外源茉莉酸對牛皮杜鵑UV-B輻射緩解作用研究

梁東雨 王禹佳 蘇敖純 徐洪偉 周曉馥

（吉林師范大學(xué) 吉林省植物資源科學(xué)與綠色生產(chǎn)重點實驗室，四平136000）

牛皮杜鵑（Rhododendron chrysanthumPall.）也稱為牛皮茶，屬于杜鵑花科，主要生長在中國長白山海拔1 000-2 506 m的岳樺林下和高山苔原帶［1］，是長白山珍貴的優(yōu)勢種群之一［2］。長白山氣候惡劣，太陽輻射值高，短波長光強烈，生長在高山環(huán)境中的牛皮杜鵑長期適應(yīng)并進化，形成了獨特的生理生化適應(yīng)機制以抵御高寒、干旱和強輻射等逆境傷害［3］。運用蛋白質(zhì)組學(xué)對牛皮杜鵑的抗寒機理研究發(fā)現(xiàn)，在光合作用能量傳遞和蛋白質(zhì)合成上表現(xiàn)出顯著差異［4］。

近年來，由于氟氯烴等化合物排放的增加導(dǎo)致大氣臭氧減少，到達地表的UV-B輻射增強［4］。UV-B輻射是長白山的主要環(huán)境脅迫因子，不僅可以調(diào)節(jié)植物的生理過程，也會作為脅迫信號導(dǎo)致植物細胞的損傷和過氧反應(yīng)［5］。因此，尋找一種能夠緩解UV-B脅迫對植物傷害的方法非常重要。

祁虹等［6］發(fā)現(xiàn)增強UV-B輻射后，植物葉片葉綠體膜系統(tǒng)會受到活性氧自由基的損傷，PSII活性受抑制，同化物的合成減少，抑制CO2的固定，最終導(dǎo)致光合作用減弱。袁孟玲等［7］發(fā)現(xiàn)，芒果成年樹可通過提高SOD、POD、CAT活性以及總黃酮和多酚等物質(zhì)的積累來抵御UV-B輻射造成的氧化損傷。劉曉等［8］認為，外源茉莉酸通過提高抗氧化酶活性，花青素含量等緩解膜損傷，以及增大植物光合天線系統(tǒng)體積緩解UV-B輻射對光合器官的傷害。目前，以茉莉酸（JA）為代表的茉莉酸類物質(zhì)（JAs）被認為是植物面臨生物與非生物脅迫中產(chǎn)生防御反應(yīng)的重要信號分子［9］。Wasternack［10］研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸類物質(zhì)能誘導(dǎo)蘆丁、花青素等黃酮類物質(zhì)的表達，來抵抗植物UV-B脅迫。Conconi 等［11］指出，植物對UV-B輻射的防御需要JAs信號途徑的參與。但關(guān)于外源茉莉酸能夠緩解UV-B輻射對植物傷害的研究仍然屈指可數(shù)。本試驗為進一步研究長白山牛皮杜鵑抗紫外線脅迫的特性提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

牛皮杜鵑收集于中國北方長白山附近（40.10 N，100.10 E）。運送到實驗室后，將植物保存在模擬高山環(huán)境的智能人工氣候室中培養(yǎng)［14/10 h光周期；18/16℃（白天/夜晚）；光子通量密度50 μmol/（m2·s）］。

1.2 方法

1.2.1 實驗設(shè)計 選擇具有相同生長狀態(tài)的牛皮杜鵑組培苗作為研究材料，以預(yù)施加茉莉酸（50μmol/L）的1/4MS培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)牛皮杜鵑4 d作為實驗組，以1/4MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛皮杜鵑作為對照組。將實驗組和對照組分別在PAR和UV-B下輻射48 h。采用混合采樣策略消除個體之間的差異，本研究中進行3次生物學(xué)重復(fù)。PAR照射處理是將400 nm的濾光片（Edmund；Filter Long 2IN SQ，USA）置于培養(yǎng)瓶上。UV-B輻射處理是將295 nm的濾光片（Edmund；Filter Long 2IN SQ，USA）置于培養(yǎng)瓶上。其中PAR光源由暖白色T5x14W熒光燈（Philips，荷蘭）提供。人工UV-B輻射的來源是Ultraviolet-B TL 20W / 01RS熒光管（Philips，荷蘭）提供。樣品有效接收的輻照度為UV-B：2.3 W·/m2，PAR ：μmol 光子 /（m2·s）。

1.2.2 葉綠素?zé)晒鉁y定及相關(guān)參數(shù)計算 利用IMAGING-PAM葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)（Heinz Walz，德國）對其進行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定，在相同葉齡的葉片上選取3個觀測點，暗適應(yīng)20 min后對初始熒光（Fo），最大熒光（Fm）和（Fm'）以及最小熒光（Fo'）進行測定并對以下參數(shù)進行計算，同時對qP、NPQ和ETR快速光響應(yīng)曲線進行測定。

光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的最大量子產(chǎn)量［Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm］、

光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的有效量子產(chǎn)量［Fv'/ Fm'=（Fm'- Fo'）/ Fm'］、

光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的潛在活性［Fv/Fo=（Fm-Fo）/Fo］、

光化學(xué)淬滅系數(shù)［qP=（Fm'-Fs）/（Fm'-Fo'）］、

非光化學(xué)淬滅系數(shù)［NPQ=（Fm-Fm'）/Fm'］。

1.2.3 抗氧化酶、NADPH氧化酶和丙二醛的測定 將0.3 g新鮮葉片在液氮中研磨并用100 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0-7.4）提取。根據(jù)Bradford［12］方法用牛血清白蛋白（BSA）作為標準測定蛋白質(zhì)濃度。使用相應(yīng)的試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京，中國）測量CAT，T-SOD和NADPH氧化酶和MDA的活性。

1.2.4 花青素的測定 花青素用分光光度法測定。將10 mg新鮮葉片在3.6 mL甲醇∶HCl（99∶1）中組成細胞勻漿，室溫下黑暗中提取72 h，在546 nm處讀取提取物的吸光度以測定花色素苷，以葉鮮重為基礎(chǔ)表示吸光度。

1.2.5 統(tǒng)計分析 使用SPSS 16.0（NY，USA）進行單因子方差分析，在結(jié)果中，使用小寫字母來標識顯著差異。使用Sigmaplot 12.5繪制圖表，（Systa software inc芝加哥，伊利諾伊州，美國）。

2 結(jié)果

2.1 外源茉莉酸對UV-B輻射下牛皮杜鵑葉綠素?zé)晒馓卣鞯挠绊?/h3>

2.1.1 葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)的變化 圖1為不同處理下牛皮杜鵑葉片PSII模式中的Fo圖像與Fm圖像。表1中，F(xiàn)o為初始熒光，不同處理后變化相對穩(wěn)定。Fm為最大熒光，F(xiàn)v/Fm為PSII最大光化學(xué)效率，F(xiàn)v'/Fm'為PSII有效光化學(xué)效率，F(xiàn)v/Fo為PSII潛在活性，與PAR組相比UV-B輻射后分別降低20.08%、9.8%、14.26%、18.78%。表明UV-B輻射可使最大熒光和光化學(xué)效率降低，從而使?jié)撛诨钚允軗p傷，最終導(dǎo)致光化學(xué)電子進入碳還原過程受抑制。

qP為光化學(xué)淬滅系數(shù)，反映PSII天線色素吸收光能后可用于光化學(xué)電子傳遞的部分，在UV-B輻射后qP顯著降低，說明PSII光化學(xué)電子傳遞活性降低，與Fv/Fm、Fv'/Fm'和Fv/Fo的下降相吻合。

NPQ表示PSⅡ天線色素吸收光能后不能用于光化學(xué)電子傳遞，而以熱能形式耗散掉未利用光能的部分，在UV-B輻射后呈上升趨勢，說明UV-B 輻射引起了過多的光抑制，NPQ上升有效減輕PSⅡ吸收UV-B而引起的光氧化。JA+UV-B處理后的Fm、Fv/Fm、Fv'/Fm'、Fv/Fo和qP數(shù)值與UV-B輻射相比顯著上升并與PAR組持平，NPQ數(shù)值顯著下降，表明外源茉莉酸預(yù)處理可提高植物光系統(tǒng)Ⅱ的光合電子傳遞。

圖1 不同處理下牛皮杜鵑PSII模式中的Fo圖像與Fm圖像

表1 不同處理對牛皮杜鵑葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)特征的影響

2.1.2 葉綠素?zé)晒饪焖俟忭憫?yīng)曲線的變化 隨著光照強度的增強，JA預(yù)處理的qP快速光響應(yīng)曲線呈現(xiàn)出最佳狀態(tài)，在光強不斷增加的過程中，qP下降的幅度最?。▓D2-A）。不同處理的qP快速光響應(yīng)曲線隨光照強度的增加呈現(xiàn)出不同的變化趨勢（圖2-B），qP快速光響應(yīng)曲線在UV-B輻射處理后下降幅度最大，JA+UV-B處理后下降幅度緩慢，與qP動力學(xué)數(shù)值的下降表現(xiàn)一致。表明外施茉莉酸使植物光能利用率增強。

隨著光照強度的增強，JA預(yù)處理的NPQ快速光響應(yīng)曲線與對照組相比上升幅度大，隨著光強的增加曲線達到平穩(wěn)時數(shù)值較大（圖3-A）。不同處理的NPQ快速光響應(yīng)曲線隨光照強度的增加呈現(xiàn)出不同的變化趨勢（圖3-B），上升幅度大小順序為JA+UV-B＞JA+PAR＞UV-B＞PAR，說明茉莉酸預(yù)處理后使其NPQ快速光響應(yīng)曲線上升，可有效減輕由于植株P(guān)SⅡ吸收過量的光能而引起的光能抑制，是提高植物的抗逆反應(yīng)現(xiàn)象，使其具有更有效的光保護能力。

圖4中rETR為相對電子轉(zhuǎn)移率，曲線高低與光合速率呈正相關(guān)，如圖（圖4-A）所示隨著光照強度的增強，JA預(yù)處理后rETR快速光響應(yīng)曲線上升幅度增大，曲線趨于平穩(wěn)時rETR數(shù)值最高。UV-B輻射后rETR快速光響應(yīng)曲線斜率最小，趨于平穩(wěn)時rETR數(shù)值最低，JA+UV-B處理后使rETR快速光響應(yīng)曲線顯著上升（圖4-B），與PSII的光化學(xué)效率和潛在活性結(jié)果一致，最終說明UV-B輻射導(dǎo)致光合作用原初反應(yīng)過程受抑制，而茉莉酸具有顯著的緩解作用。

圖2 不同處理對牛皮杜鵑光化學(xué)淬滅系數(shù)的影響

圖3 不同處理對牛皮杜鵑非光化學(xué)淬滅系數(shù)的影響

圖4 不同處理對牛皮杜鵑相對電子轉(zhuǎn)移率的影響

2.2 外源茉莉酸對UV-B輻射下牛皮杜鵑抗氧化酶活性的影響

對處理后新鮮葉片的CAT和SOD酶活性進行測量。CAT和SOD兩種抗氧化酶是植物體內(nèi)活性氧的清除劑。CAT可以將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，并與SOD協(xié)同反應(yīng)，使活性氧維持在最低水平，由圖（5-A）所示，JA預(yù)處理可顯著提高SOD活性。UV-B輻射可顯著降低CAT活性（圖5-B），與PAR處理相比降低75.31%。JA+PAR處理使CAT活性顯著升高，是PAR處理的1.82倍。JA+UV-B處理使CAT活性維持對照水平。說明UV-B輻射導(dǎo)致其細胞內(nèi)自由基數(shù)量增加，活性氧含量升高，外施茉莉酸預(yù)處理可緩解UV-B的脅迫效應(yīng)。

圖5 不同處理對牛皮杜鵑抗氧化劑活性的影響

2.3 外源茉莉酸對UV-B輻射下牛皮杜鵑脂質(zhì)過氧化和NADPH氧化酶活性的影響

對牛皮杜鵑葉片進行脂質(zhì)過氧化和NADPH氧化酶活性測定，與PAR組相比，UV-B輻射使MDA含量維持在對照水平（圖6-A），NADPH氧化酶活性顯著上升了48.53%（圖6-B），JA+PAR處理后MDA含量和NADPH氧化酶活性顯著上升，JA+UV-B處理后MDA含量下降到對照水平，由于長白山牛皮杜鵑葉片具有較厚的角質(zhì)層和較發(fā)達的柵欄組織，可減緩葉片受到強輻射的損傷，而單獨使用JA預(yù)處理可能導(dǎo)致牛皮杜鵑葉片膜脂過氧化，JA和UV-B共同處理能有效減緩葉片損傷程度的作用。

圖6 不同處理對牛皮杜鵑脂質(zhì)過氧化和NADPH氧化酶活性的影響

2.4 外源茉莉酸對UV-B輻射下牛皮杜鵑花青素含量的影響

對牛皮杜鵑進行花青素含量測定，與PAR組相比，UV-B輻射使花青素含量顯著降低33.13%。與UV-B輻射相比，JA+UV-B處理的花青素含量顯著上升38.78%，并與PAR處理持平（圖7）?？赡苁峭蝗贿M行UV-B輻射使其葉片的花青素含量驟減，外施JA預(yù)處理后植株葉片合成了大量花青素等紫外防御物質(zhì)，可吸收部分紫外線，使進入葉肉細胞的UV-B輻射量減少，有效地抑制UV-B輻射對葉綠體的破壞。

圖7 不同處理對牛皮杜鵑花青素含量的影響

3 討論

UV-B輻射通常對植物的生理生化過程產(chǎn)生一定影響。研究人員對植物體內(nèi)的光合元件進行研究，發(fā)現(xiàn)UV-B輻射對光合系統(tǒng)的影響主要包括葉綠體類囊體膜結(jié)構(gòu)受損傷、PSⅡ的活性喪失［13］、加速光系統(tǒng)Ⅱ核心蛋白D1和D2的降解、Rubisco酶活力下降［14］等方面。本實驗中，牛皮杜鵑葉片葉綠素?zé)晒馐艿経V-B輻射的影響，葉綠素?zé)晒馐菣z測光合作用的有效探針，與電子傳遞，ATP合成以及CO2的固定有關(guān)，直接反映出光合作用過程中動態(tài)變化［15］。在UV-B輻射期間，光系統(tǒng)Ⅱ的Fm、Fv/Fo、光化學(xué)效率和光化學(xué)淬滅顯著降低，qP和rETR快速光響應(yīng)曲線下降幅度增大。與鄭翔等［16］研究結(jié)果一致，其原因可能是UV-B輻射使與PSII緊密結(jié)合的質(zhì)體鯤QA過度還原［17］，從而阻礙光合電子傳遞速率，抑制光合原初反應(yīng)。NPQ在UV-B輻射后顯著上升，表明脅迫后光合色素吸收的光能不能全部用于光合電子傳遞，大部分以熱能的形式耗散掉，從而保護植物PSII反應(yīng)中心。UV-B脅迫作為外界的誘導(dǎo)因子可激發(fā)茉莉酸的合成途徑，同時外源茉莉酸會誘導(dǎo)JlPs（茉莉酸誘導(dǎo)蛋白組）的表達［18］。本試驗結(jié)果表明，JA+UV-B處理后Fm、Fv/Fm、Fv'/Fm'、Fv/Fo和qP數(shù)值與UV-B輻射相比顯著上升并與PAR組持平，并且qP、NPQ和rETR快速光響應(yīng)曲線呈現(xiàn)出最佳狀態(tài)，說明外源施加茉莉酸可緩解外界因素對牛皮杜鵑的傷害，同時提高牛皮杜鵑的抗逆性，使其更能適應(yīng)苛刻的環(huán)境。

植物正常生長情況下，體內(nèi)的活性氧（ROS）產(chǎn)生和消除會維持動態(tài)平衡，而UV-B輻射等逆境脅迫可能打破了這種平衡，使其產(chǎn)生大量自由基和H2O2，活性氧疊加累積會直接或間接地對脂類和不飽和脂肪酸進行攻擊，MDA來自不飽和脂肪酸的降解［19］，可結(jié)合糖蛋白引起膜蛋白變性，細胞膜的選擇透過性和流動性受影響，MDA含量反映了植物受到脅迫后損傷的程度［20］。SOD是保護植物免受ROS損害的第一線酶，將O2轉(zhuǎn)化為H2O2，NADPH氧化酶途徑也產(chǎn)生H2O2，可引起氧化猝滅，CAT將H2O2轉(zhuǎn)化為水和氧，從而去除有毒的自由基。本試驗中UV-B輻射使SOD酶活性顯著提高，CAT活性顯著降低，NADPH氧化酶活性顯著升高，致使H2O2含量增加。說明UV-B輻射使細胞內(nèi)清除活性氧能力下降，活性氧大量積累，最終導(dǎo)致?lián)p傷出現(xiàn)。JA+UV-B處理后誘導(dǎo)CAT活性上升到對照水平并且MDA含量降低到對照水平。這與遲虹等［21］的結(jié)果一致，茉莉酸可激發(fā)植物的抗氧化系統(tǒng)的活性，進而控制體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的含量，緩解膜脂過氧化的程度，減緩細胞受活性氧的傷害。

植物體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)包括抗氧化酶主要有丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）及紫外吸收復(fù)合物等。黃酮類化合物（包括花青素）是植物抵御UV-B輻射的關(guān)鍵物質(zhì)，可有效吸收或過濾進入葉片的紫外光子，黃酮類化合物的積累是植物對UV-B輻射的一種適應(yīng)和保護措施［22］。本試驗發(fā)現(xiàn)JA+UV-B處理顯著增加花青素含量，表明在UV-B輻射下進行外源茉莉酸處理可促進牛皮杜鵑體內(nèi)花青素的合成，部分吸收紫外強光，減緩UV-B輻射對植物的傷害。正如王茹丹等［23］研究，認為增加植物體內(nèi)花青素含量可抵御UV-B輻射對葉片造成的傷害。

4 結(jié)論

綜上所述，UV-B輻射和外源茉莉酸預(yù)處理對各個生理指標具有顯著作用，外源茉莉酸部分抵消了UV-B輻射的負面影響，尤其是通過增強植物光合作用，提高抗氧化酶活性和花青素等物質(zhì)的積累，進而提高植株的防御能力。