豆科植物-根瘤菌共生固氮的免疫調(diào)控機(jī)制

董汝 曹揚(yáng)榮

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070）

氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的主要營(yíng)養(yǎng)元素之一，然而自然界中大量的氮?dú)獗仨毐贿€原為硝態(tài)氮或者氨態(tài)氮后才能被植物吸收利用。在自然界氮素還原中，生物固氮占據(jù)主導(dǎo)地位，它是指分子態(tài)氮?dú)庠谏矬w內(nèi)被還原成氨的過(guò)程。目前發(fā)現(xiàn)只有原核生物能夠進(jìn)行生物固氮［1］。在生物固氮中，根瘤菌與豆科植物形成的共生固氮是目前已知效率最高且被研究最為廣泛的一種。然而，根瘤菌的宿主范圍主要限于豆科植物，這是限制其被廣泛應(yīng)用于非豆科植物（如禾本科作物）的瓶頸［2］。因此，擴(kuò)大根瘤菌宿主范圍乃至實(shí)現(xiàn)非固氮植物的結(jié)瘤及固氮是目前農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和養(yǎng)分高效利用的關(guān)鍵途徑之一。

在根瘤菌-豆科植物共生固氮中，豆科植物形成的根瘤是根瘤菌進(jìn)行生物固氮的場(chǎng)所。根瘤菌與豆科植物共生固氮包括兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立且密不可分的途徑，即根瘤菌入侵和根瘤發(fā)育［3-4］。植物根部釋放出的類黃酮化合物被匹配的根瘤菌感知，并激活nodD基因表達(dá)，誘導(dǎo)合成并釋放結(jié)瘤因子［5］。這些結(jié)瘤因子進(jìn)而被植物結(jié)瘤因子受體蛋白復(fù)合物識(shí)別，如百脈根中的NFR1/NFR5（Nod factor receptor 1 /Nod factor receptor 5）與共生受體激酶SymRK（Symbiosis Receptor Kinase）形成的復(fù)合物，激活下游共生信號(hào)通路［6］。近年來(lái)，與共生受體激酶有關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制得到廣泛研究，如Nick4（NFR5-interacting cytoplasmic kinase 4）能夠和NFR5相互作用，連接了結(jié)瘤因子信號(hào)識(shí)別和根瘤器官發(fā)生的信號(hào)通路［7］。小 G 蛋白 ROP6（Rho-like GTPase 6）能夠與NFR5互作調(diào)控侵染線的生長(zhǎng)和根瘤發(fā)生［8］。百脈根中的類二氫黃酮醇蛋白DFL1（Dihydroflavonol-4-reductase-like protein 1）能夠與NFR5互作，揭示信號(hào)通路可能通過(guò)負(fù)反饋方式直接調(diào)控類黃酮的合成［9］。共生信號(hào)的激活最終可以引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流［10］。DMI1（Does not Make Infections 1）作為核膜上的離子通道，能夠通過(guò)控制離子出入調(diào)節(jié)共生信號(hào)［11］。細(xì)胞核內(nèi)的鈣離子振蕩被CCaMK（Calciumand Calmodulin-dependent protein Kinase）蛋白激酶解碼，CCaMK通過(guò)磷酸化CYCLOPS，CYCLOPS作為能夠結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄激活子，能夠與DELLA蛋白、NSP1（Nodulation signaling pathway 1） 蛋 白、NSP2（Nodulation signaling pathway 2）蛋白等形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物共同激活共生相關(guān)基因的表達(dá)［12-14］。根瘤菌對(duì)豆科植物類黃酮類化合物的響應(yīng)具有特異性，并且豆科植物相應(yīng)根瘤菌結(jié)瘤因子也具有一定特異性。因此，豆科植物分泌的類黃酮類化合物以及根瘤菌結(jié)瘤因子的結(jié)構(gòu)差異是調(diào)控根瘤菌宿主范圍的一個(gè)關(guān)鍵。根瘤菌侵染宿主植物后，根瘤菌沿侵染線到達(dá)并定殖于根部皮層細(xì)胞，誘導(dǎo)根瘤原基發(fā)育。根據(jù)形態(tài)結(jié)構(gòu)，根瘤大致分為定型根瘤和不定型根瘤。定型根瘤的根瘤原基起始于外皮層細(xì)胞，而不定型根瘤的根瘤原基起始于內(nèi)皮層細(xì)胞［15］。在根瘤共生細(xì)胞中，根瘤菌分化形成能夠固氮的類菌體［16］，從而將空氣中氮?dú)膺€原為氨供植物吸收利用。

從進(jìn)化上推測(cè)，根瘤菌-豆科植物互作起源于病原菌-植物的病原反應(yīng)（Pathogenesis），作為一種外來(lái)微生物，根瘤菌入侵仍然會(huì)激發(fā)植物一定的免疫反應(yīng)。如在共生互作早期，植物一些免疫應(yīng)答基因表達(dá)量上調(diào)，這些防御反應(yīng)在隨后的共生互作中被逐漸降低或者抑制。而作為宿主，植物也進(jìn)化出相應(yīng)機(jī)制來(lái)抑制自身免疫反應(yīng)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)與根瘤菌互惠共生。如苜蓿NAD1（Nodules with Activated Defence）、DNF2（Defective in Nitrogen Fixation 2）等蛋白的缺失特異激發(fā)了根瘤中免疫反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致根瘤菌定殖和類菌體發(fā)育中的終止［17-19］。根瘤菌和病原細(xì)菌與植物的互作方式是相似的，即不論是共生體（如根瘤菌）還是病原體（如病原假單胞桿菌）抑制植物免疫反應(yīng)的策略也有可能大致類似。那么植物是如何識(shí)別和區(qū)分根瘤菌與病原菌，又是如何調(diào)控自身免疫反應(yīng)來(lái)“邀請(qǐng)”根瘤菌而不是病原菌的入侵和定殖？總之，宿主防御反應(yīng)與共生反應(yīng)的平衡對(duì)于根瘤菌入侵和根瘤發(fā)生是至關(guān)重要的。我們將從根瘤菌MAMP、根瘤菌三型效應(yīng)蛋白以及根瘤菌定殖等3個(gè)方面論述根瘤發(fā)生過(guò)程中宿主和根瘤菌對(duì)植物免疫反應(yīng)的調(diào)控。

1 根瘤菌MAMP在共生互作中作用

植物可以通過(guò)模式識(shí)別受體（Pattern Recognition Receptor，PRR）感知微生物相關(guān)分子模式（Microbe-Associated Molecular Patterns，MAMP）并激發(fā)免疫反應(yīng)，被稱為PTI反應(yīng)（Pattern-triggered immunity，模式觸發(fā)的免疫反應(yīng)）［20］。該免疫反應(yīng)在抵御病原菌入侵和調(diào)控植物周圍環(huán)境中微生物種類和組合起重要作用。而微生物MAMP和植物PRR的多樣化組合正是調(diào)控與不同微生物互作的一個(gè)關(guān)鍵因素［21］。根瘤菌是一種典型的革蘭氏陰性菌。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁分為外壁層和內(nèi)壁層。外壁層最外層是脂多糖，內(nèi)壁層含有一層結(jié)構(gòu)疏松的肽聚糖。那么根瘤菌和病原菌表面具有的相同的分子模式是怎樣被植物識(shí)別的；在根瘤發(fā)生和共生建立的過(guò)程中，豆科植物產(chǎn)生的免疫反應(yīng)又是如何被根瘤菌和植物調(diào)控的？

在擬南芥中，細(xì)菌鞭毛蛋白（flagellin或flg22，代表N端保守的22個(gè)氨基酸肽段）被LRR（Leucinerich repeat）受體激酶FLS2（Flagellin Sensing 2）識(shí)別［22］。另一個(gè)LRR受體激酶BAK1（BRI1-associated receptor kinase）作為細(xì)菌鞭毛蛋白的共受體介導(dǎo)了免疫反應(yīng)的激活［23］。flgII-28，細(xì)菌鞭毛蛋白上另一個(gè)激發(fā)免疫反應(yīng)的肽段，能夠被茄科植物的FLS3（Flagellin-Sensing 3）識(shí)別并激發(fā)免疫反應(yīng)［24］。同樣，根瘤菌，如百脈根中慢生型根瘤菌（Mesorhizobium loti），接種植物后也激發(fā)百脈根免疫反應(yīng)，這暗示根瘤菌也可能有激發(fā)免疫反應(yīng)的MAMP。被病原菌flg22處理后的百脈根與根瘤菌共生識(shí)別大大降低，最終導(dǎo)致根瘤數(shù)目減少和根瘤固氮酶活降低，然而在百脈根根瘤發(fā)生后，flg22處理并沒(méi)有抑制根瘤數(shù)目和固氮酶活，這表明植物PTI反應(yīng)特異抑制根瘤菌入侵。然而從M. loti純化的鞭毛蛋白并不能誘導(dǎo)百脈根的免疫反應(yīng)。通過(guò)對(duì)比f(wàn)lg22序列發(fā)現(xiàn)，根瘤菌的鞭毛蛋白氨基酸序列發(fā)生變異，這些突變可能是植物識(shí)別和激發(fā)植物免疫反應(yīng)的關(guān)鍵［25］。因此，這可以從進(jìn)化上解釋根瘤菌可以通過(guò)鞭毛蛋白序列的突變逃避植物FLS2介導(dǎo)免疫反應(yīng)的抑制。

此外，根瘤菌還有很多多糖類的MAMP，如結(jié)瘤因子、脂多糖、胞外多糖和肽聚糖等。在擬南芥中受體激酶CERK1（Chitin elicitor receptor kinase 1）和受體蛋白LYM1/LYM3以及水稻中的兩個(gè)LysM-containing蛋白LYP4和LYP6共同介導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖PGN介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［26-27］。但是目前根瘤菌的細(xì)胞壁組成成分肽聚糖有何作用仍未知。

十字花科植物中的Lectin S-domain受體激酶LORE介導(dǎo)了病原菌脂多糖引起的免疫反應(yīng)［28］。而水稻中的OsCERK1蛋白也與脂多糖介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān)［29］。那么根瘤菌的脂多糖在共生中具有什么功能？據(jù)報(bào)道苜蓿根瘤菌脂多糖突變體Rm6963與苜蓿結(jié)瘤時(shí)間延遲并且與野生型根瘤菌相比結(jié)瘤競(jìng)爭(zhēng)能力降低［30］，這表明根瘤菌脂多糖在共生中起正調(diào)控作用。但是脂多糖在根瘤菌與豆科植物的分子對(duì)話中如何發(fā)揮正向功能，植物中的哪些蛋白參與了這個(gè)過(guò)程，這些問(wèn)題仍然需要我們?nèi)ヌ剿鳌?/p>

真菌細(xì)胞壁組成成分幾丁質(zhì)是一種被廣泛研究的MAMP。在擬南芥中，AtCERK1和AtLYK5形成的受體復(fù)合物共同介導(dǎo)幾丁質(zhì)引起的免疫反應(yīng)［31-32］。根瘤菌結(jié)瘤因子的化學(xué)結(jié)構(gòu)式是脂殼修飾的短鏈幾丁質(zhì)［33-34］。且結(jié)瘤因子受體，如百脈根LjNFR1/LjNFR5和苜蓿MtLYK3/MtNFP，與幾丁質(zhì)受體具有較高同源性［35-39］。在本氏煙草中過(guò)表達(dá)LjNFR1/LjNFR5或者M(jìn)tLYK3/MtNFP可以激發(fā)葉片細(xì)胞程序性死亡［40］，這暗示共生信號(hào)通路在進(jìn)化上與幾丁質(zhì)激發(fā)的免疫信號(hào)通路具有相關(guān)性。最近研究還發(fā)現(xiàn)，除了在共生反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，結(jié)瘤因子還可以誘導(dǎo)細(xì)菌鞭毛蛋白受體FLS2的降解，進(jìn)而抑制MAMP激發(fā)的植物免疫反應(yīng)，擬南芥AtLYK3在介導(dǎo)結(jié)瘤因子抑制植物免疫中起關(guān)鍵作用［41］。那么，豆科植物中AtLYK3的同源蛋白是否存在抑制植物免疫反應(yīng)的功能還有待于研究。

除此之外，有證據(jù)表明根瘤菌產(chǎn)生的胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）也參與了根瘤共生。根瘤菌能夠產(chǎn)生胞外多糖，并分泌到胞外。這個(gè)特性顯示出它有可能和結(jié)瘤因子一樣，是第一批接觸到宿主的分子模式［42］。在百脈根中EPS的LysM受體EPR3能夠區(qū)分匹配和不匹配的根瘤菌的胞外多糖。EPS介導(dǎo)的EPR3識(shí)別通路促進(jìn)了根皮層細(xì)胞內(nèi)的侵染以及根和根瘤菌的有效互作。使用根瘤菌胞外多糖突變體R7AexoB接種野生型百脈根和epr3突變體顯示EPR3可能存在共受體［43］。

在MAMP觸發(fā)的植物PTI反應(yīng)中，對(duì)于MAMP的識(shí)別通常是由多個(gè)受體蛋白形成的復(fù)合物共同進(jìn)行的。AtFLS2能夠和AtBAK1形成共受體復(fù)合物共同介導(dǎo)flg22引起的免疫反應(yīng)；AtCERK1能夠和AtLYK5形成共受體復(fù)合物共同介導(dǎo)幾丁質(zhì)引起的免疫反應(yīng)；水稻中的OsCERK1能夠和OsCEBiP形成共受體復(fù)合物介導(dǎo)幾丁質(zhì)引起的免疫反應(yīng)；AtCERK1能夠和AtLYM1和AtLYM3形成共受體復(fù)合物介導(dǎo)PGN引起的免疫反應(yīng)。而在結(jié)瘤因子介導(dǎo)的共生途徑中，NFR1能夠和NFR5形成復(fù)合物共同識(shí)別并介導(dǎo)下游的免疫反應(yīng)［44-46］。因此，共生過(guò)程中根瘤菌其他分子模式的識(shí)別也有可能是通過(guò)共受體復(fù)合物介導(dǎo)的。

由于根瘤菌中的很多分子模式與病原菌分子模式結(jié)構(gòu)非常相似，并且在已鑒定的與免疫相關(guān)的苜蓿突變體nad1中很多受體類蛋白表達(dá)上調(diào)，但是哪些分子模式被這些受體類蛋白識(shí)別激發(fā)免疫反應(yīng)影響共生過(guò)程仍然未知［17-18］。在根瘤菌和植物互相識(shí)別的過(guò)程中，植物是如何區(qū)分匹配的根瘤菌以及不匹配的根瘤菌和病原菌，根瘤菌又是如何利用和調(diào)整自身的分子模式以幫助自己與植物的互作過(guò)程，這些還存在很多未知。在未來(lái)，我們或許可以通過(guò)各種技術(shù)綜合鑒定出這些在共生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用的分子模式以及其相應(yīng)的受體蛋白，為人們更好的利用這個(gè)識(shí)別模式奠定基礎(chǔ)。

2 根瘤菌釋放的效應(yīng)蛋白觸發(fā)的免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)

植物類受體激酶和類受體蛋白識(shí)別病原菌的MAMP后觸發(fā)免疫反應(yīng)，試圖殺死病原菌。病原菌則釋放效應(yīng)蛋白進(jìn)入植物體內(nèi)，通常靶定植物PTI反應(yīng)中的各個(gè)組分阻止免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，以便讓自己順利侵入。而植物也進(jìn)化出識(shí)別效應(yīng)蛋白的R（Resistance）蛋白。R蛋白能夠特異識(shí)別病原菌釋放的效應(yīng)蛋白，從而激活免疫反應(yīng)（Effctor-triggered Immunity，ETI）［47］。

Flor［48］提出 gene-for-gene 假說(shuō)，即高度特異的R蛋白和效應(yīng)蛋白一對(duì)一地直接結(jié)合。如水稻的Pita R蛋白能夠直接結(jié)合水稻稻瘟病菌Magnaporthe grisea的 AvrPita蛋白［49］。Guard model 則證明了 R蛋白也能夠被間接地激活。即R蛋白不檢測(cè)效應(yīng)蛋白的直接行為，而是識(shí)別R蛋白復(fù)合物中宿主蛋白的異常［50］。如效應(yīng)蛋白AvrRPM1誘導(dǎo)RIN4（RPM1-INTERACTING PROTEIN 4）的磷酸化，RIN4能夠與RPM1互作，RPM1感知到RIN4的變化后激起免疫反應(yīng)［51］。有時(shí)R蛋白保護(hù)的宿主蛋白是植物為病原菌設(shè)置的“誘餌”，即植物進(jìn)化出與效應(yīng)蛋白靶標(biāo)結(jié)構(gòu)類似的蛋白。丁香假單胞桿菌的效應(yīng)蛋白AvrPphB能夠靶標(biāo)和分裂PBS1（AVRPPHB SUSCEPTIBLE 1），激活 R 蛋白 RPS5［52-53］。

在豆科植物與根瘤菌的互作中，宿主植物需要對(duì)根瘤數(shù)目和發(fā)育、根瘤菌定殖、根瘤菌固氮效率以及與根瘤菌之間的營(yíng)養(yǎng)交換等進(jìn)行精細(xì)的調(diào)控。而根瘤菌作為外來(lái)入侵的細(xì)菌，可以向植物細(xì)胞內(nèi)分泌效應(yīng)蛋白來(lái)調(diào)控與植物的共生互作。在宿主應(yīng)對(duì)病原微生物的反應(yīng)中，病原菌通過(guò)III型分泌系統(tǒng)分泌的效應(yīng)蛋白主要是抑制宿主的免疫反應(yīng)。除少部分根瘤菌（如苜蓿根瘤菌）外，大部分根瘤菌基因組中都含有編碼III型分泌系統(tǒng)的各個(gè)基因［54］。然而，根瘤菌III型效應(yīng)蛋白是否也參與調(diào)控共生互作中的免疫反應(yīng)大都未知。目前被研究的幾個(gè)III型效應(yīng)蛋白在共生中主要起正調(diào)控作用，然而也有實(shí)驗(yàn)證明根瘤菌III型效應(yīng)蛋白在共生互作中起負(fù)調(diào)控作用。如在植物病原菌Ralstonia中轉(zhuǎn)入根瘤菌的共生質(zhì)粒，賦予它形成無(wú)效瘤的能力。在經(jīng)過(guò)幾輪的重復(fù)競(jìng)爭(zhēng)性接種后，根瘤菌能夠通過(guò)自發(fā)地抑制三型分泌系統(tǒng)從而獲得形成更多共生根瘤的能力［55］。

那么目前被鑒定功能的效應(yīng)蛋白主要也是來(lái)自根瘤菌III型分泌系統(tǒng)，但是大部分在共生中具有正調(diào)控作用，這可能與根瘤菌在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中作出的改變有關(guān)。根瘤菌分泌的蛋白被命名為NOPs（Nodulation outer proteins）［56］。 根 瘤 菌 NGR234 中NopM是IpaH效應(yīng)蛋白家族的成員。NopM是E3泛素連接酶，在煙草中能夠抑制MAMP觸發(fā)的ROS的產(chǎn)生。NopM也能抑制MAPK途徑。在NGR234與Lablab purpureus的共生中，NopM能夠增加根瘤的數(shù)量［57］。NopL作為一個(gè)具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的根瘤菌特異的效應(yīng)蛋白，能夠抑制百脈根中PR基因的表達(dá)。在NGR234與Flemingia congesta的共生中增加結(jié)瘤數(shù)量，在NGR234與菜豆的共生中延遲根瘤衰老［58-60］。NopP 是根瘤菌特異的效應(yīng)蛋白，在NGR234與Tephrosia vogelii和Flemingia congesta的共生中增加結(jié)瘤數(shù)量［61］。NopT是C58半胱氨酸蛋白酶，在NGR234與灰毛豆共生中有正向調(diào)控的作用［62-63］。NopC是HH103的一個(gè)效應(yīng)蛋白，在HH103與大豆的互作中有正向調(diào)控的作用［64］。

通過(guò)上述的描述，可以看出根瘤菌分泌的效應(yīng)蛋白很多在根瘤菌與豆科植物的共生中起正向調(diào)控作用，但也有部分效應(yīng)蛋白在根瘤菌與不同的豆科植物的互作中具有不同的作用［65］。根瘤菌的三型分泌系統(tǒng)能夠分泌出很多效應(yīng)蛋白，但是負(fù)向調(diào)控共生的效應(yīng)蛋白還有很多未被鑒定。由于病原菌的效應(yīng)蛋白可以靶標(biāo)到免疫反應(yīng)過(guò)程中的各個(gè)組分，因此根瘤菌效應(yīng)蛋白靶標(biāo)的研究能夠?yàn)槿藗兞私夤采返拿庖哒{(diào)控奠定基礎(chǔ)。

3 根瘤菌定殖過(guò)程中免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)

根瘤主要有兩種形態(tài)，如大豆、百脈根等產(chǎn)生的定型根瘤和苜蓿等產(chǎn)生的不定型根瘤［15］（圖1）。二者其中一個(gè)區(qū)別在于根瘤原基起始的根部的皮層細(xì)胞不同。不定型根瘤的細(xì)胞分區(qū)發(fā)生于內(nèi)皮層細(xì)胞和中柱鞘，定型根瘤的細(xì)胞通常發(fā)生于中皮層或者外皮層細(xì)胞［66-67］。不定型根瘤的形態(tài)通常是圓柱狀或者分叉狀，并且根瘤細(xì)胞根據(jù)根瘤菌侵染狀態(tài)不同可大致分為4個(gè)區(qū)域：I區(qū)為根瘤頂端的分生組織；II區(qū)為從侵染線釋放根瘤菌侵染植物細(xì)胞的侵染區(qū)；II-III區(qū)為過(guò)渡區(qū)；III區(qū)為類菌體固氮的區(qū)域；IV區(qū)的類菌體正在衰老，為衰老區(qū)。相比較而言，定型根瘤沒(méi)有一個(gè)持續(xù)的分生組織，形態(tài)趨近于球形，沒(méi)有類似不定型根瘤的分區(qū)［68-69］。

定形根瘤與不定型根瘤除了根瘤形態(tài)不同（不定型根瘤具有根瘤分區(qū)）外，最大的區(qū)別是大部分不定型根瘤中的根瘤菌會(huì)經(jīng)歷末端分化：細(xì)胞膨大，基因組加倍，膜的修飾以及繁殖能力的喪失等［70］。目前認(rèn)為是根瘤中一類特異表達(dá)的抗菌肽（NCRs，Nodule-specific cysteine rich peptides）所控制的［71］。苜蓿根瘤類菌體形態(tài)的苜蓿中華根瘤菌需要BacA降低植物NCR肽誘導(dǎo)的膜透化作用和NCR肽的殺菌能力，而體外NCR肽誘導(dǎo)根瘤菌使其具有類菌體特性則不依賴于BacA蛋白［72］。這表明豆科植物在和根瘤菌的博弈過(guò)程中使用了免疫這一武器而且雙方都對(duì)這一免疫反應(yīng)進(jìn)行了調(diào)節(jié)。

圖1 苜蓿產(chǎn)生的不定型根瘤（A）和百脈根產(chǎn)生的定型根瘤（B）

但是由于在根瘤中存在免疫反應(yīng)抑制的機(jī)制，我們無(wú)法直接檢測(cè)到是否有類似PTI或者其他免疫反應(yīng)在根瘤發(fā)育中有重要的功能。NAD1，SymCRK（Symbiotic Cysteine-rich Receptor Kinase），DNF2以及RSD（Regulator of symbiosome differentiation）等基因和突變體的鑒定為研究根瘤中的免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)提供了材料［17-19，73-74］。Yu 等［75］利用nad1突變體揭示了在根瘤發(fā)育過(guò)程中NADPH氧化酶RbohBCD以及CDPK5（Calcium-Dependent Protein Kinase5）蛋白的重要功能。在nad1突變體中敲除RBOHB，C，D以及CDPK5后能夠使突變體根瘤回復(fù)成具有正常功能的根瘤。而在野生型中過(guò)表達(dá)CDPK5-VK會(huì)使根瘤產(chǎn)生壞死。由此可以看出，CDPK-Rboh復(fù)合物產(chǎn)生的活性氧能夠破壞根瘤發(fā)育過(guò)程中的免疫和共生平衡。在nad1或者symcrk突變體中受體類激酶蛋白上調(diào)，而CDPK和Rboh引發(fā)的活性氧爆發(fā)是PTI反應(yīng)中一個(gè)典型的胞內(nèi)反應(yīng)。因此這似乎給予我們PTI反應(yīng)參與了根瘤發(fā)育過(guò)程的信號(hào)。當(dāng)NAD1、DNF2、SymCRK和RSD等抑制根瘤發(fā)育不同階段免疫反應(yīng)的任一個(gè)基因缺失后，根瘤便會(huì)表現(xiàn)出過(guò)度的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致根瘤菌定殖和類菌體發(fā)育受阻，根瘤壞死［76］。

4 總結(jié)與展望

病原菌與植物的“斗智斗勇”主要表現(xiàn)在兩個(gè)層次：MAMP觸發(fā)的MTI反應(yīng)和效應(yīng)蛋白觸發(fā)的ETI反應(yīng)（圖2）。根瘤菌與豆科植物的互惠互利的共生模式與病原菌與植物的互作方式類似但也存在差異。在共生互作中，豆科植物供給根瘤菌碳源使其繁殖生長(zhǎng)，而根瘤菌則提供給植物氮源。但豆科植物會(huì)在滿足自己氮源需求的基礎(chǔ)上盡量限制根瘤菌獲取的能源，而根瘤菌則盡可能獲取更多能源和避免氮?dú)膺€原中的能量消耗。因此二者之間會(huì)互相“抵制”又互相“包容”。但是根瘤菌與植物互作的研究由于根瘤自身的發(fā)育過(guò)程以及相對(duì)緊湊的根瘤結(jié)構(gòu)而受到一定限制，因此我們可以以病原菌的研究為基礎(chǔ)探究植物根瘤內(nèi)的免疫反應(yīng)調(diào)控。但是由于根瘤內(nèi)存在許多根瘤特異表達(dá)的基因，并且根瘤菌與植物的互作模式與病原菌仍存在很大差異，因此我們需要辯證性地參考植物病原菌的研究。

就MTI而言，根瘤菌作為革蘭氏陰性菌，其分子模式與病原菌有相同之處，但又有其自身的特點(diǎn)，因此植物如何識(shí)別和區(qū)分病原菌以及根瘤菌，并與后者建立互利共生的過(guò)程是目前國(guó)際上的研究熱點(diǎn)。植物如何調(diào)控哪些根毛被侵染，當(dāng)根瘤菌進(jìn)入根毛后，根瘤菌的繁殖速度是否受到抑制，這些過(guò)程是否與免疫反應(yīng)相關(guān)還需進(jìn)一步研究。

而當(dāng)根瘤菌進(jìn)入豆科植物根瘤后，植物與根瘤菌的“博弈”也與病原菌和植物的斗爭(zhēng)有一定的差異。模式植物苜蓿的根瘤為不定型根瘤，其根瘤具有嚴(yán)格的功能分區(qū)，而百脈根的根瘤為定型根瘤。目前鑒定的突變體nad1、symcrk等苜蓿突變體產(chǎn)生壞死的根瘤，而當(dāng)這些基因在百脈根根瘤中缺失后，并未產(chǎn)生明顯表型［77］。這種現(xiàn)象可能與苜蓿根瘤中類菌體的末端分化有關(guān)。這可能也表明在苜蓿等產(chǎn)生不定型根瘤的植物中存在著對(duì)根瘤菌更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控，而這種調(diào)控與植物的免疫反應(yīng)相關(guān)。但是對(duì)于根瘤菌調(diào)控植物免疫反應(yīng)的研究仍較少。因此不定型根瘤和定型根瘤對(duì)于根瘤菌免疫反應(yīng)相關(guān)的調(diào)控具有差異，那么哪些基因參與了這個(gè)調(diào)控過(guò)程以及這個(gè)差異是否直接影響根瘤菌的固氮效率還有待探究。并且當(dāng)結(jié)瘤起始后，能夠抑制免疫反應(yīng)的根瘤菌中的蛋白又是如何被激活，在這些蛋白缺失之后植物是否識(shí)別根瘤菌為病原菌從而啟動(dòng)免疫反應(yīng)仍然未知。

圖2 根瘤發(fā)育過(guò)程中植物對(duì)自身先天免疫反應(yīng)的調(diào)控

至于根瘤菌釋放的效應(yīng)蛋白，多數(shù)似乎在共生過(guò)程中具有促進(jìn)結(jié)瘤固氮的正向調(diào)控作用。令人疑惑的是，病原菌大部分依賴III型分泌系統(tǒng)釋放的效應(yīng)蛋白誘導(dǎo)植物的免疫反應(yīng)，而在根瘤菌中，III型分泌系統(tǒng)只在部分根瘤菌中存在，而苜蓿中華根瘤菌中沒(méi)有III型分泌系統(tǒng)，只有IV型分泌系統(tǒng)。那么通過(guò)IV型分泌系統(tǒng)釋放的效應(yīng)蛋白在共生中的功能是怎樣的？并且這些效應(yīng)蛋白在植物中的靶標(biāo)以及工作方式如何仍是我們的盲區(qū)。因此，在根瘤發(fā)育過(guò)程中各種精細(xì)而又嚴(yán)密的調(diào)控仍然需要科學(xué)家們的研究闡釋。