雜交石斑魚干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）基因的克隆及表達(dá)分析

盧曉穎 黃寶松 馬騫 陳剛 王忠良 黃建盛 ERIC AMENYOGBE 謝瑞濤，2 鄧文鑫，3

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2. 廣東恒興飼料實(shí)業(yè)股份有限公司，湛江 524000；3. 廣東粵海飼料集團(tuán)有限公司，湛江 524088）

先天性免疫是低等脊椎動(dòng)物機(jī)體抵抗病毒和細(xì)菌的第一道防線［1］，而先天性免疫抵抗病毒的入侵主要依賴于模式識(shí)別受體對(duì)病毒成分的識(shí)別，模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptor，PRRs）主要有Toll樣受體、NOD樣受體和RIG-I樣受體［2］。一旦PRRs識(shí)別到病毒核酸，可導(dǎo)致由干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory factor3，IRF3）介導(dǎo)的I型干擾素（Interferon，IFN）的分泌，從而阻止病毒的復(fù)制，即病毒感染后，IRF3在C端富含絲氨酸的區(qū)域被多個(gè)絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化激活，導(dǎo)致磷酸化的IRF3從細(xì)胞質(zhì)到核的易位，并與IFN-β基因的特定啟動(dòng)子原件結(jié)合，啟動(dòng)該基因的轉(zhuǎn)錄。而I型干擾素的的正反饋調(diào)節(jié)是由IFN-β基因通過激活JAK-STAT信號(hào)通路傳導(dǎo)的。干擾素調(diào)節(jié)因子家族（Interferon regulatory factor，IRF）具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的生物學(xué)功能，在魚類IRF家族中，主要有11個(gè)成員（IRF1-11），其中IRF3在先天免疫抵抗病毒的系統(tǒng)中扮演著重要的角色［3］。有研究表明，過表達(dá)歐洲鯽魚IRF3可以激活I(lǐng)FN產(chǎn)生，進(jìn)而通過STAT1通路觸發(fā)干擾素刺激基因（IFN-stimulated genes，ISGs）轉(zhuǎn)錄［4］。IRF3是廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在病毒識(shí)別后，控制著IFN和ISGs的表達(dá)［5］，在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中，IRF3在所有組織中均有表達(dá)。

聚肌胞苷酸（PolyI：C）是雙鏈RNA（dsRNA）的類似物，具有誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素（IFN）的能力和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬、殺菌功能的作用。目前，國內(nèi)外研究獲得了魚類中IRF家族的多個(gè)基因［6］，已有許多關(guān)于IRF3基因序列分析及功能研究的報(bào)道。例如，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）和聚肌胞苷酸（PolyI：C）都可以使虹鱒IRF3基因表達(dá)量上調(diào)［7］；大黃魚中，IRF3和IRF7在LPS和PolyI：C刺激后表達(dá)量均顯著性上調(diào)［8］，在大西洋鮭中，MyD88基因與IRF3和IRF7相互作用，調(diào)節(jié)IRF誘導(dǎo)的IFN應(yīng)答［9］；PolyI：C刺激的情況下，過表達(dá)IRF3能很大提高IFN的轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果表明在雙鏈病毒刺激后，I型IFN的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是由IRF3調(diào)節(jié)的［10］；研究表明IRF3在魚類機(jī)體抗病毒中扮演著重要的角色。

石斑魚（Epinephelusspp.）主要分布在沿岸島嶼附近的巖礁、砂礫和珊瑚礁地質(zhì)的海區(qū)，以其味道鮮美，營養(yǎng)豐富成為熱帶和亞熱帶地區(qū)最受歡迎的品種之一，也是中國沿海重要的海水養(yǎng)殖品種之一，在中國和東南亞國家廣泛養(yǎng)殖。近年來由于虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）和神經(jīng)壞死病毒的出現(xiàn)、使石斑魚死亡率超過90%，給石斑魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失［11-12］。種質(zhì)資源的退化表現(xiàn)之一為抗病力的下降，為解決這些問題，雜交技術(shù)已被引入到石斑魚育種中。本課題組前期開展了褐點(diǎn)石斑魚（E. fuscoguttatus，♀）× 清水石斑魚（E.polyphekadion，♂）雜交育種研究，并成功培育出雜交子一代，在雜交石斑魚仔、稚魚階段的攝食與生長狀況進(jìn)行了研究［13］。

本研究選取了雜交石斑魚作為研究對(duì)象，克隆了雜交石斑魚IRF3基因的全長、序列分析，以及IRF3在健康雜交石斑魚不同組織中的表達(dá)情況，檢測了PolyI：C（病原模擬物）刺激外周血淋巴細(xì)胞IRF3的時(shí)序性表達(dá)，進(jìn)一步了解雜交石斑魚IRF3基因應(yīng)對(duì)病毒刺激的表達(dá)情況，旨在為IRF3在雜交石斑魚抵御病毒的后續(xù)研究中奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 雜交石斑魚取自于廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地，平均體重（250±5g），暫養(yǎng)于水溫為27±2℃的循環(huán)水系統(tǒng)中一周，每日早晚各投喂1次。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒和RNA提取試劑盒購自北京全式金生物有限公司，DH5α感受態(tài)細(xì)胞、LA Taq DNA 聚 合 酶、pMD18-Tvector、SMARTer?RACE 5'/3' Kit均購自TaKaRa公司，polyI：C購自sigma公司，SYBR?Select Master Mix購自羅氏公司，percoll細(xì)胞分離液購自MPBIO公司。

1.1.2 外周血淋巴細(xì)胞（PBL）和組織的收集 首先，將魚置于50 mg/L丁香酚中麻醉，用75%酒精棉球擦拭體表，用肝素鈉潤洗過的一次性針管抽取尾靜脈外周血，與PBS（含有1%肝素鈉）輕輕顛倒混勻（PBS∶血液=1∶1），取2 mL 25% percoll分離液于15 mL離心管中，緩慢加入2 mL稀釋的血液置于分離液上層，水平離心機(jī)2 000 r/min離心15 min，收集白膜層細(xì)胞，PBS洗滌3次。用L-15細(xì)胞培養(yǎng)液重懸PBL（10×106cell/mL），96孔板中每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液（106cells/well）［14］，實(shí)驗(yàn)組加入50 μg/mL PolyI：C 刺激［15］，對(duì)照組加入等量 PBS，于22℃培養(yǎng)，0 h、1 h、4 h、8 h和12 h分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，加入800 μL TRIzol，-80℃超低溫冰箱保存。脾臟、胃、腸、鰓、肝臟、心臟、腦、肌肉和頭腎等9個(gè)組織分別采集于4尾健康的雜交石斑魚，收集到的組織立即投入液氮中冷凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈合成 運(yùn)用TRIzol法提取雜交石斑魚各組織和PBL（7×107cell）總RNA，用紫外分光光度計(jì)和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和質(zhì)量，根據(jù)EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix使用說明書合成cDNA；按照 SMARTer?RACE 5'/3' Kit說 明書制備 cDNA，-20℃保存。

1.2.2IRF3基因的克隆 從本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選出注釋為IRF3的unigene。經(jīng)Blast比對(duì)驗(yàn)證后，設(shè)計(jì)特異性引物用于中間片段和全長序列的擴(kuò)增（表1），采用IRF3-F1與IRF3-R1，IRF3-F2與IRF3-R2為引物擴(kuò)增中間片段，測序、拼接，成功驗(yàn)證了中間片段，根據(jù)已知片段各設(shè)計(jì)兩條5'/3'RACE 引物（GSP3'-F1/F2和 GSP5'-R1/R2，表1）。運(yùn)用巢式PCR技術(shù)獲取5'和3'末端序列，首先以GSP3'-F1和Long primer、GSP5'-F1和Long primer引物進(jìn)行第一次擴(kuò)增，引物GSP3'F2和Short primer、GSP5'-F2和Short primer進(jìn)行第二次擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用全式金膠回收試劑盒回收目的條帶，并將片段導(dǎo)入到pMD-18vector中，再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中37℃培養(yǎng)16 h，挑取3個(gè)單克隆菌落送上海生物工程有限公司測序。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.2.3 生物信息學(xué)分析 根據(jù)雜交石斑魚IRF3測序結(jié)果，序列以DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，得到該基因全長cDNA序列。應(yīng)用BLAST網(wǎng)站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源性比對(duì)分析；開放閱讀框（ORF）和氨基酸序列預(yù)測采用在線網(wǎng) 站（ORF finder：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）；SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線查找蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；通過Blastp（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜尋同源氨基酸序列，采用Clustalx1.83進(jìn)行序列的多重比對(duì)；使用MEGA6.0軟件鄰位相連法（Neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4IRF3基因組織差異表達(dá)和PolyI：C浸染后IRF3基因在PBL中的時(shí)序性表達(dá) 根據(jù)已獲得的雜交石斑魚IRF3基因cDNA序列，設(shè)計(jì)qPCR引物為qIRF3-F、qIRF3-R（表1），以雜交石斑魚β-actin為內(nèi)參，用SYBR Green I熒光定量試劑盒（聚研生物科技有限公司）在實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增儀（Light cycler 96）上進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增檢測。檢測IRF3基因在雜交石斑魚肝、胃、鰓、腸、脾臟等9種組織中的表達(dá)，以及在PolyI：C刺激0 h、1 h、4 h、8 h和12 h后雜交石斑魚IRF3基因在PBL中的表達(dá)水平情況。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共45個(gè)循環(huán)。每組樣品重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT方法。結(jié)果使用SPASS 19.0軟件對(duì)相同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 IRF3基因全長cDNA序列的克隆和氨基酸序列分析

用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接得到雜交石斑魚IRF3基因cDNA序列（GenBank序列登錄號(hào)為MK040456）全長為2 529 bp，含有1 377 bp的開放閱讀框，5'非編碼區(qū)（Untranslation region）長度為325 bp，3'非編碼區(qū)長度為916 bp，在該基因PolyA上游629 bp處發(fā)現(xiàn)脊椎動(dòng)物中常見的終止信號(hào)（AATAAA）（圖1）。ORF-finder在線分析結(jié)果顯示，雜交石斑魚IRF3基因ORF編碼458個(gè)氨基酸（圖1），利用SMART在線分析軟件，發(fā)現(xiàn)IRF3氨基酸序列含有1個(gè)N-末端DNA結(jié)合區(qū)（N-terminal DNA binding region，DBD）（1-108 aa）、1 個(gè) C-末端干擾素相關(guān)區(qū)（C-terminal interferon related region，IAD）（255-435 aa）以及色氨酸富含區(qū)（Tryptophan rich region，SRD）（440-450 aa）。

2.2 IRF3基因的氨基酸同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

Blastx比對(duì)結(jié)果顯示：雜交石斑魚IRF3與鮸 魚（Miichthys miiuy）IRF3和 花 鱸（Lateolabrax japonicus）IRF3同源性最高，分別為90%和89%、與鱖魚（Siniperca chuatsi）IRF3、大黃魚（Larimichthys crocea）IRF3、金鯧（Trachinotus ovatus）IRF3、大菱鲆（Psetta maxima）IRF3、象鼻科（Paralichthys olivaceus）IRF3和 三 刺 魚（Gasterosteus aculeatus）IRF3同源性分別為為87%、85%、84%、82%、81%和80%。進(jìn)化樹結(jié)果如圖2，雜交石斑魚IRF3與花鱸IRF3聚為一支，親緣關(guān)系較近，與其他物種親緣關(guān)系較低；高等哺乳動(dòng)物IRF3聚為一簇，魚類IRF3也聚為一支。

圖2 雜交石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×E.polyphekadion♂）IRF3氨基酸序列聚類分析

使用NCBI數(shù)據(jù)庫的BlastP對(duì)雜交石斑魚IRF3氨基酸序列比對(duì)分析顯示，雜交石斑魚IRF3與花鱸同源性為85%、鱖魚84%、金鯧魚79%、大黃魚和鮸魚78%、月光魚（Xiphophorus maculatus）68%、紅點(diǎn)鮭（Salvelinus leucomaenis）59%，應(yīng)用Clustalx進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，結(jié)果顯示（圖3），雜交石斑魚IRF3的DBD和IAD兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都較為保守。

2.3 IRF3基因組織表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)結(jié)果（圖4）顯示，雜交石斑魚IRF3在9種組織都有表達(dá)，在肝、胃。腸中表達(dá)量最高；其次是鰓、脾臟、心臟、肌肉和腦，頭腎表達(dá)量最低。

2.4 PolyI：C浸染后IRF3基因在PBL中時(shí)序性表達(dá)

雜交石斑魚PBL在PolyI：C刺激后，IRF3在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況如圖5所示。結(jié)果顯示，IRF3在PolyI：C刺激后1 h逐漸升高，表達(dá)量在4 h達(dá)到最大值，與對(duì)照組（約為對(duì)照組的9.3倍）顯著差異表達(dá)（P＜0.05），8 h后表達(dá)量開始下降。

3 討論

IRF3是IRF家族中重要成員，在先天免疫中抵抗病毒攻擊的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［16］。本研究通過RACE技術(shù)從雜交石斑魚中成功克隆出IRF3全長cDNA序列，含有1 377 bp ORF，共編碼458個(gè)氨基酸。3'端附近含有一個(gè)脊椎動(dòng)物常見的終止信號(hào)（AATAAA）和3個(gè)mRNA不穩(wěn)定基序（ATTTA），在許多促炎性因子中也發(fā)現(xiàn)含有多個(gè)mRNA不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)［17］，Sachs［18］發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)是具有炎性反應(yīng)的調(diào)控編碼基因。生物信息學(xué)分析表明，雜交石斑魚IRF3氨基酸序列與同屬鱸形目的花鱸同源性最高，SMART在線分析顯示，該基因含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，即DNA結(jié)合區(qū)（N-terminal DNA binding region，DBD）、干擾素相關(guān)區(qū)（C-terminal interferon related region，IAD）色氨酸富含區(qū)（Tryptophan rich region，SRD），在海鱸（Lateolabrax japonicus）中，IRF3也包含這3個(gè)結(jié)構(gòu)域，與該結(jié)果相同，說明IRF3的3個(gè)結(jié)構(gòu)域相對(duì)保守［19］。

應(yīng)用ClustalX程序?qū)﹄s交石斑魚IRF3與7種已知魚類IRF3氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析顯示，雜交石斑魚IRF3的DBD、IAD和SRD三個(gè)結(jié)構(gòu)域與其他魚類IRF3高度保守。DBD介導(dǎo)特異性結(jié)合到干擾素刺激應(yīng)答原件（IFN stimulated response element，ISRE）對(duì)應(yīng)于IFNb和干擾素刺激基因（IFN-stimulated genes，ISGs）啟動(dòng)子內(nèi)的DNA序列；IAD是激活后IRF3分子同源二聚化的必需位點(diǎn)；SRD可以誘導(dǎo)磷酸化IRF3的細(xì)胞質(zhì)-核易位，刺激DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性。此外，MEGA6.0軟件顯示，7種哺乳動(dòng)物IRF3聚在一起，8種魚類IRF3聚為一簇，其中，雜交石斑魚IRF3與花鱸聚為一支，進(jìn)一步說明本實(shí)驗(yàn)IRF3序列屬于魚類IRF家族成員。

圖3 雜交石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×E. polyphekadion♂）IRF3 氨基酸序列多重序列比對(duì)分析

圖4 雜交石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×E. polyphekadion♂）IRF3組織差異分布

圖5 雜交石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×E. polyphekadion♂）PBL在PolyI：C浸染后IRF3基因的相對(duì)表達(dá)量

雜交石斑魚IRF3在肝、鰓、腸、心臟、脾臟、腦、頭腎、肌肉和胃9個(gè)組織中都有不同程度的表達(dá)，且在不同組織中存在較大差異，在肝、胃、腸和鰓的表達(dá)量最高，且明顯高于其他組織，這可能與IRF3基因在不同組織中有著不同的生物學(xué)功能有關(guān)。肝臟在營養(yǎng)物質(zhì)的代謝和靜脈血液的匯流中起著重要的生理作用，且血液循環(huán)系統(tǒng)較發(fā)達(dá)，所以認(rèn)為肝臟可進(jìn)行病原體的檢測和宿主防御，在免疫檢測中扮演著重要的角色［20］，IRF3基因在肝中的表達(dá)量最高，可能說明IRF3在雜交石斑魚免疫應(yīng)答中起著重要的作用。鰓富含黏膜淋巴組織，是魚類機(jī)體抵抗病原體入侵天然屏障［21］，胃、腸和鰓這些組織都是病原菌最容易入侵的部位，表明雜交石斑魚IRF3在魚體抵御病原體侵入發(fā)揮著重要的作用。Huang等［22］對(duì)IRF3基因在斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）的組織特異性表達(dá)與本研究結(jié)果一致，IRF3在斜帶石斑魚的鰓中高表達(dá)，但在牙鲆［23］（Paralichthys olivaceus）中，IRF3在頭腎、脾臟和腎臟表達(dá)量最高，該結(jié)果可能說明IRF3在雜交石斑魚和牙鲆的表達(dá)模式存在差別。

PBL主要由T細(xì)胞和B細(xì)胞組成，是一類具有免疫識(shí)別功能的細(xì)胞系。用PolyI：C（聚肌胞苷酸）對(duì)雜交石斑魚外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫刺激后，雜交石斑魚IRF3表達(dá)量在浸染1 h后便迅速升高，在4 h時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸減弱，說明IRF3參與PBL對(duì)PolyI：C刺激的免疫應(yīng)答反應(yīng)。陳學(xué)杰等［24］研究發(fā)現(xiàn)，用PolyI：C刺激半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）PBL后，GRP3基因表達(dá)量在6 h時(shí)達(dá)到最高，與本研究結(jié)果類似，但對(duì)于LPS（脂多糖）、PGN（肽聚糖）和WGP（葡聚糖）3種病原模擬物刺激的PBL中，半滑舌鰨GRP3的表達(dá)量都在24 h達(dá)到峰值，說明外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)的免疫基因在短時(shí)間內(nèi)就對(duì)PolyI：C作出免疫應(yīng)答反應(yīng)，以上結(jié)果說明PBL可能對(duì)病毒敏感性更強(qiáng)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了雜交石斑魚IRF3cDNA全長序列、通過氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，IRF3序列在不同物種間的保守性高，9種組織中均有表達(dá)（肝、胃、腸和鰓最高），PBL經(jīng)過PolyI：C刺激后，IRF3表達(dá)量明顯升高，刺激4 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組IRF3表達(dá)量是對(duì)照組（0 h）9.3倍，說明IRF3參與了雜交石斑魚病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)。