低糖灌流時(shí)，正常組小鼠胰島的胰高血糖素分泌水平［（20.6±0.5 pmol/L）］低于模型組［（29.1±0.7）pmol/L）］及AVE 組［（27.6±0.8）pmol/L］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），然而，AVE 組與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。正常組小鼠胰島在高糖灌流后15 min 左右胰高血糖素分泌水平即出現(xiàn)顯著降低，之后緩慢下降，說(shuō)明高糖對(duì)正常組小鼠胰高血糖素分泌有抑制作用。而模型組小鼠胰島在高糖灌流后胰高血糖素分泌水平出現(xiàn)明顯升高，60 min 時(shí)達(dá)42 pmol/L，說(shuō)明高糖會(huì)刺激模型組小鼠胰高血糖素的分泌。高糖灌流后AVE 組胰高血糖素水平也有所升高，30min 時(shí)升至峰值36 pmol/L。與模型組比較，AVE組高糖灌流30、60 min 高血糖素水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

表2 IPGTT血糖及胰高血糖素水平（）Table 2 Blood glucose and glucagon results of IPGTT（）

表2 IPGTT血糖及胰高血糖素水平（）Table 2 Blood glucose and glucagon results of IPGTT（）

與AVE組同一時(shí)間同一指標(biāo)比較，*P＜0.05

組別n 血糖（mmol/L） 胰高血糖素（pmol/L）正常組0 min56.3±0.5*19.4±1.5*30 min57.5±0.2*15.9±1.0*60 min57.3±0.5*14.1±1.3*120 min5 6.1±0.3*14.0±0.9*模型組0 min525.3±3.0*29.1±1.7*30 min529.5±2.5*37.2±1.6*60 min534.7±2.3*38.6±1.3*120 min5 33.5±4.1*35.8±1.9*AVE組0 min519.1±0.827.7±2.0 30 min523.4±1.930.3±1.2 60 min520.5±1.527.2±1.8 120 min518.5±0.625.1±1.6

2.4 胰島α及β細(xì)胞含量正常組小鼠胰島β細(xì)胞（紅色）占比大，位于胰島中央，α細(xì)胞（綠色）零星分布于胰島周邊；模型組小鼠β 細(xì)胞含量較正常組顯著降低（P＜0.05），α 細(xì)胞含量顯著增加（P＜0.05），且由胰島周邊向中間遷移；與模型組小鼠相比，AVE組小鼠β 細(xì)胞含量增加，α 細(xì)胞含量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。半定量分析表明模型組胰島α 細(xì)胞含量較正常組明顯升高，β 細(xì)胞含量較正常組明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，AVE組胰島α 細(xì)胞含量明顯降低，β 細(xì)胞含量明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.5 胰島GCK的表達(dá)模型組胰島GCK mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯低于正常組（P＜0.05）；與模型組比較，AVE 組GCK mRNA 及蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖1 各組胰島體外灌流胰高血糖素分泌Figure 1 Glucagon secretion from islet perfusion

圖2 鏡下觀察各組小鼠胰島細(xì)胞（免疫組化染色）Figure 2 Immunohistochemical staining of islets of each group（IHC）

表3 各組胰島α 與β 細(xì)胞含量(,mg)Table 3 Contentsofislet αandβcellsineachgroup(mg)

表3 各組胰島α 與β 細(xì)胞含量(,mg)Table 3 Contentsofislet αandβcellsineachgroup(mg)

與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別nα細(xì)胞含量 β細(xì)胞含量正常組51.2±0.34.8±0.3模型組53.3±0.7*2.4±0.6*AVE組51.8±0.4#4.2±0.5#

圖3 各組胰島GCK的表達(dá)水平Figure 3 Expression levels of GCK in islets of each group

3 討 論

ACE2-Ang（1-7）-Mas 通路是RAS 的重要分支，對(duì)血糖調(diào)節(jié)具有重要作用。以往關(guān)于ACE2-Ang（1-7）-Mas 通路對(duì)血糖調(diào)節(jié)的研究大多集中于對(duì)胰島素的分泌及其作用方面［7-8］，本研究首次發(fā)現(xiàn)Mas 受體激動(dòng)劑AVE0991 可通過(guò)抑制db/db 糖尿病小鼠糖負(fù)荷后胰高血糖素的分泌而降低血糖，揭示了RAS非經(jīng)典通路ACE2/Ang（1-7）/Mas 對(duì)胰島α 細(xì)胞功能的調(diào)控作用。

胰高血糖素是胰島α 細(xì)胞分泌的由29 個(gè)氨基酸組成的肽類激素。作為胰島素的主要拮抗激素，胰高血糖素主要通過(guò)促進(jìn)糖異生及糖原分解來(lái)升高血糖，防止低血糖發(fā)生。在生理狀態(tài)下，進(jìn)餐后血糖濃度升高可抑制胰高血糖素的分泌。然而，無(wú)論1 型還是2 型糖尿病患者均存在胰高血糖素分泌抑制受損，餐后血糖濃度升高并不能抑制胰高血糖素的分泌，甚至?xí)M(jìn)一步促進(jìn)其分泌，造成肝糖輸出增加和血糖水平的進(jìn)一步惡化［9］。本研究通過(guò)體外胰島灌流系統(tǒng)評(píng)估糖負(fù)荷后胰高血糖素的動(dòng)態(tài)分泌功能。結(jié)果顯示在低糖灌流時(shí)db/db 糖尿病小鼠胰高血糖素水平明顯高于db/m 小鼠，高糖灌流后15 min 左右db/m 小鼠胰高血糖素分泌即出現(xiàn)明顯下降，而db/db 糖尿病小鼠胰高血糖素分泌水平較低糖灌流時(shí)明顯升高，激活A(yù)CE2/Ang（1-7）/Mas 通路可使高糖灌流后db/db 糖尿病小鼠胰高血糖素升高的幅度及持續(xù)時(shí)間減少。

在生理狀態(tài)下，胰島α 細(xì)胞約占胰島細(xì)胞總數(shù)的20%，而β 細(xì)胞約占75%。胰島α 與β 細(xì)胞比例適當(dāng)是維持血糖穩(wěn)態(tài)平衡的重要基礎(chǔ)［10］。糖脂毒性引起的胰島局部氧化應(yīng)激加劇可造成胰島β細(xì)胞凋亡增加或β 細(xì)胞去分化，去分化后的胰島β 細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為分泌胰高血糖素的α 細(xì)胞。因此，糖尿病時(shí)胰島α 與β 細(xì)胞比值增加。Cinti 等［11］發(fā)現(xiàn)2 型糖尿病患者胰島內(nèi)分泌細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，但β 細(xì)胞減少了32%，α 細(xì)胞增加了68%。本研究通過(guò)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)db/db 糖尿病小鼠胰島細(xì)胞總數(shù)量較db/m 小鼠無(wú)顯著差異，但胰島α 細(xì)胞數(shù)量約為db/m 小鼠的3 倍，β 細(xì)胞數(shù)量不足db/m小鼠的1/2，而激活A(yù)CE2/Ang（1-7）/Mas 通路可部分逆轉(zhuǎn)db/db 糖尿病小鼠胰島細(xì)胞比例的失衡。那么激活A(yù)CE2/Ang（1-7）/Mas 通路逆轉(zhuǎn)db/db 糖尿病小鼠胰島細(xì)胞比例失衡的機(jī)制是什么？胰島的發(fā)育受一系列轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，如胰腺十二指腸同源盒-1可促進(jìn)胰島β 細(xì)胞的增殖與分化，而配對(duì)盒基因6可促進(jìn)胰島α 細(xì)胞的增殖與分化[12-13]。激活A(yù)CE2/Ang(1-7)/Mas 通路對(duì)糖尿病小鼠胰島α 與β 細(xì)胞數(shù)目的影響是否是通過(guò)影響上述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)而產(chǎn)生尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

調(diào)節(jié)胰高血糖素分泌的因素眾多，包括葡萄糖、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，胰島素、生長(zhǎng)抑素、γ-氨基丁酸等旁分泌激素，以及神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等［14］。其中，葡萄糖濃度升高是抑制胰高血糖素分泌的最直接因素。當(dāng)血糖濃度升高時(shí)，葡萄糖經(jīng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 轉(zhuǎn)運(yùn)到α 細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)GCK 催化并在線粒體內(nèi)分解代謝產(chǎn)生ATP，使ATP/ADP 升高，導(dǎo)致ATP 敏感性鉀通道關(guān)閉及細(xì)胞膜去極化，使T 型鈣通道和電壓依賴的鈉通道失活，N 型及L 型鈣通道關(guān)閉，鈣內(nèi)流減少，胰高血糖素分泌受到抑制［15］。糖尿病時(shí)胰島α 細(xì)胞葡萄糖的敏感性下降可能與GCK 表達(dá)降低有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)α 細(xì)胞GCK 基因敲除小鼠可出現(xiàn)餐后胰高血糖素水平升高及糖耐量異常［16］。并且，GCK 激動(dòng)劑可抑制α 細(xì)胞胰高血糖素分泌［17］。本研究發(fā)現(xiàn)激活A(yù)CE2/Ang（1-7）/Mas通路可增加胰島GCK 的表達(dá)，這可能也是激活A(yù)CE2/Ang（1-7）/Mas通路抑制胰高血糖分泌的原因之一。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)激活RAS 非經(jīng)典通路ACE2/Ang（1-7）/Mas 可通過(guò)降低db/db 糖尿病小鼠糖負(fù)荷后胰高血糖素分泌改善糖代謝紊亂，其機(jī)制可能與糾正胰島α 細(xì)胞與β 細(xì)胞比例失衡及增強(qiáng)胰島GCK的表達(dá)有關(guān)。