棒瑚菌子實體不同發(fā)育時期的轉錄組分析

唐賢 丁祥 董明明 朱淼 宋志強 侯怡鈴

（1. 西華師范大學生命科學學院 西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，南充 637009；2. 西華師范大學環(huán)境科學與工程學院，南充 637009）

食用菌子實體的形成和發(fā)育的分子機理對食用菌的產(chǎn)量和品質具有關鍵的影響。近年來，我國食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，香菇、杏鮑菇等已實現(xiàn)機械化生產(chǎn)，但目前一些重要食用菌仍主要依賴于野生資源，野生資源過度開發(fā)及環(huán)境的變化導致野生食用菌類資源量急劇下降，甚至一些種類瀕臨滅絕［1-2］。轉錄組測序能夠反應不同生命階段的基因的表達、功能，能對基因進行注釋及標記［3］，已廣泛應用于探索大型真菌發(fā)育相關基因及關鍵分子機制。榮成博等［4］通過轉錄組測序發(fā)現(xiàn)編碼苯丙氨酸裂解酶的基因（CL4509）和編碼乙醇氧化酶的基因與白靈側耳的子實體發(fā)育相關。吳小梅等［5］分析了雙孢蘑菇3個發(fā)育時期的轉錄組測序結果，發(fā)現(xiàn)雙孢蘑菇子實體發(fā)育與氨基酸代謝相關，能通過MAPK 信號途徑傳遞環(huán)境脅迫信號。施肖堃等［6］分析雙孢蘑菇As2796子實體4個發(fā)育階段的差異基因，發(fā)現(xiàn)疏水蛋白在其子實體發(fā)育與后熟過程中有重要的作用。李帆等［7］分析了刺芹側耳3個發(fā)育時期的轉錄組測序結果，發(fā)現(xiàn)菌絲期的碳代謝和氨基酸代謝、原基期的脂肪酸代謝和抗氧化酶、子實體時期的環(huán)境因子影響刺芹側耳發(fā)育。探索食用菌子實體的形成和發(fā)育的分子機制有助于實現(xiàn)野生食用菌的人工栽培生產(chǎn)。

棒瑚菌（Clavariadelphus pistillaris（Fr.）Donk）屬于擔子菌門，釘菇目，棒瑚菌科，棒瑚菌屬，子實體呈棒狀，不分枝，頂部鈍圓。主要分布于我國四川、云南等地［8］。棒瑚菌屬真菌能與殼斗科櫟屬植物形成菌根，保證樹木的正常生長，維持生態(tài)平衡［9］，在生態(tài)學上有很大的應用潛力。棒瑚菌屬真菌含有豐富的微量元素，味道鮮美，可食用，因此它們適合作為營養(yǎng)食品和功能食品［10］。研究發(fā)現(xiàn)，從平截棒瑚菌中（Clavariadelphus truncatus.（Quel.）Donk.）提取的棒瑚菌酸（Clavaric acid）能作為法呢基轉移酶（FPTase）的抑制劑［11］，其菌絲體培養(yǎng)物具有廣泛的抗菌性能［12］。棒瑚菌屬是具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ奶烊凰幬镔Y源。棒瑚菌屬共發(fā)現(xiàn)了22種，在我國僅發(fā)現(xiàn)9種，國內外學者對棒瑚菌屬的研究主要在形態(tài)學、解剖學、顯微化學和開發(fā)應用等方面［13-14］。目前，棒瑚菌尚未實現(xiàn)人工栽培，野生產(chǎn)量稀少，其獨特的形態(tài)在大型真菌中獨樹一幟。因此，分析棒瑚菌子實體不同發(fā)育時期的基因表達情況、差異表達基因，探索其子實體不同發(fā)育時期關鍵的功能基因和代謝通路，對棒瑚菌資源的保護與開發(fā)應用具有一定的指導意義。

本文通過RNA-Seq測序技術，比較分析采自四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣棒瑚菌子實體幼菇期和成熟期差異表達的基因，探索棒瑚菌發(fā)育過程中與子實體生長發(fā)育有關的功能基因及代謝機制，為棒瑚菌子實體發(fā)育的進一步研究及食藥用資源開發(fā)提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗的棒瑚菌采自四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣，選取幼菇期（CP-1）與成熟期（CP-2）的棒瑚菌子實體作為研究材料。用無菌水將新鮮完整子實體清洗（重復3次），用無菌剪刀將子實體剪碎后，立即轉移至液氮中保存供下一步實驗。

1.2 方法

1.2.1 樣品總RNA的提取及檢測 按照OMEGA（OMEGA's fungal total RNA extraction kit） 真 菌 總RNA提取試劑盒的使用說明提取棒瑚菌子實體中總RNA。稱取50 mg經(jīng)液氮研磨加入裂解液，離心；轉移上清加入0.5倍體積無水乙醇，離心棄濾液；加 Buffer I離心，棄去濾液；加入Buffer II離心棄去濾液（重復2次）；加入 DEPC Water離心。通過1%的瓊脂糖電泳和Agilent 2100檢測RNA樣品的完整性，用NanoDrop檢測RNA的純度，OD260/OD280應在 1.8-2.2 之間，OD260/ OD230＞2［15］。

1.2.2 生物信息學分析 樣品總RNA檢測合格后送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行cDNA文庫構建，庫檢合格后進行RNA-Seq測序。

將原始測序數(shù)據(jù)（Raw data）進行過濾篩選，得到分析數(shù)據(jù)Clean reads。利用Trinity［16］對分析數(shù)據(jù)Clean reads進行拼接，獲得最終轉錄本序列，選取每個基因中最長的轉錄本作為非重復獨立基因Unigene。將非重復獨立基因Unigene在KOG/COG數(shù)據(jù)庫進行功能注釋。利用RSEM［17］軟件進行基因表達定量分析（FPKM＞0.3）。采用 DESeq［18］進行基因差異性表達分析，閾值為padj＜0.05，并對差異基因進行GO［19］富集分析和KEGG［20］富集分析。

2 結果

2.1 轉錄組的數(shù)據(jù)質量分析

CP-1與CP-2進行RNA-Seq測序后分別獲得原始數(shù)據(jù)（Raw reads），去除帶接頭的reads和低質量的reads后分別獲得8.78 G（CP-1）和8.28 G（CP-2）分析數(shù)據(jù)（Clean reads）。綜合3次測序結果的平均值，其 中 CP-1的 Q20（%） 為 97.60%，Q30（%） 為94.12%，GC含量為57.75%，CP-2的Q20（%）為97.65%，Q30（%）為94.03%，GC含量為57.70%，堿基錯誤率均為0.01%。拼接分析數(shù)據(jù)Clean reads后一共獲得151 367個轉錄本（Transcript），101 291個不同長度的非重復獨立基因 Unigene，占總轉錄本的66.92%。以上結果說明該測序結果可靠性較高，可用于下一步分析研究（表1，圖1）。

2.2 轉錄組基因KOG功能注釋及差異基因GO富集分析

轉錄組基因KOG功能注釋結果（表2）顯示，共有19 204個Unigene在KOG數(shù)據(jù)庫成功注釋，共涉及26類。非重復獨立基因Unigene數(shù)量最多的集中在僅通用功能預測（2 375條），翻譯后修飾、蛋白質周轉、伴侶蛋白（2 194條）和翻譯、核糖體結構、生物發(fā)生（2 030條）等，最少的是細胞運動（10條）。該結果顯示，CP-1和CP-2中基因所涉及到的KOG功能類別比較全面復雜，包括蛋白質合成相關過程。值得注意的是，有800條Unigene的功能是未知的，且存在未命名蛋白（1條）。由此可見，棒瑚菌還有大量基因有待于進一步研究。

表1 棒瑚菌測序轉錄組的數(shù)據(jù)質量統(tǒng)計

用Goseq方法對CP-1和CP-2的差異基因進行了GO富集分析，統(tǒng)計后結果（圖2）顯示，共產(chǎn)生 2 169個生物過程（Biological process），517個細胞成分（Cellula component）和1 076個分子功能（Molecular function）。差異基因GO富集結果提示，棒瑚菌在不同生長階段（CP-1和CP-2）的生物代謝存在一定的差異，同時提示，生物過程（Biological process）中的新陳代謝過程、細胞成分（Cellula component）中的細胞和細胞組分和分子功能（Molecular function）中的氧化還原酶活性是棒瑚菌子實體發(fā)育過程中的關鍵基因門類。

2.3 不同發(fā)育時期基因表達水平分析

采用RSEM軟件對基因表達進行定量分析，F(xiàn)PKM超過60的基因高水平表達，而在0-0.3 FPKM的基因為低水平表達或根本不表達?；虮磉_水平分析結果顯示，棒瑚菌在不同生長階段（CP-1和CP-2）基因表達水平的分布總體相似，但仍存在一定的差異。在棒瑚菌子實體幼菇期（CP-1）有39 140個基因表達（FPKM ≥ 0.3），約占基因總數(shù)的76.38%，其中，2 458個基因高表達（FPKM ＞60），約占基因總數(shù)的4.96%；而在棒瑚菌子實體成熟期（CP-2），有35 188個基因表達（FPKM ≥ 0.3），約占基因總數(shù)的68.5%，其中，2495個基因高表達（FPKM ＞ 60），約占基因總數(shù)的4.86%。

表2 棒瑚菌Unigene的KOG功能注釋統(tǒng)計

圖2 差異基因GO富集分析

進一步分析發(fā)現(xiàn)，棒瑚菌子實體幼菇期（CP-1）和成熟期（CP-2）分別均有8個基因為極高表達（FPKM ＞ 5 000）。棒瑚菌子實體幼菇期（CP-1）的8個極高表達基因為：CcmD，HFB，RP-L41，PPO，MhfA，CuBPs，Hed，Hyd（表 3），在棒瑚菌子實體成熟期（CP-2）的8個基因極高表達基因為：CcmD，GH2，Ph-zid，PPO，CuBPs，MhfA，Hed，Hyd（表 4）。

編碼多酚氧化酶基因PPO和編碼疏水蛋白基因Hyd在CP-1和CP-2看均極高表達，hfb和RP-L41僅在CP-1中高表達，hfb為編碼真菌疏水蛋白的基因，該基因僅在CP-1中極高表達，說明在棒瑚菌的發(fā)育過程中至少有兩種疏水蛋白參與細胞壁的生物合成；RP-L41為編碼核糖體大亞基L41的基因，參與核糖體的生物合成及轉錄翻譯，提示棒瑚菌在成熟期（CP-2）核糖體的代謝發(fā)生了變化。而GH2和Ph-zid僅在CP-2 中高表達，編碼糖苷水解酶家族2的基因GH2僅在CP-2中極高表達，而編碼糖苷水解酶家族2的基因GH2和編碼苯丙氨酸拉鏈的基因Ph-zid僅在CP-2中極高表達，以上篩選出的高表達基因對揭示棒瑚菌在不同生長發(fā)育期的關鍵基因提供了一定的科學依據(jù)。

2.4 不同發(fā)育時期差異表達基因（DEGs）的分析

使用DESeq對CP-1和CP-2的差異表達基因（DEGs）進行分析，并設定顯著差異表達的閾值Padj ＜ 0.05。棒瑚菌不同發(fā)育時期差異表達基因（DEGs）的分析結果顯示，棒瑚菌子實體幼菇期（CP-1）和成熟期（CP-2）的差異基因有6 625個，包括3 949個上調基因和2 676個下調基因（圖3），其中有2 290個基因只在幼菇期（CP-1）中表達，1 231個基因只在成熟期（CP-2）中表達。

表3 CP-1組中基因的定量表達（FPKM＞5 000）

在| log2fold change|＞ 6.5閾值內的差異基因中，27個基因被上調，包括COX3、CYTB、wrbA、ND1、ARD1、EF3、ND4、SDHA、RP-S3e、RP-L5、RP-S5、EEF1A、ATP1、PDIA1和ARF1等；14個基因被下調，包 括 E1.11.1.5、PDIA1、htpG、UBE2D-E、CaM、RP-S9e、RP-L19e、ALDO和FDH等（表5-6）。

進一步分析顯示，上調基因中，涉及一些氧化呼吸電子傳遞鏈的輔基基因，例如，編碼電子傳遞鏈中復合體Ⅰ的輔基的基因ND1和ND4，復合體Ⅱ的輔基的基因SDHA，復合體Ⅲ的輔基的基因CYTB，復合體Ⅳ的輔基的基因COX3，ATP合酶輔基的基因ATP1，提示氧化磷酸化途徑的基因出現(xiàn)上調。在下調基因中，包括編碼鈣調蛋白基因CaM和編碼甲酸脫氫酶基因FDH。

表4 CP-2組中基因的定量表達（FPKM＞5 000）

圖3 CP-1與CP-2基因差異表達分析火山圖

2.6 不同發(fā)育時期代謝通路KEGG分析

KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）是有關代謝通路的主要公共數(shù)據(jù)庫［28］。棒瑚菌子實體幼菇期（CP-1）和成熟期（CP-2）差異基因KEGG Pathway富集結果（表7）顯示，有2 678個差異表達的基因成功注釋在104條通路中。其中，在核糖體（438個差異基因，16.36%）、糖酵解/糖異生途徑（83個差異基因，3.10%）、三羧酸循環(huán)（52個差異基因，1.94%）、氧化磷酸化（111個差異基因，4.14%）、內質網(wǎng)中的蛋白質加工（118個差異基因，4.41%）、蛋白酶體（49個差異基因，1.83%）和MAPK信號通路（52個差異基因，1.94%）中，差異基因富集顯著。

本研究中三羧酸循環(huán)（Citrate cycle，TCA cycle）途徑（圖4）上調基因，包括pdhc（K00627）、DLST（K00658）、pdhD（K00382）、IDH3（K00030）、CS（K01647）、E4.2.1.2（K01676）、SDHA（K00234）、MDH1（K00025）和ACO（K01681）。MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）（圖5）上調基因，包括Cdc42（k04393）、PAK1（k04409）、MKK（K11226）、PKC1（k02677）、MKK1_2（K08294）、MAPK7（K04464）、YPD1（K11232）和GNG（K07973）；下調基因包括STE12（K11215）和SSK2（K11230）。

此外，幼菇期（CP-1）與成熟期（CP-2）差異基因還顯著富集在核糖體、內質網(wǎng)中的蛋白質加工、

蛋白酶體途徑，顯示棒瑚菌子實體幼菇期（CP-1）與成熟期（CP-2）蛋白質合成途徑亦存在差異。

表6 差異基因的表達：下調（|log2fold change| ＞6.5）

表7 差異基因KEGG pathway富集分析

圖4 三羧酸循環(huán)

3 討論

大型真菌子實體發(fā)育過程涉及物質能量代謝、細胞分化以及信號轉導等生命活動。本研究選用四川省小金縣棒瑚菌幼菇期（CP-1）和成熟期（CP-2）的子實體進行RNA-Seq測序并進行生物信息學分析，不同發(fā)育時期基因表達水平分析發(fā)現(xiàn)，編碼多酚氧化酶的基因PPO在CP-1和CP-2中均極高表達，可能與棒瑚菌子實體的褐變及抗病性有關［21-22］。編碼疏水蛋白的基因Hyd在CP-1和CP-2中均極高表達，有利于孢子的擴散和營養(yǎng)菌絲的分散，還能保護細胞免受惡劣環(huán)境的侵害［23-24］。而編碼糖苷水解酶家族2的基因GH2僅在CP-2中極高表達，說明GH2作為糖代謝的關鍵基因參與寡糖和多糖的合成，修飾和降解［25］。編碼苯丙氨酸拉鏈的基因Ph-zid僅在CP-2中極高表達，說明CP-2能在沒有細胞外配體的情況下激活和調節(jié)酪氨酸激酶的活性［26］。比較分析CP-1和CP-2差異表達的基因，發(fā)現(xiàn)上調基因主要富集在氧化呼吸電子傳遞鏈，說明棒瑚菌在幼菇期（CP-1）需要大量能量維持正常的生長發(fā)育，同時大量的耗氧代謝過程提示，環(huán)境含氧量對棒瑚菌的生長發(fā)育有重要影響。在下調基因中，編碼鈣調蛋白基因CaM下調，說明棒湖菌在成熟期（CP-2），細胞內多種生理活動如細胞增殖和細胞周期正在減弱［27］；編碼甲酸脫氨酶基因FDH下調，提示棒瑚菌在發(fā)育過程中甲酸含量增加，為維持一碳化合物穩(wěn)態(tài)，成熟期（CP-2）甲酸代謝過程增強［28］，初步篩選出了與棒瑚菌生長發(fā)育有關的代謝途徑，包括三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、核糖體途徑、蛋白酶體途徑以及MAPK信號通路等。

圖5 MAPK信號通路

三羧酸循環(huán)不僅是細胞能量的來源，而且能產(chǎn)生其他生物大分子合成的前體，更是生物體內3大營養(yǎng)物質代謝的樞紐［29］。本研究中三羧酸循環(huán)中的編碼丙酮酸脫氫酶的基因PDH、蘋果酸脫氫酶的基因MDH、檸檬酸合酶的基因CS、異檸檬酸脫氫酶的基因IDH、琥珀酸脫氫酶的基因SDH均在CP-1中表達上調，說明三羧酸循環(huán)在棒瑚菌幼菇期（CP-1）能量代謝的中起關鍵作用；而磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶基因PCKA在棒瑚菌子實體成熟期（CP-2）中表達表達上調，說明棒瑚菌子實體成熟期（CP-2）的糖異生過程比幼菇期（CP-1）更為活躍，該過程與寡糖和多糖的合成、修飾等生理生化過程有關。MAPK信號通路是細胞內一種重要的信號轉導系統(tǒng)，通過MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MKKK）、MAPK 激酶（MAP kinase kinase，MKK）和MAPK依次激活，共同調節(jié)細胞的生長、分化以及對環(huán)境的應激等多種重要的細胞生理過程［30-31］。我們發(fā)現(xiàn)在MAPK信號通路中，細胞分裂控制蛋白42基因（Cdc42）表達上調，提示Cdc42可能參調控與菌絲的極性生長和細胞周期，說明真菌細胞形態(tài)轉換與Rho家族蛋白基因有關［32-33］，以上結果顯示，MAPK信號通路在棒瑚菌子實體的生長發(fā)育過程中有重要作用。

4 結論

在棒瑚菌的生長發(fā)育過程中，新陳代謝過程、細胞和細胞組分以及氧化還原酶活性是棒瑚菌子實體發(fā)育過程中的關鍵基因門類。多酚氧化酶，核糖體，糖苷水解酶家族等基因在棒瑚菌子實體的蛋白質和細胞壁合成中起重要作用。氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)是棒瑚菌子實體幼菇期（CP-1）生長發(fā)育的關鍵代謝途徑，且環(huán)境含氧量對棒瑚菌的生長發(fā)育有重要影響；同時MAPK信號通路是參與調節(jié)棒瑚菌子實體生長發(fā)育的關鍵信號通路，在調控菌絲的極性生長，細胞周期和真菌細胞形態(tài)轉換中起重要作用。