基于瞬時表達系統(tǒng)的水稻miRNA靶基因快速驗證系統(tǒng)的建立

胡積祥 曹雅倩 朱秀梅 余超 田芳 楊鳳環(huán) 陳華民 何晨陽

（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

microRNA（miRNA）普遍存在于真核生物細胞內(nèi)，是一類長度為21-24 nt的非編碼RNA，通過剪切互補的靶基因mRNA或抑制靶基因的翻譯來行使其生物學功能［1-2］。miRNA不僅調(diào)控了植物的生長發(fā)育過程，而且在植物抗逆、抗病的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，主要是通過調(diào)控相關(guān)內(nèi)源基因的表達使植物對外界脅迫作出響應(yīng)［3］。miR393通過下調(diào)生長素受體基因TIR1和AFB的表達阻斷生長素信號的傳導途徑，提高擬南芥對細菌性病害的抗性［4］。miR169通過調(diào)控靶基因NF-YA5（Nuclear factor YA5），在擬南芥抗旱中起著重要的作用［5］。隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，大量新的miRNA被發(fā)現(xiàn)。目前 miRBase 22.1（http：//www.mirbase.org/）版本已經(jīng)收錄了38 589個miRNA，然而大多數(shù)miRNA的生物學功能尚不明確。miRNA的功能解析，最關(guān)鍵的是鑒定出miRNA的靶基因。miRNA靶基因的鑒定 常 用 的 方 法 有 Northern blot［6］、Western Blot［7］、降 解 組 測 序（Degradome sequencing）［8］、MirTrap、RACE（Rapid amplication of cDNA ends）［9］和熒光素酶報告系統(tǒng)［10-11］。利用生物信息學預(yù)測miRNA靶基因，不同的方法和不同的參數(shù)條件都可能會得到不同的靶基因。因此，對預(yù)測的靶基因進行實驗驗證是必需的［12-13］。鑒于這一驗證過程的復雜性、耗時性，建立一種準確且快速地驗證miRNA靶基因的方法對研究miRNA的生物學功能具有非常重要的意義。基因的瞬時表達技術(shù)為miRNA靶基因的快速驗證提供了支撐。在植物中，目前大多數(shù)靶基因驗證的瞬時表達系統(tǒng)都是基于農(nóng)桿菌介導的煙草瞬時表達體系，主要是將miRNA與帶有GFP（或YFP）的候選靶基因同時轉(zhuǎn)染到煙草葉片中，通過熒光強弱來驗證靶基因［10］。水稻是單子葉植物，運用煙草瞬時表達系統(tǒng)驗證水稻miRNA的靶基因不夠嚴謹，畢竟煙草細胞不同于水稻細胞。GFP發(fā)出熒光需要短波光的激發(fā)，而短波光對植物細胞有毒害作用。因此，在水稻原生質(zhì)體內(nèi)，利用化學發(fā)光的熒光素酶LUC來驗證水稻miRNA靶基因更具有優(yōu)勢。

miR169是植物體內(nèi)比較保守的一個大家族，miR169o可以被干旱脅迫誘導表達，而過表達miR169o則增強了植物對干旱的耐受性［14］。此外，過表達miR169o能促進水稻的生長，降低水稻對白葉枯病的抗病性［15］。前期通過qRT-PCR和5'RACE證明了靶基因LOC_Os03g48970.1（后文簡稱48970）受miR169o的抑制作用［16］。因此，本實驗以miR169o及其靶基因48970的對應(yīng)關(guān)系為參照，系統(tǒng)研究了在農(nóng)桿菌介導的煙草和PEG4000介導的水稻原生質(zhì)體兩種瞬時表達體系下miRNA的動態(tài)變化，獲得了各自水稻靶基因驗證的最適體系，建立了水稻miRNA靶基因驗證的快速檢測系統(tǒng)，以期對水稻miRNA功能的解析提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

NEB限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶；天根生物科技公司質(zhì)粒提取試劑盒；Invitrogen公司TRIzol試劑；諾唯贊公司cDNA轉(zhuǎn)錄酶和實時定量PCR試劑盒；日本Yakult公司纖維素酶R-10和離析酶R-10；pUC19-nLUC，pCAMBIA1300載體，農(nóng)桿菌GV3101，水稻日本晴，本氏煙均為實驗室所保存。大腸桿菌感受態(tài)為全式金Trans1-T1 Phage Resistant；抗生素及濃度：氨芐青霉素100 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL，慶大霉素50 μg/mL；熒光活體成像儀為BERTHOLD TECHNOLOGIES LB 985 NightSHADE；Promega Luminometor熒光活性定量儀；ABI 7500 實時定量PCR儀。

所用引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 水稻原生質(zhì)體的制備 采用酶解法制備原生質(zhì)體［17］。日本晴種子于1/2 MS培養(yǎng)基（2.21 g/L MS，20 g/L Sugar，3‰植物凝膠）中28℃培養(yǎng)10 d-12 d，將幼苗莖部切成0.5 mm大小，立即放入有酶解液（0.6mol/L甘 露 醇，1.3% Cellulose，0.75% Macerozyme，20 mmol/L MES pH5.7，55℃加熱10 min，冷卻后加入 0.1% BSA，2 mmol/L CaCl2，5 mmol/L β-巰基乙醇，50 μg/mL羧芐，過濾除菌）的三角瓶中置于28℃，70 r/min的搖床中酶解6 h-8 h。35 μm尼龍篩網(wǎng)過濾酶解液，W5溶液（9.0 g/L NaCl，18.4 g/L CaCl2，0.37 g/L KCl，0.9 g/L Glucose，0.3 g/L MES，KOH 調(diào) pH至5.7，滅菌）反復沖洗殘渣，離心（3 200 r/min，5 min）收集原生質(zhì)體，棄上清。

表1 實驗所用引物

1.2.2 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 適量W5溶液重懸原生質(zhì)體至濃度在（2-5）×106個細胞/mL，100 μL原生質(zhì)中加入4 μg質(zhì)粒，混勻后加入110 μL 40% PEG溶液（4 mL 配 方 ：1.6 g PEG，400 μL 1 mol/L CaCl2，1 333.3 μL 0.6 mol/L甘露醇，加滅菌水定容至4mL），混勻后室溫孵育15 min，加入1 mL W5，顛倒混勻，3 200 r/min，離心5 min，棄上清，再加入1 mL W5，3 200 r/min，離心5 min，棄上清，加入1 mL W5溶液，靜置培養(yǎng)。

1.2.3 原生質(zhì)體總RNA的提取 參照Trizol說明書，稍作改進提取RNA，加入500 μL Trizol，劇烈震蕩，室溫放置2-3 min，加入200 μL氯仿，顛倒混勻，室溫放置5 min，4℃，12 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清，加入等體積的異丙醇，室溫放置10 min，4℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清，75%乙醇洗滌沉淀，最后用30 μL RNase-free的ddH2O溶解。

1.2.4 cDNA的反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR 按諾唯贊公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行去基因組和反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)時加入0.5 μL 10 μmol/L的頸環(huán)引物。參照諾唯贊AceQ qPCR SYBR Green Master試劑盒進行qRT-PCR檢測。miR169o相對表達量按照2-ΔΔCt法計算，其中 ΔΔCt =（Ct樣品-CtU6）TimeX-（Ct對照樣品-CtU6）Time12，TimeX表示任意時間點，Ct為熒光閾值。

1.2.5 LUC活性的檢測 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后不同時間點取樣，取150 μL樣品，劇烈震蕩，加入至不透明96孔板中，加入0.75 μL LUC底物，利用Luminometer檢測LUC的相對活性。取500 μL樣品至24孔板中，加入2.5 μL LUC底物，利用CCD成像檢測熒光。

1.2.6 農(nóng)桿菌介導的煙草瞬時表達［18］將pCAMBIA1300-miR169o，pCAMBIA1300-LUC，pCAMBIA1300-LUC-48970，pCAMBIA1300-LUC-48970m3等質(zhì)粒分別導入到農(nóng)桿菌GV3101，涂布在LB固體培養(yǎng)基上（卡那霉素 50 μg/mL+慶大霉素50 μg/mL），PCR驗證篩選陽性轉(zhuǎn)化子。煙草培養(yǎng)條件，每周期光照16 h，25℃，黑暗8 h，22℃，注射一個月左右的煙草。在注射前2 d，從平板上挑取單菌落搖菌，28℃過夜培養(yǎng)，然后按照1∶1 000的比例轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中。5 000 r/min，22℃，離心5min收集菌體。用含有10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES，150 μmol/L乙酰丁香酮，pH5.7的轉(zhuǎn)化緩沖液重懸菌體至終濃度為OD600=1.0，室溫靜置3 h后，按照各處理將兩種農(nóng)桿菌按體積1∶1混合，注射煙草葉片。不同時間取樣，觀察LUC活性以及檢測miR169o的表達量。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)載體的構(gòu)建

2.1.1 miR169o過表達載體的構(gòu)建 PCR擴增得到444 bp的miR169o前體基因（MIR169o），經(jīng)BamH I和PstI酶切后插入同樣酶切的pUC19-nLUC載體上，得到實驗所需的miR169o過表達載體pUC19-miR169o（ 圖 1-A）。pUC19-miR169o與 pCAMBIA-1300-nLUC分別用SacI和PstI消化后連接，將MIR-169o插入pCAMBIA1300載體中，得到pCAMBIA-1300-miR169o（圖 1-B）。

圖 1 pUC19-miR169o（A）和 pCAMBIA1300-miR169o（B）載體圖

圖2 pUC19-LUC（A）和pCAMBIA1300-LUC（B）載體圖

2.1.2 pUC19-LUC和pCAMBIA1300-LUC載體的構(gòu)建 分別將pUC19-nLUC和pCAMBIA1300-nLUC載體中的nLUC片段替換為全長的LUC片段，同時引入SacI、SalI、PstI等酶切位點，分別得到適用于水稻原生質(zhì)體系統(tǒng)和煙草瞬時表達系統(tǒng)的pUC19-LUC（圖2-A）和pCAMBIA1300-LUC載體（圖2-B）。

2.1.3 LUC-靶基因融合表達載體的構(gòu)建 分別從 RGAP（Rice Genome Annotation Project） 和miRBase數(shù)據(jù)庫下載LOC_Os03g48970.1的CDS序列和miR169o的成熟序列。通過psRNA Target（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/） 分 析， 發(fā)現(xiàn)miR169o結(jié)合在48970的3' UTR區(qū)（堿基位置為1 237-1 256）。我們將這20個堿基的結(jié)合序列插入到LUC基因的3' UTR區(qū)（圖3-A），得到實驗所需的 pUC19-LUC-48970和 pCAMBIA1300-LUC-48970。miRNA與靶基因通過堿基互補配對方式結(jié)合，而結(jié)合的核心區(qū)域位于miRNA第9-11個堿基［19］。將CTA 3個堿基插入靶基因，插入位置正好對應(yīng)于miRNA第10-11個堿基中間，使得miR169o無法剪切48970m3。將48970m3序列插入到LUC基因3' UTR中，得到對miR169o不敏感的48970m3表達載體（圖3-B），即pUC19-LUC-48970m3或pCAMBIA1300-LUC-48970m3。

圖3 LUC-48970（A）和LUC-48970m3（B）載體示意圖

2.2 水稻原生質(zhì)體系統(tǒng)的靶基因驗證體系

將pUC19-miR169o分別與pUC19-LUC，pUC19-LUC-48970和pUC19-LUC-48970m3共轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體。利用熒光活體成像儀和Luminometor檢測轉(zhuǎn)化12 h、18 h、24 h及36 h后LUC活性，發(fā)現(xiàn)在24 h時，熒光亮度最大。在3組組合中，pUC19-miR169o與pUC19-LUC-48970共轉(zhuǎn)化后，熒光活性最弱（圖4-A和4-B），表明miR169o可以抑制靶基因LOC_Os03g48970.1的轉(zhuǎn)錄表達，而水稻原生質(zhì)體系統(tǒng)可以用于水稻miRNA靶基因的檢測。此外，利用莖環(huán)qRT-PCR檢測了轉(zhuǎn)化后不同時間點miR169o的表達水平，在轉(zhuǎn)化后12-36 h之間miR169o的水平與表達時間具有正相關(guān)性，12 h表達量最低，而在36 h的表達量最高（圖4-C）。綜合熒光檢測效果和miR169o的表達水平，建議miRNA靶基因驗證的恰當檢測時間在水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后24-36 h之間。

2.3 煙草瞬時表達系統(tǒng)的靶基因驗證體系

將pCAMBIA1300-miR169o過表達載體、pCAMBIA1300-LUC-48970和pCAMBIA1300-LUC-48970m3融合載體，分別導入農(nóng)桿菌中，共注射煙草葉片進行共表達。在注射煙草48 h、72 h和96 h后檢測LUC活性，發(fā)現(xiàn)在過表達72 h的熒光強度最高（圖5-A）；miR169o和48970共表達中的LUC活性明顯弱于miR169o和LUC，miR169o和48970m3共表達中的LUC活性，表明煙草瞬時表達系統(tǒng)可以用于水稻miRNA的靶基因驗證。此外，在24 h、48 h、72 h和96 h四個時間點分別取樣，以24 h LUC與miR169o共注射處理作為對照，以EF1為內(nèi)參，通過莖環(huán)qRT-PCR檢測成熟miR169o的動態(tài)水平。結(jié)果表明注射農(nóng)桿菌24-96 h后，成熟miR169o的表達水平逐漸增高，在48 h時，miR169o的表達水平已經(jīng)提高到20倍左右（圖5-B）。因此，綜合熒光強度測定和成熟miR169o的水平，建議miRNA靶基因驗證的恰當檢測時間在煙草瞬時表達后48-72 h之間。

3 討論

在miRNA靶基因驗證實驗中，前人更多地關(guān)注靶基因的表達，而鮮有關(guān)注miRNA的動態(tài)表達。如Li等［20］共表達了artificial miRNA與其對應(yīng)的靶基因，通過Western Blot分析靶基因編碼產(chǎn)物的表達差異；Martinho等［21］過表達了miRNA，檢測了轉(zhuǎn)錄水平上內(nèi)源靶基因的差異性表達。而本研究測定了在共表達后不同時間點LUC活性和miRNA表達水平，從而可以動態(tài)反映miR169o對48970的特異調(diào)控過程。

無論是在水稻原生質(zhì)體系統(tǒng)還是在煙草瞬時表達系統(tǒng)中，miR169o的表達水平總體上都會隨著時間的延長而呈現(xiàn)一定的上升。三種處理組合間miR169o的表達水平雖然存在著一定程度的差異，但都是在miR169o和LUC-48970組合中miR169o的表達水平較低，而其它兩種組合中miR169o水平相對較高。相較于其它組合，miR169o和LUC-48970組合中的LUC活性明顯降低，表明靶基因的轉(zhuǎn)錄被明顯地抑制。因此，本系統(tǒng)中miRNAs水平的差異對檢測結(jié)果并沒有造成影響，究其表達水平差異的具體原因則尚不明確。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的水稻miRNA在應(yīng)對生物脅迫和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，而在解析這些miRNA調(diào)控機制的過程中最重要的內(nèi)容是明確miRNA的靶基因及其功能。本文建立的靶基因驗證系統(tǒng)，可以為miRNA靶基因的篩選、驗證提供極大的便利條件，節(jié)省時間和實驗成本，為大批量的miRNA功能的解析提供技術(shù)支撐。當然，由于miRNA和LUC融合基因都處于動態(tài)的表達過程中，完全的均一化各處理中miRNA和LUC融合基因的轉(zhuǎn)化效率和表達量是比較困難的，因此，利用本系統(tǒng)進行篩選驗證，并結(jié)合其它靶基因驗證方法精確定位靶位點才是miRNA靶基因驗證的完美解決手段。

圖4 水稻原生質(zhì)體表達系統(tǒng)中的靶基因驗證

圖5 煙草瞬時表達系統(tǒng)中miR169o的靶基因驗證

4 結(jié)論

本研究確立了適合水稻miRNA靶基因驗證的系統(tǒng)。在水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系中，恰當?shù)臋z測時間點在轉(zhuǎn)化后24-36 h；在煙草瞬時表達體系中，恰當?shù)臋z測時間點在共注射后48-72 h。