一株海洋微小鏈霉菌群體感應(yīng)抑制活性及培養(yǎng)條件的研究

周恒 姜蕓 許葉祥 錢生輝 繆莉，2

（1. 揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，揚(yáng)州 225127；2. 中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510301）

群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）是微生物通過(guò)分泌、釋放一些特定的信號(hào)分子，并通過(guò)這些信號(hào)分子的濃度變化，來(lái)感知周圍環(huán)境中同類細(xì)胞密度變化而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的現(xiàn)象。它可以調(diào)節(jié)許多微生物的生理活動(dòng)，也可以調(diào)節(jié)不同細(xì)菌之間的關(guān)系，是微生物為適應(yīng)周圍環(huán)境的一種信號(hào)交流機(jī)制［1］。致病菌合成致病毒素而產(chǎn)生致病作用與致病菌在人體內(nèi)形成生物膜而產(chǎn)生的對(duì)抗生素的抗性作用受到廣泛關(guān)注［2］，且致病病毒的合成和生物膜的形成均受群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)群體感應(yīng)抑制劑介導(dǎo)致病菌的群體感應(yīng)來(lái)控制致病菌的致病效應(yīng)，使其不會(huì)產(chǎn)生抗性突變從而產(chǎn)生耐藥性［3］。所以，尋找群體感應(yīng)抑制劑有望從新的角度解決細(xì)菌耐藥性問(wèn)題［4］。因此，近年來(lái)從天然源［5-7］分離或從合成化合物［8］中篩選群體感應(yīng)抑制劑的研究越來(lái)越多。

海洋微生物資源豐富且具有不同于陸地微生物的活性物質(zhì)，目前的天然抗菌藥物大約有2/3來(lái)自放線菌［9］，放線菌的藥用價(jià)值已經(jīng)得到認(rèn)可［10］，從放線菌中分離出數(shù)百種具有不同結(jié)構(gòu)或顯著生物活性的化合物，其中約70%的天然衍生化合物正在臨床應(yīng)用中［11］。因此，以海洋放線菌為篩選對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行群體感應(yīng)抑制活性研究，優(yōu)化活性菌株的培養(yǎng)條件，對(duì)抗菌感染研究具有一定的理論和實(shí)踐價(jià)值［12］。本研究對(duì)前期從連云港表層海水中分離篩選得到的一株具有較高群體感應(yīng)抑制活性的海洋放線菌S. parvulusHY026［13］進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)和活性復(fù)篩，再優(yōu)化其培養(yǎng)基成分，以提高其產(chǎn)生活性物質(zhì)的能力，為進(jìn)一步的活性物質(zhì)分離純化研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用的測(cè)試菌是實(shí)驗(yàn)室保存的從連云港表層海水分離所得的海洋微小鏈霉菌S. parvulusHY026，群體感應(yīng)報(bào)告菌是由香港科技大學(xué)提供的紫色桿菌Chromobacterium violaceum12472。

高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L、硝酸鉀1 g/L、氯化鈉0.5 g/L、三水合磷酸氫二鉀0.5 g/L、七水合硫酸鎂0.5 g/L、七水合硫酸亞鐵0.01 g/L、海鹽33 g/L、pH 7.4-7.6，用于培養(yǎng)放線菌S. parvulusHY026。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、pH 7.4-7.6，用于培養(yǎng)報(bào)告菌紫色桿菌。

1.2 方法

1.2.1 HY026的復(fù)蘇、發(fā)酵及粗提物的制備 將凍存管中的菌株S. parvulusHY026轉(zhuǎn)移到高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，30℃、140 r/min振蕩復(fù)蘇培養(yǎng)5 d。從復(fù)蘇菌液中吸取5 mL菌液接種到50 mL高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)5 d。將發(fā)酵液用紗布過(guò)濾，分別收集濾液和菌體。濾液用等體積乙酸乙酯萃取兩次，菌體用10 mL氯仿/甲醇（1∶1）萃取兩次。將分別合并濾液、菌體的有機(jī)相萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥得到粗提物，稱重后加入一定量的甲醇或DMSO配制成50 mg/mL或100 mg/mL的粗提物樣品液用于活性測(cè)定。

1.2.2 HY026粗提物群體感應(yīng)抑制活性的測(cè)定 采用濾紙片法測(cè)定HY026發(fā)酵產(chǎn)物的群體感應(yīng)抑制活性。吸取100 μL生長(zhǎng)良好的紫色桿菌液于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，用無(wú)菌棉簽均勻涂布。吸取10μL HY026的粗提物樣品液滴加到濾紙片上，風(fēng)干后將濾紙片反扣到培養(yǎng)基上，做兩組平行，以10 μL溶劑甲醇為陰性對(duì)照，以化合物呋喃酮、吡啶（50 μg）為陽(yáng)性對(duì)照。將培養(yǎng)皿封口后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，測(cè)量紫色素抑制圈直徑。

1.2.3 HY026最佳碳源的選擇 根據(jù)放線菌的常用碳源，選擇5種不同碳源（可溶性淀粉、乳糖、玉米粉、葡萄糖、麥芽糖），采用單因子試驗(yàn)，進(jìn)行HY026的碳源優(yōu)化。每種碳源分別設(shè)置兩個(gè)濃度（1%和2%），以代替原高氏一號(hào)培養(yǎng)基中的碳源，每個(gè)處理設(shè)兩個(gè)平行。將HY026接種到配制好的各培養(yǎng)基中，按1.2.1中所述發(fā)酵條件進(jìn)行振蕩培養(yǎng)和代謝物的提取，以備后續(xù)的活性測(cè)試。

1.2.4 HY026最佳氮源的選擇 根據(jù)放線菌的常用氮源，選擇5種不同氮源（KNO3、黃豆粉、胰蛋白胨、酵母粉、（NH4）2SO4），采用單因子試驗(yàn)，進(jìn)行HY026的氮源優(yōu)化。每種氮源分別設(shè)置兩個(gè)濃度（1‰和2‰），以代替原高氏一號(hào)培養(yǎng)基中的氮源。每個(gè)處理設(shè)兩個(gè)平行。將HY026接種到配制好的各培養(yǎng)基中，按1.2.1中的發(fā)酵條件進(jìn)行振蕩培養(yǎng)和代謝物的提取，以備后續(xù)的活性測(cè)試。

1.2.5 HY026培養(yǎng)基的優(yōu)化 在確定好最佳碳源和氮源后，以這兩種碳氮源，同時(shí)選取高氏一號(hào)培養(yǎng)基中另外兩種主要成分，設(shè)計(jì)四因素四水平L16（45）的正交實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行，因子水平設(shè)計(jì)見表1。將HY026接種到配制好的各培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)和代謝物提取，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液提取物的質(zhì)量、群體感應(yīng)抑制活性確定該菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因子與水平

1.2.6 培養(yǎng)基優(yōu)化前后HY026粗提物質(zhì)量及群體感應(yīng)抑制活性的比較 按照正交試驗(yàn)確定好的最佳培養(yǎng)條件配置培養(yǎng)基，并配置原高氏一號(hào)培養(yǎng)基，將HY026菌種接入這兩種培養(yǎng)基中，各設(shè)3個(gè)平行，在30℃，140 r/min條件下培養(yǎng)5 d，按1.2.1中所述方法獲得粗提物并配制成樣品液，測(cè)定其活性。

2 結(jié)果

2.1 HY026群體感應(yīng)抑制活性的復(fù)篩

從50 mL HY026的高氏一號(hào)培養(yǎng)液中，獲得7.3 mg發(fā)酵液粗提物和143.3 mg的菌體；對(duì)HY026的菌體浸提液、發(fā)酵液粗提物以及濃縮后的萃余液進(jìn)行群體感應(yīng)抑制活性的測(cè)定。結(jié)果（圖1）顯示，菌體浸提液、萃余液及溶劑甲醇均無(wú)活性，而粗提物具有較高的群體感應(yīng)抑制活性，其抑制圈直徑為14 mm。無(wú)活性、陽(yáng)性對(duì)照呋喃酮與吡啶的色素抑制圈直徑分別為16 mm與19.5 mm。表明菌株HY026所產(chǎn)生的活性物質(zhì)主要存在于胞外，發(fā)酵液經(jīng)兩次萃取后，活性代謝產(chǎn)物已萃取完全。

2.2 HY026最佳碳源的選擇

選擇淀粉、乳糖、玉米粉、葡萄糖和麥芽糖為碳源，分別以1%和2%的濃度替代高氏一號(hào)培養(yǎng)基中的碳源，在其他條件不變的情況下對(duì)HY026進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定各發(fā)酵液的代謝物產(chǎn)量和群體感應(yīng)抑制活性。結(jié)果（圖2）顯示，以1% 淀粉、2% 淀粉、2% 玉米粉以及1% 麥芽糖為碳源時(shí)，該菌代謝產(chǎn)物質(zhì)量較高，在7 mg以上；以玉米粉為碳源時(shí)，該菌株的群體感應(yīng)抑制活性顯著高于其他處理，其對(duì)紫色桿菌產(chǎn)紫色素的抑菌圈直徑超過(guò)20 mm。綜合菌株發(fā)酵液代謝物產(chǎn)量以及群體感應(yīng)抑制活性，確定2% 玉米粉為HY026的最佳碳源。

圖1 HY026的菌體浸提液、發(fā)酵液粗提物及萃余液的群體感應(yīng)抑制活性

圖2 不同碳源對(duì)HY026代謝物產(chǎn)量及群體感應(yīng)抑制活性的影響

2.3 HY026最佳氮源的選擇

選擇硝酸鉀、黃豆粉、胰蛋白胨、酵母粉以及硫酸銨為氮源，分別以1‰ 和5‰ 的濃度替代高氏一號(hào)培養(yǎng)基中的氮源，在其他條件不變的情況下對(duì)HY026進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定各處理的代謝物產(chǎn)量和群體感應(yīng)抑制活性。結(jié)果（圖3）顯示，以5‰ 黃豆粉和5‰ 胰蛋白胨為氮源時(shí)，該菌代謝物產(chǎn)量明顯高于其他處理，在6.5 mg以上；以5‰ 黃豆粉和5‰（NH4）2SO4為氮源時(shí)，該菌株的群體感應(yīng)抑制活性相對(duì)較高，其對(duì)紫色桿菌產(chǎn)紫色素的抑制圈直徑分別為15.50 mm和14.85 mm。綜合菌株發(fā)酵液代謝物產(chǎn)量以及群體感應(yīng)抑制活性，確定5‰ 黃豆粉為HY026的最佳氮源。

圖3 不同氮源對(duì)海洋短小鏈霉菌粗提物的影響

2.4 HY026最佳培養(yǎng)基配方的研究

對(duì)選擇出的最佳碳源和氮源以及培養(yǎng)基中含量較高的海鹽和磷酸氫二鉀這4個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)研究，將HY026按各處理?xiàng)l件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)、代謝物提取和群體感應(yīng)抑制活性測(cè)試，根據(jù)各處理的代謝物質(zhì)量、群體感應(yīng)抑制活性的數(shù)據(jù)分析HY026的最佳培養(yǎng)基配方。

以不同培養(yǎng)基發(fā)酵所得的各代謝物對(duì)紫色桿菌產(chǎn)紫色素的抑制圈直徑為指標(biāo)，通過(guò)極差分析計(jì)算并比較各因素的K值和R值，結(jié)果（表2）表明，四因素玉米粉、黃豆粉、鹽度、磷酸氫二鉀對(duì)菌株的群體感應(yīng)抑制活性的影響作用大小及各因素最優(yōu)化水平依次為：磷酸氫二鉀（4）＞鹽度（3）＞玉米粉（2）＞黃豆粉（2）。通過(guò)方差分析計(jì)算各因素的F值，與查表所得的F0.05、F0.01值進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中磷酸氫二鉀、鹽度、玉米粉和黃豆粉對(duì)菌株的群體感應(yīng)抑制活性的影響均為極顯著（表3），F(xiàn)值的大小順序也與極差分析的結(jié)果一致。因此，僅從活性考慮，菌株HY026的最佳培養(yǎng)基配方（g/L）為磷酸氫二鉀1.0，鹽度34.0，玉米粉20.0，黃豆粉5.0。

由于在活性物質(zhì)分離時(shí)，代謝物的產(chǎn)量也很重要，抗群體感應(yīng)活性和代謝物產(chǎn)量也需同時(shí)進(jìn)行考量，因此，將各處理所得的粗提物質(zhì)量與抑制圈直徑相乘，再以所得的值為指標(biāo)進(jìn)行極差分析，計(jì)算各因素的K'值和R'值。結(jié)果（表4）顯示，四因素對(duì)菌株的影響作用大小及各因素的最優(yōu)化水平依次為：磷酸氫二鉀（4）＞黃豆粉（2）＞玉米粉（1）＞鹽度（3）。與僅考慮活性相比，影響因素的排序發(fā)生了變化，黃豆粉的影響變大而鹽度的影響變小，玉米粉的最優(yōu)化水平也有所變動(dòng)。通過(guò)方差分析計(jì)算各因素F值并與查表結(jié)果相比，發(fā)現(xiàn)磷酸氫二鉀、黃豆粉、玉米粉的影響仍為極顯著，鹽度的影響為不顯著，與極差分析的結(jié)果一致。因此，同時(shí)考慮活性和代謝物產(chǎn)量，菌株HY026的最佳培養(yǎng)基配方為磷酸氫二鉀1.0 g/L，黃豆粉5.0 g/L，玉米粉10.0 g/L，鹽度34.0 g/L。

2.5 培養(yǎng)基優(yōu)化前后的代謝物產(chǎn)量和群體感應(yīng)抑制活性的比較

將正交實(shí)驗(yàn)所得的兩種優(yōu)化條件（優(yōu)化1僅考慮活性，優(yōu)化2同時(shí)考慮活性和代謝物產(chǎn)量）對(duì)菌株HY026進(jìn)行培養(yǎng)，并以原高氏一號(hào)培養(yǎng)基為對(duì)照，比較3種條件下所得的粗提物的質(zhì)量與抑制圈直徑。

結(jié)果（圖4）顯示，優(yōu)化1所得粗提物的質(zhì)量及抑制圈直徑分別為24.24 mg和17.33 mm，優(yōu)化2所得粗提物的質(zhì)量及抑制圈直徑分別為25.62 mg和16.90 mm，而優(yōu)化前的高氏一號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)HY026所得粗提物質(zhì)量、抑制圈直徑分別為5.14 mg和14.20 mm。與優(yōu)化前相比，優(yōu)化1所得的粗提物質(zhì)量和群體感應(yīng)抑制活性分別提高了372%和22%；優(yōu)化2所得的粗提物質(zhì)量和群體感應(yīng)抑制活性分別提高了398%和19%。

3 討論

通過(guò)對(duì)萃取廢液、菌體浸液及粗提物的群體感應(yīng)抑制活性研究，發(fā)現(xiàn)萃取廢液及菌體浸液均無(wú)群體感應(yīng)抑制活性，僅粗提物具有較大的抑制圈直徑，表明活性代謝產(chǎn)物為胞外產(chǎn)物，本實(shí)驗(yàn)中所采用的代謝物萃取方法可以很好地將活性物質(zhì)從發(fā)酵液中萃取出來(lái)。在濾紙片實(shí)驗(yàn)的操作過(guò)程中，將粗提物的溶液移加至濾紙片上時(shí)，若滴加速度過(guò)快，會(huì)有部分粗提物透過(guò)濾紙片或從濾紙片的邊緣溢出，所測(cè)試出的抑制圈會(huì)比實(shí)際要小，因此，HY026的粗提物群體感應(yīng)抑制活性應(yīng)稍大于測(cè)試值。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

表3 正交試驗(yàn)的方差分析表（僅考慮活性）

通過(guò)單因子試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉和玉米粉是HY026的良好碳源，黃豆粉和胰蛋白胨是HY026的優(yōu)良氮源。氮源是構(gòu)成生物體的蛋白質(zhì)、核酸及其他氮素化合物的主要材料［14］，而有機(jī)氮源對(duì)菌株的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生具有重要的作用。碳源作為微生物生長(zhǎng)中的必須營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［15］，則更多地影響該菌株的群體感應(yīng)活性（即活性物質(zhì)在總代謝物中的占比）。夏覓真等［16］在對(duì)一株土壤放線菌FX05的發(fā)酵條件優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)以1% 玉米粉為碳源時(shí)，F(xiàn)X05的代謝產(chǎn)物抑制綠膿桿菌的活性最高。周慧茹［17］在對(duì)抗腫瘤活性菌的培養(yǎng)優(yōu)化及活性物質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，高濃度的玉米粉不僅能使菌體生長(zhǎng)旺盛，而且對(duì)菌株的代謝活動(dòng)更有利。肖懷東等［18］在對(duì)海洋放線菌JMC06001發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的研究中發(fā)現(xiàn)將蛋白胨和大豆粉組合時(shí)獲得的粗提物對(duì)藤黃八疊球菌（Sarcina lutea）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有較強(qiáng)的抑制效果。

表4 正交試驗(yàn)的方差分析表（既考慮活性又考慮代謝物產(chǎn)量）

圖4 優(yōu)化前后粗提物質(zhì)量及抑制圈直徑比較

通過(guò)正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，就菌株的抗群體感應(yīng)活性而言，磷酸氫二鉀和鹽度影響較大，趙媛等［19］在對(duì)葉紅景天內(nèi)生菌抗病菌株篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)，磷酸氫二鉀對(duì)抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生有較高的促進(jìn)作用。許潔［20］在抗群體感應(yīng)海洋放線菌的分離篩選與活性物質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，鹽度的改變對(duì)菌株的活性有較大的影響。綜合代謝物產(chǎn)量和活性兩者因素發(fā)現(xiàn)，碳氮比降低，活性物質(zhì)的產(chǎn)量略有上升，但活性卻略微下降。就兩種優(yōu)化條件下發(fā)酵所得的提取物的產(chǎn)量和群體感應(yīng)抑制活性來(lái)看，兩者的優(yōu)化效率沒(méi)有明顯差異，都是培養(yǎng)菌株HY026的良好的發(fā)酵培養(yǎng)基。但優(yōu)化1中用到的玉米粉的含量高于優(yōu)化2，考慮到經(jīng)濟(jì)成本，優(yōu)化2中的培養(yǎng)基配方為菌株S. parvulusHY026的最佳優(yōu)化條件。

4 結(jié)論

本文對(duì)分離自連云港海域的一株海洋微小鏈霉菌HY026進(jìn)行了群體感應(yīng)抑制活性的測(cè)試和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，通過(guò)濾紙片法確定S. parvulusHY026具有較高的群體感應(yīng)抑制活性，在單因子實(shí)驗(yàn)中，確定玉米粉為最佳碳源、黃豆粉為最佳氮源，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳的培養(yǎng)基配方為：磷酸氫二鉀1.0 g/L，鹽度34.0 g/L，玉米粉10.0 g/L，黃豆粉5.0 g/L。本研究為進(jìn)一步大批量發(fā)酵獲取S. parvulusHY026的粗提物和活性物質(zhì)的分離純化提供基礎(chǔ)。