基因水平轉(zhuǎn)移在根瘤菌進(jìn)化中的研究進(jìn)展

陳雪蓮 江高飛 鐘增濤

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

根瘤菌是一類革蘭氏陰性土壤細(xì)菌，能夠與大多數(shù)豆科植物共生固氮。根瘤菌與植物共生形成根瘤或莖瘤，在根瘤內(nèi)分化成類菌體后能夠?qū)⒖諝庵械牡獨(dú)馔ㄟ^(guò)生物固氮作用轉(zhuǎn)化為銨。植物進(jìn)一步將銨轉(zhuǎn)化為氨基酸等氮源物質(zhì)，滿足其生長(zhǎng)繁殖需要［1］。豆科植物是植物界最大的一個(gè)科，約有650屬19 700種，大多數(shù)豆科植物可以與根瘤菌建立共生固氮體系［2］。由于根瘤菌的宿主專一性較強(qiáng)，如何擴(kuò)大根瘤菌在豆科植株上共生固氮的宿主范圍，最終實(shí)現(xiàn)在非豆科植物上的共生固氮是根瘤菌研究的最終目標(biāo)［3］，也是生物固氮研究的目的之一。

1 基因水平轉(zhuǎn)移（HGT）

原核生物具有從環(huán)境或其他生物體基因組獲取部分DNA的獨(dú)特能力，并在稱為基因水平轉(zhuǎn)移（Horizontal gene transfer，HGT）的過(guò)程中將其整合到自身基因組中［4］?；蛩睫D(zhuǎn)移是相對(duì)垂直進(jìn)化（通過(guò)親代傳給子代）而言的，可以讓細(xì)菌快速獲得新的遺傳性狀從而促進(jìn)細(xì)菌的進(jìn)化?；蛩睫D(zhuǎn)移在微生物進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，它打破了遺傳依賴親緣關(guān)系的界限，使遺傳物質(zhì)能夠在不同的物種之間進(jìn)行交換，原核生物通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移的方式可提高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，并具備遺傳的多樣性［5-6］。通過(guò)這種方式，微生物可以獲得新的基因型和表型，例如毒力、抗生素抗性、代謝和共生等［6］?；蛩睫D(zhuǎn)移的主要類型分別是：（1）轉(zhuǎn)化：從環(huán)境中吸收外源DNA的能力；（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過(guò)噬菌體介導(dǎo)將DNA從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞；（3）接合：通過(guò)質(zhì)?；蛘呓雍限D(zhuǎn)移元件將DNA從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞進(jìn)行接觸型轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合都是由遺傳元件介導(dǎo)的，但是轉(zhuǎn)導(dǎo)不需要細(xì)菌間的接觸。細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間的可移動(dòng)遺傳原件（Mobile genetic element，MGE）主要有：轉(zhuǎn)座子類原件、噬菌體/病毒、接合型質(zhì)粒和整合與接合原件（Integrative and Conjugative Elements，ICEs）。ICEs含有編碼接合相關(guān)的基因以及復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)以調(diào)控其從染色體上切離和接合轉(zhuǎn)移［3］，它們能整合在染色體上并隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制。在特定條件誘導(dǎo)下，ICEs從染色體上切離并環(huán)化，復(fù)制后通過(guò)接合的方式轉(zhuǎn)移到新的宿主細(xì)胞中，供受體細(xì)胞中環(huán)化的ICEs均可再次整合到染色體上。與溫和噬菌體類似，ICE通常整合在宿主染色體內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)特定位點(diǎn)（通常是氨酰tRNA），通過(guò)復(fù)制和解離使ICE向其它細(xì)胞轉(zhuǎn)移［7］。切離的ICE通常呈環(huán)狀，通過(guò)接合的方式向受體細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移［8］。ICEs不同于質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移，它不能以染色體外的狀態(tài)獨(dú)立存在，且不能獨(dú)立復(fù)制［9］，因此重新整合到宿主染色體對(duì)于其遺傳穩(wěn)定性至關(guān)重要。相對(duì)于質(zhì)粒介導(dǎo)的基因水平轉(zhuǎn)移，ICEs因?yàn)槟苷系饺旧w上，因此遺傳穩(wěn)定性更高，能更好地促進(jìn)受體細(xì)胞基因組的遺傳進(jìn)化；同時(shí)其所含基因簇在功能上具有較強(qiáng)的一致性且種類多樣，因此具有更加豐富的遺傳多樣性。

2 根瘤菌中的基因水平轉(zhuǎn)移方式

根瘤菌的共生固氮相關(guān)基因是以基因簇的形式存在的，主要存在于共生質(zhì)?；蛘呤侨旧w的共生島上。在根瘤菌屬（Rhizobium）和中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）中主要是以共生質(zhì)粒的形式存在；在大豆根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和固氮根瘤菌屬（Azorhizobium）中主要以共生島的形式存在；在中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）中，這兩種形式都存在。無(wú)論是共生島還是共生質(zhì)粒均能發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。

2.1 共生質(zhì)粒

根瘤菌屬和中華根瘤菌屬的根瘤菌中參與共生固氮的結(jié)瘤基因和固氮基因，位于可轉(zhuǎn)移的共生大質(zhì)粒上（pSym），如苜蓿中華根瘤菌Sinorhizbium meliloti1021的共生質(zhì)粒pSymA等，質(zhì)粒丟失會(huì)導(dǎo)致根瘤菌失去共生能力［10］。菜豆根瘤菌Rhizobium etliCFN42菌株含有6個(gè)質(zhì)粒（p42a-p42f），其大小范圍為185-643 kb。其中質(zhì)粒p42d攜帶結(jié)瘤和固氮所需的大部分信息，而p42a對(duì)于pSym的接合轉(zhuǎn)移是必不可少的［11］。當(dāng)菜豆根瘤菌Rhizobium etliCFN42生長(zhǎng)到高細(xì)胞濃度時(shí)，細(xì)菌可以激活p42a 的接合轉(zhuǎn)移，該過(guò)程依賴于群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控。p42a上的TraI在高細(xì)胞濃度時(shí)產(chǎn)生的3-oxo-C8-HSL能夠與TraR結(jié)合，使其形成二聚體激活traI的表達(dá)，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大的作用，從而促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)并促進(jìn)pSym向土壤細(xì)菌中轉(zhuǎn)移［12］。

2.2 共生島

基因島于1990年被Hacker等［13］在Escherichia coli536和E. coliJ96中首次發(fā)現(xiàn)，是在基因組上存在著的一段可轉(zhuǎn)移的DNA片段，并將這段兩端含重復(fù)序列的DNA片段稱為毒力DNA島?；驆u一般整合在基因組特定的氨酰tRNA位點(diǎn)，長(zhǎng)度為10-600 kb，該區(qū)域的GC含量較低，基因島上含有整合酶、轉(zhuǎn)座酶?；驆u又根據(jù)其攜帶的功能基因的不同，分為環(huán)境適應(yīng)性島、抗性島［14］、代謝島、毒力島［15］、耐藥性島和共生島等。

共生島首次被鑒定是在百脈根根瘤菌（Mesorhizobium lotiICMP3153）中，大小為500 kb的基因島，其整合在Phe-tRNA基因的3'末端，內(nèi)部含有P4整合酶［16］，還含有共生固氮相關(guān)的nod、nif基因簇［17］。大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicumUSDA110）全基因組測(cè)序結(jié)果確定了該菌株含有一個(gè)長(zhǎng)度為681 kb的共生島。在其基因組中鑒定了167個(gè)轉(zhuǎn)座酶，其中有100個(gè)位于共生島上［18］。M. lotiMAFF303099的共生島上包含580個(gè)基因，其中111個(gè)與轉(zhuǎn)座功能相關(guān)［19］。M. loti的共生島ICEMISymR7N是一個(gè)502 kb的整合和結(jié)合元件（ICE），它可向土壤中的非共生百脈根根瘤菌轉(zhuǎn)移并賦予它們與百脈根（Lotus corniculatusLinn.）共生固氮的能力［20］。有趣的是，該共生島的轉(zhuǎn)移頻率受細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞濃度高的時(shí)候，百脈根根瘤菌的TraR被激活，然后激活自體誘導(dǎo)物合成酶基因traI的表達(dá)，使得traI2基因下游的msi172和171發(fā)生共轉(zhuǎn)錄，通過(guò)編程式核糖體移碼閱讀可分別翻譯出Msi172和Msi172-171（FseA），從而激活T4SS（Ⅳ分泌系統(tǒng)），促進(jìn)共生島的接合轉(zhuǎn)移。當(dāng)?shù)图?xì)胞密度時(shí)，traI2被抑制，因此FseA的表達(dá)被抑制，共生島的接合轉(zhuǎn)移也被抑制［21］。

Azorhizobium caulinodans中含有一個(gè)87.6 kb的共生島（ICEAC），它能夠向不同屬的根瘤菌中轉(zhuǎn)移，一般整合到受體根瘤菌的Gly-tRNA位點(diǎn)［22］。不同于百脈根根瘤菌的共生島只能在種內(nèi)水平上發(fā)生轉(zhuǎn)移，田菁根瘤菌（A. caulinodansORS571）的共生島能分別轉(zhuǎn)移到中慢生華癸根瘤菌（Mesorhizobium huakuii7653R，93）、 百 脈 根 根 瘤 菌（M.lotiNZP2213）、天山根瘤菌（Mesorhizobium. tianshanenseCCBAU3306）及草木樨根瘤菌（Sinorhizobium medicaeUSDA1037）中；受體根瘤菌獲得共生島后，也獲得了在毛萼田菁上結(jié)根瘤和莖瘤的能力［22］。因?yàn)樘镙几鼍鷽](méi)有AHLs類群體感應(yīng)系統(tǒng)，所以該共生島的水平轉(zhuǎn)移不受細(xì)胞密度影響，主要受共生島上整合酶和接合轉(zhuǎn)移相關(guān)的酶影響（圖1）。

圖1 A. caulinodans共生島的基因結(jié)構(gòu)［22］

3 根瘤菌的進(jìn)化

目前根瘤菌的分類主要通過(guò)分子生物學(xué)的方法，包括基因組的GC含量以及16S rRNA測(cè)序。目前已經(jīng)命名的根瘤菌主要分布在α變形菌綱和β變形菌綱的18個(gè)屬238個(gè)種［23］；如α變形菌綱中的根瘤菌屬（Rhizobium）、伴根瘤菌屬（Pararhizobium）、新根瘤菌屬（Neorhizobium）、劍菌屬（Ensifer）——包含原來(lái)的中華根瘤菌屬，中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、固氮根瘤菌屬（Azorhizobium）及慢 生 根瘤菌 屬（Bradyrhizobium） 等［24］；β變形菌綱中的伯克氏菌屬（Burkholderia）和貪銅菌屬（Cupriavidus）［25］等；但在γ變形菌綱中，目前只發(fā)現(xiàn)一種根瘤菌，屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）。隨著研究的深入，根瘤菌的所屬范圍也在逐步擴(kuò)大。

與許多在特定生態(tài)位定殖的細(xì)菌不同，根瘤菌在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的分布是分散的。這種分散性不僅體現(xiàn)在綱、目等較高的分類水平上，甚至同一個(gè)屬或種水平上也可以包含根瘤菌和非根瘤菌。通過(guò)比較分析α和β變形桿菌綱不同根瘤菌的基因組，除了部分nod/nif基因相對(duì)保守外，其它共有的基因數(shù)目不足根瘤菌平均編碼基因數(shù)目的10%，低于系統(tǒng)進(jìn)化中相似物種核心基因數(shù)占比15%的平均值［3］。

在根瘤菌的進(jìn)化研究中，多以關(guān)鍵的結(jié)瘤基因簇（nod）和固氮基因（nif）作為研究對(duì)象［26］，它們大多存在于共生質(zhì)?；蚬采鷯u上，可以向其它細(xì)菌發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。在龍舌蘭的根際，分離到多種不能結(jié)瘤的根瘤菌屬（Rhizobium）菌株，它們不含nod基因但是含有nif基因［27］。固氮的起源遠(yuǎn)早于結(jié)瘤，nif基因的分布也更加廣泛［28］，因此根瘤菌很有可能是這些非共生原始菌株通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移獲得結(jié)瘤基因進(jìn)化而來(lái)［29］。根瘤菌的多點(diǎn)起源假說(shuō)表明不同分類地位的非根瘤菌可以多次、獨(dú)立地通過(guò)獲得共生基因逐步進(jìn)化為根瘤菌［30］。

3.1 由根瘤菌向非共生根瘤菌轉(zhuǎn)移

目前關(guān)于根瘤菌進(jìn)化的研究多采用比較基因組學(xué)和適應(yīng)性進(jìn)化的方法。有研究表明，在自然條件下百脈根根瘤菌的共生元件可以向其它非共生根瘤菌中轉(zhuǎn)移，并使其獲得在百脈根上的結(jié)瘤能力［20］。當(dāng)不同屬的根瘤菌獲得田菁根瘤菌的共生島后，也同時(shí)獲得了新的能夠在田菁上共生固氮的能力［22］。M.lotiR7A的共生島長(zhǎng)502 kb，可向同屬非共生的3個(gè)種轉(zhuǎn)移，并且使它們能夠在百脈根上結(jié)瘤［16］。

3.2 由根瘤菌向非根瘤菌轉(zhuǎn)移

從中國(guó)臺(tái)灣相思豆的根瘤中分離出一種根瘤菌D5，其與假單胞菌16S rRNA同源性為99%，其nodA基因與9種慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）具有95%同源性［31］，可能是假單胞菌獲得根瘤菌的共生島后進(jìn)化而來(lái)［32］。在野豌豆的根瘤中也分離到了一株克雷伯氏菌屬（Klebsiella）的菌株，它能夠成功侵染野豌豆并形成具有固氮能力的根瘤［33］。比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，根瘤菌Cupriavidus taiwanensisLMG19424和腐生菌Cupriavidus eutrophusH16的基因組具有高度的相似性［3］。Marchetti等［34］通過(guò)將C.taiwanensisLMG19424的0.55 Mb共生質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到與其遺傳背景相似的青枯菌Ralstonia solanacearumGMI1000中，最終篩選到3個(gè)能夠在含羞草上結(jié)瘤的青枯菌菌株。通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化的方法篩選出2個(gè)對(duì)于該菌株從致病型向共生型的轉(zhuǎn)變至關(guān)重要的突變株。其中hrcV基因的突變，能夠提高突變株的結(jié)瘤和早期侵染能力，而毒力蛋白因子hrpG的失活則允許該菌株發(fā)生細(xì)胞內(nèi)侵染。雖然在實(shí)驗(yàn)室條件下菌株獲得了一定的共生性狀，但還沒(méi)有共生固氮表型，因此不能算作真正意義上的根瘤菌［35］。

4 影響根瘤菌基因水平轉(zhuǎn)移的方式

基因水平轉(zhuǎn)移有一定的排它性，親緣關(guān)系越近，這種排他性也就相對(duì)較小，基因的交流也就越容易。有研究表明發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移的供受體在基因組GC含量上非常相似，大部分差異都小于5%，表明供受體細(xì)胞間基因組GC含量的差異對(duì)基因轉(zhuǎn)移產(chǎn)生阻礙［36］。此外，供受體基因組的相似性與基因水平轉(zhuǎn)移頻率呈正相關(guān)［36］，這表明基因水平轉(zhuǎn)移在親緣關(guān)系更近的物種中發(fā)生的頻率更高。轉(zhuǎn)導(dǎo)被認(rèn)為是距離最長(zhǎng)的基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制，因?yàn)樗枰删w介導(dǎo)［37］。Tao等［3］在各種遺傳體系（包括微生物染色體、質(zhì)粒和噬菌體基因組）中重建了共有蛋白家族網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn)在自然界中接合比轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生的頻率更高。

異源結(jié)瘤基因之間相互抑制可能是根瘤菌基因水平轉(zhuǎn)移的障礙之一。敲除M. huakuii93接合子中ORS571共生島上的nodD基因后并不影響其在毛萼田菁上結(jié)瘤，因?yàn)镸. huakuii93中的nodD可以彌補(bǔ)共生島上的缺失［22］。但是繆禮鴻等［38］研究發(fā)現(xiàn)費(fèi)氏中華根瘤菌（Sinorhizobium fredii）HN01SR接受了豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum bv viciae）1229的共生質(zhì)粒后并不能在豌豆上結(jié)瘤，只有消除了HN01SR自身的共生質(zhì)粒，才能夠在豌豆上結(jié)瘤。張學(xué)賢等［39］研究也發(fā)現(xiàn)紫云英根瘤菌得到了豌豆根瘤菌共生質(zhì)粒之后，只有消除本身的共生質(zhì)粒的才能夠在豌豆上結(jié)瘤?？梢?jiàn)，不同遺傳體系下，不同結(jié)瘤基因間的相容性對(duì)根瘤菌宿主范圍的擴(kuò)大至關(guān)重要。

在根瘤菌-豆科植物共生中，類黃酮類化合物通過(guò)吸引細(xì)菌并誘導(dǎo)NodD的活性從而激活結(jié)瘤因子合成基因的表達(dá)發(fā)揮重要的作用［40-41］。研究表明田菁根瘤菌ORS571在感知到類黃酮類信號(hào)分子柚皮素后，LuxRI家族蛋白AhaR與柚皮素結(jié)合后形成二聚體，可以特異性結(jié)合到整合酶intC的啟動(dòng)子，進(jìn)而激活intC表達(dá)，誘導(dǎo)田菁根瘤菌共生島ICEAC水平轉(zhuǎn)移［22］。因此，柚皮素可以提高田菁根瘤菌10-20倍的共生島轉(zhuǎn)移頻率。ICEMlSymR7A切除和轉(zhuǎn)移受LuxRI家族自誘導(dǎo)/群體感應(yīng)（QS）系統(tǒng)的正調(diào)節(jié)［42］。在獲得外源共生固氮遺傳物質(zhì)后，細(xì)菌是否能進(jìn)化成為根瘤菌還需要經(jīng)過(guò)宿主體內(nèi)長(zhǎng)期的選擇壓力篩選（圖2）。將田菁根瘤菌ORS571的共生島轉(zhuǎn)移到土壤自生固氮菌中，在侵染田菁的初期并不能形成根瘤或莖瘤，通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化的方法，經(jīng)過(guò)三輪生態(tài)循環(huán)篩選，獲得了可以結(jié)瘤并具有一定固氮酶活性的突變菌株（未發(fā)表數(shù)據(jù)），該結(jié)果說(shuō)明土壤細(xì)菌獲得共生固氮基因后還需要與宿主植物長(zhǎng)期進(jìn)化才能成為根瘤菌。

5 建立共生體系時(shí)可能存在的問(wèn)題

根瘤菌大多數(shù)時(shí)候在土壤中以腐生的方式存在，只有當(dāng)遇到合適的宿主植物后，才會(huì)進(jìn)入共生狀態(tài)，形成根瘤以完成增殖并最終釋放到土壤中。在自然或?qū)嶒?yàn)室條件下獲得共生基因的菌株進(jìn)入到土壤環(huán)境后，會(huì)面臨各種壓力。一方面是與土壤中其它微生物的生存競(jìng)爭(zhēng)；另一方面，菌株需要適應(yīng)滲透壓、營(yíng)養(yǎng)、水、pH和溫度等環(huán)境因素的變化［43］。許多實(shí)驗(yàn)室條件下構(gòu)建的菌株雖然能夠侵染和誘導(dǎo)相應(yīng)豆科植物形成瘤狀突起，但不能發(fā)揮共生固氮作用［3］。對(duì)于這種只消耗宿主植物營(yíng)養(yǎng)而不提供氮源的菌株，植物會(huì)通過(guò)宿主制裁、免疫系統(tǒng)抑制、養(yǎng)分控制等方式來(lái)抑制其繁殖［44］。面對(duì)來(lái)自植物和土壤環(huán)境的脅迫，細(xì)菌會(huì)通過(guò)提高自身突變率等方式進(jìn)行應(yīng)對(duì)。在大多數(shù)根瘤菌的基因組或共生質(zhì)粒上都含有imuABC基因簇，可以合成易錯(cuò)DNA聚合酶，imuABC的表達(dá)能夠使細(xì)菌發(fā)生高頻突變［45］。有研究表明當(dāng)共生基因與編碼應(yīng)激反應(yīng)的DNA聚合酶基因共同轉(zhuǎn)移時(shí)，可以提高受體基因組的突變率從而加速土壤細(xì)菌進(jìn)化為根瘤菌的進(jìn)程［45］。通過(guò)腐生-共生的轉(zhuǎn)換過(guò)程可以確保對(duì)植物宿主有益的突變株能夠得到保留并逐步進(jìn)化［24］。

圖2 土壤細(xì)菌通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移獲得共生島后所面臨的選擇壓力［24］

6 展望

根瘤菌作為一類能夠與大多數(shù)豆科植物進(jìn)行共生固氮的益生細(xì)菌，其宿主專一性問(wèn)題限制了其應(yīng)用范圍，長(zhǎng)期以來(lái)研究人員開(kāi)展了大量的工作，但效果并不明顯。近年來(lái)關(guān)于根瘤菌基因水平轉(zhuǎn)移的研究為解決這一問(wèn)題提供了新思路。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，以根瘤菌的共生質(zhì)粒或共生島為共生固氮元件，通過(guò)優(yōu)化改造這些固氮元件，并向植物根際中其它非共生益生細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)移，從而構(gòu)建出具有新的共生固氮回路的菌株，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)化的手段提高菌株的宿主適應(yīng)性。因?yàn)榻Y(jié)瘤基因簇的同源性較高，不同專一性的根瘤菌間差異不大，可以將不同專一性的結(jié)瘤基因組合成新的結(jié)瘤元件進(jìn)行轉(zhuǎn)移，這樣有可能獲得新的廣宿主根瘤菌菌株。這項(xiàng)工作對(duì)于篩選出環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的新型根瘤菌菌株，擴(kuò)大根瘤菌種質(zhì)資源和宿主范圍，并最終應(yīng)用于非豆科植物共生固氮體系建立具有重要的意義。