煙葉多糖硒化衍生物制備及其體外抗氧化活性研究

張昊 魏躍偉 姬小明 潘婷婷 王慧

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州 450002；2. 湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，武漢 430030）

煙草（Tobacco），屬于茄科煙草屬植物，在世界范圍內(nèi)有60余種［1］，有一大部分原產(chǎn)地為南美洲，現(xiàn)在我國南北各省區(qū)廣為栽培種植［2］，煙草含有茄尼醇、多糖、氨基酸、蘆丁、綠原酸、有機酸等多種活性成分［3］，并且研究已證明煙草具有十分重要的藥用價值，具有消腫、解毒等功效，在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、改善心血管疾病也有顯著療效［4］，其很多作用與煙草中多糖密切相關(guān)。

多糖是一種高分子聚合物，它一般是由醛糖和酮糖通過縮合而形成的，擁有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血脂及降血糖［5］等多種生物活性。硒元素是生命必需的微量元素，具有抗衰老、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機體免疫力、影響人和動物的生殖發(fā)育、解毒等生物學(xué)功能［6］。硒在體內(nèi)以硒代半胱氨酸的形式構(gòu)成谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心，可清除自由基，抑制脂氧化或過氧化［7］。有研究表明將多糖進行硒衍生化后，發(fā)現(xiàn)其體外抗氧化活性比無硒衍生化多糖的明顯增強［8］。

本研究通過對煙葉中多糖進行提取精制后制備煙葉多糖硒化衍生物，并評價其體外抗氧活性大小，以期對煙葉多糖的開發(fā)利用提出參考。

1 材料與方法

1.1 材料

煙葉：四川涼山烤后煙樣，品種為云煙87，等級為C3F，石油醚（沸程30-60℃）、無水乙醇、氯仿、正丁醇、氯化鈉、硝酸、亞硒酸鈉、氯化鋇、氫氧化鈉、硫酸鈉皆為分析純，DEAE-52纖維素，北京索萊寶科技有限公司，透析袋（分子量3 500 Da），北京索萊寶科技有限公司。

KQ5200DE型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠，UV8100B紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科技儀器有限公司，自動餾分收集器BSZ-160F，上海之信儀器有限公司，LYOVAC GT2冷凍干燥機，德國萊寶公司。

1.2 方法

1.2.1 煙葉粗多糖的提取 將煙葉研磨碎裂后過40目篩，用石油醚浸泡3 h，抽濾，加入80%乙醇于70℃進行回流提取2次，2 h/次，抽濾，60℃烘干粉碎備用。

取一定量上述處理過煙葉，按照設(shè)定的料液比1∶35（g∶mL）在溫度60℃、超聲功率400 W的條件下進行超聲輔助提取10 min，冷卻至室溫，抽濾取濾液，在60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至體積的1/4，加入4倍體積無水乙醇，醇沉8 h以上。再經(jīng)8 000 r/min離心10 min，取沉淀，得煙葉粗多糖。

1.2.2 煙葉粗多糖的精制分離 取煙葉粗多糖用蒸餾水溶解，配置成粗多糖溶液，用Sevage法去除蛋白質(zhì)［9］，加入多糖溶液體積的1/3 Sevage試劑（V氯仿∶V正丁醇=4∶1），充分震蕩后靜置30 min，離心取上清液，棄去下層變性蛋白質(zhì)，然后重復(fù)上述操作，至到兩液分層處無白色渾濁出現(xiàn)，旋蒸除掉殘留的Sevage試劑。取無蛋白的煙葉多糖溶液，加入1.5%的無磷活性炭進行脫色，在60℃條件下，緩慢攪拌30 min后，抽濾，將濾液放入處理好的透析袋中，每8 h換一次水，透析72 h。

透析完成后將溶液用微孔過濾膜進行抽濾，取溶液裝至已處理好的DEAE-52纖維素柱中，分別用0、0.10、0.20、0.30、0.40和 0.50 mol/L的 NaCl溶液以2.00 mL/min流速進行梯度洗脫，自動餾分收集器收集洗脫液，每梯度收集20管，每管6 min，采用硫酸-苯酚法隔管檢測洗脫液的吸光度。洗脫液進行減壓濃縮后放入透析袋中，每8 h換一次水，透析72 h。冷凍干燥后得精制煙葉多糖。

1.2.3 煙葉多糖硒化衍生物的制備 參照王小莉［10］方法，稍作修改。準(zhǔn)確稱取煙葉精制多糖100 mg于三角瓶中，加入濃度為 0.5%的HNO3溶解，加修飾劑Na2SeO3和催化劑 BaCl2進行反應(yīng)6 h，調(diào)節(jié)pH至 7-8，再加入Na2SO4以除去未反應(yīng)的Ba2+，將溶液透析至無Se為止，最后加入4倍體積的無水乙醇得醇沉物，沉淀冷凍干燥，得到煙葉多糖硒化衍生物。

1.2.4 紅外光譜的測定 取少量煙葉精制多糖和煙葉多糖硒化衍生物分別與適量的溴化鉀粉末混合，烘干，壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）進行掃描檢測，掃描區(qū)間為500-4 000 cm-1。

1.2.5 硒化煙葉多糖取代度的測定

（1）硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)硒溶液，分別移取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL到具塞比色管中，分別加5.00 mL蒸餾水，5%EDTA-Na2溶液1.00 mL，晃動均勻后加入濃度為1.0 mol/L的鹽酸溶液調(diào)至pH 2-3，再加入4.00 mL濃度為0.5%的3，3'-二氨基聯(lián)苯胺溶液，晃動均勻后，放置暗處20 min，再加入濃度為5%的NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，最后加入5.00 mL甲苯震蕩2 min，靜置分層，取甲苯層在420 nm處測吸光度。以硒含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

（2）硒化煙葉多糖取代度的測定 準(zhǔn)確稱取50 mg煙葉多糖硒化衍生物于具塞試管中，加入3.00 mL混酸（V硝酸∶V高氯酸=4∶1），蓋上表面皿浸泡過夜，次日加熱消解至消化液出現(xiàn)淺棕色，冷卻后加0.50 mL的雙氧水，再加熱到出現(xiàn)白煙，后冷卻至室溫，用約10.00 mL蒸餾水沖洗瓶壁，再加熱趕酸至剩余體積為1-2 mL，再加入6 mol/L混酸，定容至10.00 mL，晃動均勻。取2.00 mL溶液按1.2.5.1方法測硒含量，得其含量為M1。

M1：煙葉多糖硒化衍生物中硒基的含量

M2：煙葉多糖硒化衍生物的質(zhì)量

1.2.6 體外抗氧化活性研究

（1）樣品對·DPPH自由基清除作用 參照馮書珍［11］方法，稍作修改。分別取濃度為0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/mL的樣品溶液，加入·DPPH乙醇溶液2.00 mL晃動均勻。在25℃左右的暗處放置30 min，用分光光度計在517 nm處測量其吸光度。用蒸餾水取代樣品溶液為空白實驗，以無水乙醇代替樣品溶液為對照實驗，以不同濃度抗壞血酸作為陽性對照。測試進行3次，取平均值。按下式進行計算清除率：

式中：A樣品為樣品的吸光度；A空白為蒸餾水的吸光度；A對照為無水乙醇的吸光度

（2）樣品對·OH自由基清除率的測定 參照郭青枝［12］方法，稍作修改。分別取濃度為0.10、0.20、0.30、0.40和0.50 mg/mL的樣品溶液，加入FeSO4溶液2.00 mL晃動均勻后再加入水楊酸溶液2.00 mL，最后加2.00 mL的H2O2溶液，在37℃反應(yīng)1 h后，在波長510 nm測其吸光度，蒸餾水替代樣品溶液為空白實驗，以不同濃度抗壞血酸為陽性對照。進行3次，取平均值。按下式計算清除率：

式中：A樣品為樣品的吸光度；A空白為蒸餾水的吸光度；

（3）樣品對O2-·自由基清除能力 參照周濃［13］及馮書珍［11］方法，稍作修改。分別取濃度為0.10、0.20、0.30、0.40和0.50 mg/mL的樣品溶液2.00 mL，預(yù)熱后加入pH為8.2的 Tris-HCl緩沖液3.00 mL、0.30 mL鄰苯三酚使其均勻后，25℃反應(yīng)5 min后加入1.00 mL的 HCl終止反應(yīng)，在299 nm波長下測定吸光度。蒸餾水替代樣品溶液為空白實驗，鄰苯三酚代替樣品溶液為對照實驗，以不同濃度的抗壞血酸為陽性對照。進行3次，取平均值。按下式計算清除率：

式中：A樣品為樣品的吸光度；A空白為蒸餾水的吸光度；A對照為鄰苯三酚的吸光度

2 結(jié)果

2.1 煙葉精制多糖的制備

由圖1可知，當(dāng)用100 g煙末進行超聲輔助提取，經(jīng)過脫色、脫蛋白等步驟的精制后，多糖的洗脫液在管數(shù)60-80、80-100中間出現(xiàn)了紫外吸收峰，說明當(dāng)利用0.30 mol/L、0.40 mol/L的NaCl溶液洗脫時會在DEAE-52纖維素中洗脫下來兩種煙葉多糖組分，經(jīng)透析袋透析，濃縮，冷凍干燥，得干燥煙葉精制多糖，分別記為TPP1和TPP2，得兩種多糖的提取率分別為1.21%和2.54%。

圖1 煙葉多糖經(jīng)DEAE-52精制洗脫曲線

2.2 煙葉多糖及其硒化衍生物多糖的紅外光譜圖分析

圖2分別是的TPP1和TPP2的紅外光譜圖，從圖中可分析推測得出煙葉精制多糖可能的結(jié)構(gòu)特征。其譜圖分析如下：兩種多糖分別在3 600-3 200 cm-1范圍內(nèi)有特征峰，說明兩種多糖中存在-OH［14］；兩種多糖分別在1 638和1 640 cm-1有強吸收峰是由C=O的伸縮振動引起的［15］；在1 200-1 430 cm-1范圍的吸收峰是由于C-O的伸縮振動和O-H的變角振動引起的［16］；兩個紅外圖譜中均無1 541 cm-1吸收峰，說明它們不含有蛋白質(zhì)［17］。

圖2 煙葉多糖TPP1和TPP2的紅外圖譜

圖3是多糖硒化后的紅外光譜圖，對比圖2可以看到兩個圖譜分別在在864 cm-1、858 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，由文獻［18］對比知識可知為Se=O的吸收峰，證明形成了硒化多糖。

圖3 煙葉多糖硒化衍生物Se-TPP1和Se-TPP2的紅外圖譜

2.3 煙葉多糖硒化衍生物取代度的測定

分光光度法的檢測原理是：在微酸性條件下硒元素與3，3'-二氨基聯(lián)苯胺絡(luò)合生成黃色物質(zhì)，此黃色絡(luò)合物在420 nm處有強吸收，被甲苯等有機溶劑萃取后用分光光度法進行檢測。本方法常用來檢測水、植物等所含的微量硒元素，也常被用于檢測多糖中的硒。硒標(biāo)準(zhǔn)品濃度與其吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4，帶入1.2.5（2）公式測得其兩種煙葉多糖硒化衍生物取代度分別為：0.20，0.24。

圖4 硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 煙葉多糖及其硒化衍生物對體外抗氧化活性的影響

2.4.1 煙葉多糖及其硒化衍生物對·DPPH自由基清除率的影響 煙葉多糖及其硒化衍生物對·DPPH自由基的清除作用變化圖（圖5）所示，所有樣品都呈現(xiàn)出一種劑量依賴關(guān)系，并且都表現(xiàn)出隨著樣品濃度濃度的增加·DPPH自由基清除率提升的情況，并且在濃度達到0.50 mg/mL時，Se-TPP2的清除率最大達到65.91%。并且在相同濃度下富硒化修飾后的煙葉多糖比煙葉多糖的·DPPH自由基清除能力強，說明富硒化修飾可以增加煙葉多糖對·DPPH自由基清除率的作用。另外從圖中可知，在濃度為0.50 mg/mL時，Se-TPP1的清除率相比于TPP1的清除率增加了17.41%，Se-TPP2的清除率相比TPP2增加了37.57%，從2.3可知，TPP1的取代度小于TPP2，說明取代度越大，則煙葉多糖經(jīng)硒化衍生化后的樣品·DPPH自由基清除率增加率越大。

圖5 煙葉多糖硒化衍生物對·DPPH自由基的清除作用

2.4.2 煙葉多糖及其硒化衍生物對·OH自由基清除率的影響 煙葉多糖及其硒化衍生物對·OH自由基的清除作用變化圖（圖6）所示，所有樣品都呈現(xiàn)出一種劑量依賴性，在圖中濃度范圍內(nèi)，都表現(xiàn)出隨著樣品濃度濃度的增加·OH自由基清除率提升的情況。并且在濃度達到0.50 mg/mL時，Se-TPP2的清除率最大達到60.11%。在相同濃度下富硒化修飾后的煙葉多糖比煙葉多糖的·OH自由基清除能力強，說明富硒化修飾可以增加煙葉多糖對·OH自由基清除率的作用。另外從圖中可知，在濃度為0.50 mg/mL時，Se-TPP1的清除率相比于TPP1的清除率增加了21.21%，Se-TPP2的清除率相比TPP2增加了25.76%，從2.3可知，TPP1的取代度小于TPP2，說明取代度越大，則煙葉多糖經(jīng)硒化衍生化后的樣品·OH自由基清除率增加率越大。

圖6 煙葉多糖硒化衍生物對羥基自由基的清除作用

2.4.3 煙葉多糖及其硒化衍生物對O2-·自由基清除率的影響 煙葉多糖及其硒化衍生物對O2-·自由基的清除作用變化圖（圖7）所示，所有樣品都呈現(xiàn)出一種劑量依賴性，在圖中濃度范圍內(nèi)，都表現(xiàn)出隨著樣品濃度的增加O2-·自由基清除率提升的情況，并且在濃度達到0.50 mg/mL時，Se-TPP2的清除率最大達到64.51%。在相同濃度下富硒化修飾后的煙葉多糖比煙葉多糖的O2-·自由基清除能力強，說明富硒化修飾可以增加煙葉多糖對O2-·自由基清除率的作用。另外從圖中可知，在濃度為0.50 mg/mL時，Se-TPP1的清除率相比于TPP1的清除率增加了27.27%，Se-TPP2的清除率相比TPP2增加了25.11%，從2.3可知，TPP1的取代度小于TPP2，說明取代度越大，則煙葉多糖經(jīng)硒化衍生化后的樣品O2-·自由基清除率增加率越小。

圖7 煙葉多糖硒化衍生物對超氧陰離子自由基的清除作用

3 討論

本研究采用超聲輔助提取，它的原理是利用超聲波的機械波把植物細(xì)胞的細(xì)胞壁及整個生物體進行破碎，從而使植物體內(nèi)的多糖成分釋放出去，溶解到溶劑中達到提取的目的。相比于提取多糖常用的熱水浸提、微波提取和酶提取方法，超聲輔助提取的操作簡單，用時較短，耗費較低，吳楊洋等［19］通過運用4種方法提取松茸多糖，通過對比發(fā)現(xiàn)，超聲輔助提取的多糖提取率最高，蛋白質(zhì)含量最低。

根據(jù)多糖的性質(zhì)不同采用不同的分離方法對多糖進行分離，因為煙葉多糖中存在著許多不同極性大小的多糖，在DEAE-52纖維素柱的吸附程度不同，用不同濃度的鹽溶液洗脫下來多糖，從而達到分離的目的。本研究采用此方法進行多糖分離發(fā)現(xiàn)通過0.30、0.40 mol/L的NaCl洗脫時可以得到2種多糖TPP1和TPP2。楊強［20］提取銀杏果多糖時，采用DEAE-52纖維素柱進行洗脫分離時，得到2種銀杏果多糖GBSP1和GBSP2，武忠偉等［21］提取蟲草多糖時，發(fā)現(xiàn)使用DEAE-32纖維樁進行分離時，可以得到兩種分子量相近的多糖，與本實驗結(jié)果一致。

多糖生物活性的發(fā)揮與其結(jié)構(gòu)有著不可分割的聯(lián)系，因此通過對多糖進行修飾能夠改變其理化性質(zhì)（如溶解性、物性等）及其結(jié)構(gòu)，可以影響多糖的生理活性。本研究對煙葉多糖進行了富硒化修飾，研究其修飾前后對體外抗氧化活性的影響，結(jié)果表明富硒化修飾后的煙葉多糖的活性大于未修飾的煙葉多糖。陳滸華［22］研究富硒化黃芪多糖體外氧化作用時發(fā)現(xiàn)，富硒化黃芪多糖的清除能力大于為富硒化的，并且黃芪富硒化多糖杭氧化活力與多糖濃度和硒含量成正相關(guān)性，與本實驗結(jié)果一致。說明經(jīng)富硒化修飾后的多糖可以提高原多糖的活性。另外，兩種多糖的硒化取代度不同，慕星星等［23］通過研究不同取代度蕨麻硒多糖對體外抗氧化活性的影響發(fā)現(xiàn)，隨著取代度的增加蕨麻硒多糖對O2-·、·OH和·DPPH自由基的清除能力有明顯增加，與本實驗結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

運用超聲輔助提取方法對煙葉中的多糖成分進行提取，經(jīng)過脫色、脫蛋白處理后，利用DEAE-52纖維素柱對多糖分離出了2種組分TPP1和TPP2，對2種多糖組分進行硒衍生化處理，經(jīng)紅外光譜分析可得硒衍生化成功，測得取代度分別為0.20，0.24；后對其進行了體外抗氧化活性實驗，發(fā)現(xiàn)經(jīng)硒衍生化后的煙葉多糖比未修飾的多糖的活性增高，因此對煙葉中多糖成分進行提取分離后，再經(jīng)富硒化衍生化后的多糖可以有效提高其抗氧化活性；并且取代度大的煙葉多糖硒化衍生物對·DPPH自由基和·OH的清除率的增加率變大，但對O2-·自由基的清除率增加率變小。