根瘤菌鐵轉(zhuǎn)運(yùn)代謝及其調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

焦健 劉克寒 田長富

（農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部土壤微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)根瘤菌研究中心 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院 北京 100193）

鐵是所有生命所必需的元素之一，它是細(xì)胞內(nèi)多種重要蛋白或酶的關(guān)鍵組分或輔因子，在呼吸、光合、生物固氮以及活性氧和活性氮代謝等多種生命活動(dòng)中起重要作用。盡管鐵是地球上豐度僅次于鋁的第二大金屬元素，但在大部分生境中主要以極難溶的Fe3+形式存在，很難被生物直接吸收利用。為了滿足對(duì)鐵元素的需求，細(xì)菌通過進(jìn)化獲得了多種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來攝取環(huán)境中的鐵［1］。例如，除了通過Feo等轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)直接吸收可溶性的Fe2+外，細(xì)菌采取合成分泌鐵載體吸收低可溶性Fe3+的方式更加普遍，一些動(dòng)物致病菌還可以利用宿主來源的血紅素作為自身鐵源。

根瘤菌是一類能夠與豆科植物結(jié)瘤固氮的革蘭氏陰性細(xì)菌的總稱。作為兼性共生菌，根瘤菌的生活周期包括自生和共生兩個(gè)階段。其中，大部分時(shí)期根瘤菌在土壤中營腐生生活，在此期間它們需要同其他土壤微生物就包括鐵在內(nèi)的各類營養(yǎng)展開激烈競(jìng)爭(zhēng)。條件適宜情況下，根瘤菌通過根毛或側(cè)根與主根間的縫隙侵染豆科植物的根部皮層細(xì)胞，形成固氮器官根瘤［2］。在根瘤侵染細(xì)胞中，根瘤菌被來源于植物質(zhì)膜的共生體膜所包被，進(jìn)一步增殖分化形成類菌體（Bacteroid）。類菌體通過消耗植物提供的碳源生成ATP和還原力驅(qū)動(dòng)固氮，并將其反饋給植物供其生長利用。根瘤菌在共生固氮階段對(duì)鐵的需求相比自生階段會(huì)極大提高，這是由于類菌體高效固氮需要表達(dá)大量固氮酶以及在低氧條件下維持呼吸作用的氫化酶、細(xì)胞色素等含鐵蛋白［3］。其中，每分子固氮酶復(fù)合體含34個(gè)鐵原子，而它們占全部可溶蛋白的比例可高達(dá)約30%（總蛋白的11%）［4-5］。與此同時(shí)，根瘤中的植物細(xì)胞需要合成大量豆血紅蛋白來維持類菌體固氮所需低氧環(huán)境，同樣對(duì)鐵有著極大的需求。事實(shí)上，據(jù)報(bào)道土壤中缺乏鐵會(huì)對(duì)根瘤菌和豆科植物的共生產(chǎn)生負(fù)面影響，例如根瘤菌缺鐵會(huì)導(dǎo)致其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力降低，而植物缺鐵抑制結(jié)瘤的起始過程以及根瘤的發(fā)育［6-8］。目前，人們對(duì)根瘤內(nèi)鐵的分配和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制還缺乏清晰的認(rèn)識(shí)。

從分類角度看，目前已知的根瘤菌分布在α-和β-變形菌綱近20個(gè)屬的200多個(gè)種，系統(tǒng)發(fā)育多樣性極高［9］。除了少數(shù)核心共生基因相對(duì)保守外，沒有任何基因是根瘤菌所共有且特有的［10-11］?；蚪M上的巨大差異也導(dǎo)致了根瘤菌在生長、代謝、遺傳調(diào)控及共生結(jié)瘤等方面表現(xiàn)出極大多樣性［10］。近年來，針對(duì)根瘤菌鐵代謝的研究主要集中在豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）、苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）和日本慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）這3個(gè)屬于α-變形菌綱的模式物種。其中，前兩者屬于根瘤菌科（Rhizobiaceae），而后者屬于慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae），它們的祖先大約在5億年前分化［12］，因而它們?cè)阼F轉(zhuǎn)運(yùn)代謝及相關(guān)調(diào)控方面已表現(xiàn)出顯著差異。本文將總結(jié)近年來有關(guān)根瘤菌鐵轉(zhuǎn)運(yùn)代謝及其調(diào)控方面的研究進(jìn)展，分析歸納出可能的工作模型以及未來仍待解決的問題，為后續(xù)研究者提供借鑒。

1 根瘤菌中鐵的存在形式及生理功能

細(xì)胞中的鐵一般僅有少部分以游離鐵離子形式存在，大部分則以配體或輔因子的形式與蛋白結(jié)合，發(fā)揮活性調(diào)節(jié)、電子傳遞等作用。根瘤菌中的含鐵蛋白除了在其他細(xì)菌中普遍存在的鐵氧還原蛋白、細(xì)胞色素、過氧化氫酶、儲(chǔ)鐵蛋白以及多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白外，還有其共生時(shí)特異表達(dá)的固氮酶、氫化酶以及高親氧活性呼吸鏈蛋白組分等（圖1）。在這些含鐵蛋白中，血紅素和鐵硫簇是最常見的兩種鐵的存在形式，其中鐵硫簇又可分為［2Fe2S］和［4Fe4S］等不同類型。在固氮酶復(fù)合體中，除鐵蛋白結(jié)合的［4Fe-4S］簇外，鉬鐵蛋白中的α亞基和β亞基分別與［Mo-7Fe-9S-高檸檬酸］和［8Fe-7S］結(jié)合，后兩種特殊的輔因子均由特定的nif基因負(fù)責(zé)裝配［4，13］。部分根瘤菌編碼的氫化酶（Hydrogenase）可以氧化共生固氮過程中產(chǎn)生的氫氣合成ATP以避免能量的浪費(fèi)，該酶的催化活性依賴于hyp操縱子負(fù)責(zé)合成的［NiFe］輔因子［14-15］。

圖1 根瘤菌中鐵存在的主要形式及參與合成的蛋白

2 根瘤菌吸收鐵的方式

基于實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下的研究表明，根瘤菌可以利用Fe2+、Fe3+和血紅素等不同形式的鐵作為自身鐵源。在自然條件下，根瘤菌很可能依據(jù)其在自生和共生不同階段所處環(huán)境中鐵的存在形式采用不同策略獲得鐵（圖2）。

圖2 假定的根瘤菌鐵吸收機(jī)制模型

2.1 自生條件下根瘤菌吸收鐵的方式

2.1.1 依賴于鐵載體的Fe3+吸收 當(dāng)環(huán)境中缺鐵時(shí)，通過合成和分泌鐵載體再通過依賴于TonB的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)攝取Fe3+-鐵載體復(fù)合物是在細(xì)菌中最常見的鐵吸收策略［16］。鐵載體是一類具有高特異性Fe3+螯合能力的低分子量（約300-1 500 Da）有機(jī)化合物，盡管其分子結(jié)構(gòu)多樣，但所包含金屬結(jié)合基團(tuán)的變化卻比較有限。根據(jù)鐵螯合基團(tuán)的不同，常見的鐵載體主要被劃分為兒茶酚型、異羥肟酸酯型、α-羥基羧酸型以及復(fù)合型幾類，其他類型的金屬離子親和基團(tuán)如惡唑啉、噻唑啉、羥基吡啶和β-羥基酸等也偶有發(fā)現(xiàn)［17］。根據(jù)生物合成過程中非核糖體肽合成酶（Nonribosomal peptide synthetase，NRPS）參與與否，鐵載體又可以分為NRPS依賴型或非NRPS依賴型兩種［18-19］。

迄今為止，已有3種根瘤菌內(nèi)源性鐵載體獲得了結(jié)構(gòu)鑒定（圖 3-A-B）：（1）R. leguminosarumJM251等菌株合成的三羥肟酸型鐵載體vicibactin；（2）S. melilotiDM1菌株合成的α-羥基羧酸鹽型鐵載體rhizobactin；（3）S. meliloti1021菌株合成的含檸檬酸鹽衍生物的二氫肟酸鹽型鐵載體rhizobactin 1021［20-22］。其中，vicibactin的合成依賴于 NRPS，而后兩者不依賴于NRPS。不同種根瘤菌甚至同種根瘤菌的不同菌株所合成鐵載體通常具有較大差異，如R. leguminosarumIARI 102和Rhizobiumsp（cowpea）RA-1并非合成vicibactin，而是合成結(jié)構(gòu)尚不清楚的兒茶酚類鐵載體［23-24］。

從遺傳角度講，不同根瘤菌鐵載體合成方面的差異是相關(guān)基因差異所導(dǎo)致。例如，R.leguminosarum中vicibactin的合成由vbsGSO/vbsADL/vbsC/vbsP四個(gè)操縱子編碼的酶負(fù)責(zé)，S. meliloti中rhizobactin的合成則由rhbABCDEF操縱子負(fù)責(zé)，而rhizobactin 1021 可能還需要rhbG的參與［18，21，25-26］。在根瘤菌中，負(fù)責(zé)鐵載體合成的基因經(jīng)常位于質(zhì)?；蛉旧w的基因島，其種屬分布十分不保守，具有顯著的水平基因轉(zhuǎn)移特征。在S. fredii的某些菌株中，預(yù)測(cè)到的鐵載體合成基因簇與炭疽桿菌中asbABCDEF同源（蛋白序列相似性31%-47%），該基因簇負(fù)責(zé)合成與炭疽桿菌致病性密切相關(guān)的原兒茶酚型鐵載體 petrobactin（圖 3-C）［27］。

包括根瘤菌在內(nèi)的絕大部分革蘭氏陰性細(xì)菌都通過依賴于TonB的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（TonB-dependent transporters，TBDTs）攝取Fe3+-鐵載體復(fù)合物，該系統(tǒng)通常由外膜受體通道蛋白和內(nèi)膜上的TonB/ExbB/ExbD供能系統(tǒng)及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子3部分組成［28-29］。分泌到胞外的鐵載體螯合Fe3+后，可以與外膜受體蛋白以不消耗能量的方式特異性結(jié)合，然后由質(zhì)子動(dòng)力提供能量并通過TonB/ExbB/ExbD復(fù)合物傳遞給外膜受體使其發(fā)生構(gòu)象變化，將Fe3+-鐵載體復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間［29］。隨后，周質(zhì)空間內(nèi)的Fe3+-鐵載體復(fù)合物進(jìn)一步與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子中的底物結(jié)合蛋白結(jié)合，在ATP水解酶驅(qū)動(dòng)下通過內(nèi)膜上透性酶轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)［29］。

圖3 不同根瘤菌合成的幾種鐵載體的分子結(jié)構(gòu)

在許多已測(cè)序的根瘤菌中，除了針對(duì)內(nèi)源鐵載體的外膜受體蛋白編碼基因外，通常還存在額外的外膜受體編碼基因。這可能意味著在根瘤菌中還普遍存在著利用外源鐵載體吸收鐵的機(jī)制，而這很可能對(duì)根瘤菌在土壤中的競(jìng)爭(zhēng)存活是有利的。有意思的是，B. japonicumUSDA110基因組中沒有發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)內(nèi)源性鐵載體合成的基因，但卻編碼至少3個(gè)外膜鐵載體受體蛋白（EntR、FegA、FhuE）以及完整的TonB/ExbB/ExbD供能系統(tǒng)［30］。遺傳證據(jù)表明，該菌株可以利用這3種外膜受體通過TonB依賴的方式分別特異地轉(zhuǎn)運(yùn)desferrioxamine、ferrichrome和enterobactin 等外源鐵載體［30］。

當(dāng)Fe3+-鐵載體復(fù)合物被吸收到細(xì)胞中后，F(xiàn)e3+通常以被還原成Fe2+的形式釋放，這一還原反應(yīng)由鐵還原酶催化完成［29］。目前僅在少數(shù)細(xì)菌中鑒定的鐵還原酶幾乎都是胞質(zhì)可溶的且它們的催化活性依賴于核黃素［31-32］。此外，某些鐵還原酶則以鐵硫簇作為其輔酶，如FhuF［33］。目前，在根瘤菌中唯一研究較為清楚的鐵還原酶是由B. japonicum編碼的FrcB，其編碼基因與編碼鐵載體外膜受體的pyoR同源基因位于同一操縱子內(nèi)［34］。FrcB是定位于內(nèi)膜的二聚體蛋白且其穩(wěn)定性嚴(yán)格依賴于其特定保守組氨酸殘基與血紅素的結(jié)合，這一特征與真核生物中的鐵還原酶一致［35］。在大腸桿菌中的異源表達(dá)以及體外酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)均證實(shí)FrcB具有鐵還原酶活性，且在缺鐵條件下該蛋白以Irr依賴性方式被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)［34］。然而，最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)缺失frcB基因的B. japonicum菌株仍可以利用外源鐵載體吸收鐵供自身生長，這意味著該菌還編碼其他鐵還原酶參與鐵載體依賴的鐵吸收［30］。

2.1.2 血紅素的攝取 通過血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)及降解獲得鐵曾被認(rèn)為是動(dòng)物致病性細(xì)菌所特有的鐵吸收方式。直到1997年，Noya等［36］發(fā)現(xiàn)根瘤菌及其他一些非致病性細(xì)菌同樣具備在缺鐵條件下利用血紅素以及血紅蛋白作為鐵源進(jìn)行生長的能力。隨后，人們?cè)贐.japonicum、R. leguminosarum和S. meliloti幾種模式根瘤菌中相繼鑒定了相對(duì)較為保守的血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因［37-40］。與鐵載體的轉(zhuǎn)運(yùn)十分相似，根瘤菌對(duì)血紅素的轉(zhuǎn)運(yùn)同樣依賴于TonB/ExbB/ExbD供能復(fù)合體以及特異性識(shí)別血紅素的外膜受體蛋白［29，38］。HmuR和ShmR分別是由B. japonicum和S. meliloti編碼的外膜血紅素受體蛋白，它們對(duì)于根瘤菌吸收血紅素是必需的［40-41］。盡管兩者蛋白相似性僅為23%，但它們都含有典型的血紅素受體FRAP/NPNL基序。在R. leguminosarum中，存在與ShmR蛋白序列一致性高達(dá)65%的同源蛋白編碼基因。血紅素在TonB/ExbB/ExbD驅(qū)動(dòng)下經(jīng)外膜受體蛋白進(jìn)入周質(zhì)空間后，會(huì)進(jìn)一步由hmuTUV編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子將其泵入胞質(zhì)中［37-38］。值得注意的是，B. japonicum和S. meliloti中hmuTUV缺失突變并不會(huì)導(dǎo)致血紅素利用能力的完全喪失，推測(cè)它們還編碼其他類型的血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)［38］。進(jìn)入胞質(zhì)中的血紅素既可以被根瘤菌直接利用，也可以通過氧化途徑降解卟啉環(huán)釋放出 Fe2+［42］。

2.1.3 Fe2+的吸收轉(zhuǎn)運(yùn) 雖然鐵一般僅在酸性且厭氧環(huán)境中才以Fe2+形式存在，但由于其相對(duì)于Fe3+高可溶性和可以直接通過外膜進(jìn)入周質(zhì)空間的特點(diǎn)，而被認(rèn)為是細(xì)菌利用鐵的首選形式。因此，大部分細(xì)菌都保留了直接吸收Fe2+的能力。目前，在細(xì)菌中鑒定的Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要是Feo轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，此外還發(fā)現(xiàn)Yfe轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、Efe轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、Sit轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等也具有Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力［43］。

在根瘤菌中，研究較多的Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是由B. japonicumUSDA110菌株中feoAB基因所編碼的Feo系統(tǒng)。同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)eo轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的功能失活不僅會(huì)導(dǎo)致該菌株無法有效吸收Fe2+，而且Fe3+的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)也會(huì)被抑制，但血紅素的吸收不受影響［44］。因此，研究者認(rèn)為該菌株對(duì)Fe3+的吸收是首先在胞外或周質(zhì)空間將Fe3+還原為Fe2+，然后再進(jìn)一步通過Feo系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的方式實(shí)現(xiàn)的。Sinorhizobium和Rhizobium屬的根瘤菌基因組中不含feoAB同源基因，但都編碼另一種在其他細(xì)菌中被證實(shí)可以非特異地轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+的Sit轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)［45-46］。盡管S. meliloti編碼的Sit轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)Mn2+，但同時(shí)也具有一定的Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力，并且調(diào)控該系統(tǒng)表達(dá)的調(diào)控蛋白Mur的活性除了受到Mn2+調(diào)節(jié)外，也部分受到Fe2+的影響［46］。

2.2 類菌體吸收鐵的方式

如前所述，根瘤菌在共生階段分化形成的類菌體需要合成大量固氮酶、氫化酶以及細(xì)胞色素c等與固氮密切相關(guān)的含鐵蛋白，因此鐵是與共生固氮效率密切相關(guān)的因素之一。Slatni 等［47］研究發(fā)現(xiàn)菜豆根瘤中鐵的含量與其固氮效率呈正相關(guān)。在此情況下，類菌體面臨怎樣的鐵營養(yǎng)條件，采用何種策略吸收鐵成為人們所關(guān)注的問題。

根瘤中存在大量豆血紅蛋白，使人們?cè)欢葢岩筛鼍欠裨诠采A段以血紅素作為自身所需的鐵源。然而，考慮到根瘤菌在侵染細(xì)胞內(nèi)被共生體膜所包被，并不與豆血紅蛋白直接接觸，而游離血紅素的濃度通常又非常低，上述猜測(cè)的可能性大大降低。另有大量遺傳學(xué)研究表明，根瘤菌在自生條件下吸收血紅素所用的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)缺失對(duì)共生固氮沒有顯著影響，不是共生所必需的［37-38］。因此，目前普遍認(rèn)為根瘤菌通過吸收血紅素獲得鐵的機(jī)制很可能主要發(fā)生在根瘤衰老階段［3］。

盡管尚缺乏充分的直接證據(jù)，已有的研究表明類菌體很可能主要以吸收Fe2+的方式獲得鐵。一方面，在侵染細(xì)胞中類菌體被共生體膜所包被形成共生小體，共生體膜外偏酸和低氧的植物胞質(zhì)環(huán)境有利于維持鐵離子以Fe2+形式存在。放射性同位素實(shí)驗(yàn)表明，從大豆根瘤中分離純化的共生小體可以吸收 Fe2+和 Fe3+，但吸收 Fe2+速率明顯快于 Fe3+［48-49］。其中，F(xiàn)e2+的轉(zhuǎn)運(yùn)很可能由定位于共生體膜上的NRAMP家族轉(zhuǎn)運(yùn)子GmDMT1實(shí)現(xiàn)，盡管該轉(zhuǎn)運(yùn)子同時(shí)還具備Zn2+、Mn2+等其他二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力［50］。共生體膜與類菌體之間的共生周質(zhì)空間內(nèi)pH相比于植物細(xì)胞質(zhì)更低（可以達(dá)到4.5-5），并且可以檢測(cè)到較強(qiáng)的鐵還原酶活性，更進(jìn)一步確保類菌體胞外微環(huán)境中可以存在較高濃度的Fe2+［49，51］。另一方面，在幾種典型的模式根瘤菌中，僅轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+的Feo系統(tǒng)或Sit系統(tǒng)缺失則導(dǎo)致顯著的共生缺陷［44，46，52］，而負(fù)責(zé)鐵載體或血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)的基因突變則不影響共生表型［26，37-38，40，42，53-55］。以上證據(jù)除了證明類菌體很可能以Fe2+方式吸收鐵之外，還強(qiáng)烈暗示侵染細(xì)胞中很可能處于相對(duì)富鐵的狀態(tài)。支持這一猜想的最新證據(jù)來自于S. fredii，其中鐵響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白R(shí)irA缺失會(huì)導(dǎo)致共生固氮能力降低，而該蛋白已被證實(shí)在高鐵條件下會(huì)抑制TonB依賴的鐵吸收［56］。

3 根瘤菌胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)控

盡管鐵具有極其重要的生物學(xué)功能，但如果細(xì)胞中存在過量的鐵則容易引發(fā)芬頓反應(yīng)生成活性氧類物質(zhì)，進(jìn)而造成毒害作用［57］。因此，細(xì)胞內(nèi)自由鐵離子的濃度必須控制在較低的水平。與其他細(xì)菌相一致，根瘤菌內(nèi)鐵離子穩(wěn)態(tài)通過以下4種途徑實(shí)現(xiàn)：（1）調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)；（2）利用鐵儲(chǔ)藏蛋白將鐵轉(zhuǎn)化為非自由狀態(tài)；（3）依據(jù)環(huán)境中鐵的多寡選擇性表達(dá)依賴或非依賴于鐵的酶類；（4）調(diào)控鐵外排通道蛋白的表達(dá)。在大腸桿菌等模式物種中，鐵代謝相關(guān)基因主要受全局性鐵代謝調(diào)控蛋白Fur調(diào)控［58］。雖然大部分根瘤菌也都編碼Fur同源蛋白，但它們主要負(fù)責(zé)調(diào)控與錳離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因，因而被重新命名為Mur［41，59］。實(shí)際上，根瘤菌中鐵穩(wěn)態(tài)的實(shí)現(xiàn)主要依賴于另外兩種調(diào)控蛋白Irr和RirA所介導(dǎo)的調(diào)控（圖4）［58］。

圖4 R.leguminosarum中Irr和RirA介導(dǎo)的鐵代謝的調(diào)控機(jī)制（改自［58］）

Irr屬于Fur調(diào)控蛋白家族，該蛋白最早被發(fā)現(xiàn)在B. japonicum中調(diào)控血紅素合成途徑［60］，而現(xiàn)已被證實(shí)是廣泛分布于α-變形菌綱根瘤菌和非根瘤菌中響應(yīng)低鐵條件的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［61］?；诨蛐酒霓D(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，B. japonicum中大多數(shù)受外源鐵調(diào)節(jié)的基因在轉(zhuǎn)錄水平上受到Irr調(diào)控［62］。其中，與鐵吸收以及血紅素降解相關(guān)的基因受正調(diào)控，而與鐵的利用、貯藏以及外排相關(guān)的基因如bfr則受負(fù)調(diào)控。然而，在R. leguminosarum和S. meliloti中的研究卻僅發(fā)現(xiàn)Irr作為抑制子發(fā)揮作用，負(fù)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)［61，63］?；隗w外蛋白-DNA互作以及定點(diǎn)突變等分析的結(jié)果表明，B. japonicum中Irr與受其正調(diào)控和負(fù)調(diào)控的基因啟動(dòng)子區(qū)均存在結(jié)合作用，因此Irr可能除了抑制基因表達(dá)外，在某些情況下還扮演激活子角色［62，64-65］。基于序列比對(duì)分析，人們發(fā)現(xiàn)在許多受Irr調(diào)控的基因啟動(dòng)子區(qū)存在被命名為ICE（Iron control element）的保守順式作用元件［37，66］。

非常有趣的是，Irr與 Fur、Zur、Nur、Mur等其他Fur家族成員不同，它并非直接與特定金屬離子結(jié)合進(jìn)而激活自身DNA結(jié)合活性，而是通過與血紅素結(jié)合間接感知細(xì)胞內(nèi)鐵的含量。在B. japonicum中，不結(jié)合血紅素的Irr結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，而當(dāng)其與血紅素結(jié)合時(shí)則被降解［67］。現(xiàn)有研究表明，Irr的降解依賴于其自身所包含的兩個(gè)血紅素結(jié)合域HRM（Heme-regulatory motif）和 HXH（Histidine-x-histidine）結(jié)構(gòu)域［68-69］。由R. leguminosarum編碼的 Irr缺少HRM結(jié)構(gòu)域，而HXH結(jié)構(gòu)域與血紅素結(jié)合只對(duì)其DNA結(jié)合活性有影響，但并不會(huì)導(dǎo)致蛋白的降解［70］。

除了Irr之外，屬于Rhizobiaceae科的細(xì)菌還普遍編碼屬于Rrf2家族的鐵響應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白R(shí)irA［59，71-75］。與 Irr恰巧相反，RirA 在高鐵條件下負(fù)調(diào)控許多與鐵載體合成轉(zhuǎn)運(yùn)以及血紅素吸收相關(guān)的基因［76］。與此相一致，RirA缺失突變體通常表現(xiàn)出在高鐵培養(yǎng)基中生長遲緩的表型，且對(duì)H2O2更加敏感［73，75］?；谵D(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，S. meliloti和R. leguminosarum中受RirA調(diào)控的基因除了參與鐵吸收之外，還涉及硫代謝、能量代謝以及胞外多糖合成等途徑［71，73］。通過生物信息學(xué)方法，Rodionov和Yeoman等在受RirA調(diào)控的基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了保守的IRO調(diào)控元件（Iron-Rhodobox）［59，72］。與其他 Rrf2家族蛋白類似，RirA 蛋白序列中含有可以與鐵硫簇結(jié)合的保守Cys殘基。最新研究表明，雖然RirA可以與［2Fe2S］和［4Fe4S］兩種鐵硫簇都發(fā)生結(jié)合，但僅在與［4Fe4S］結(jié)合時(shí)具備較強(qiáng)的DNA結(jié)合活性［77］。因此，RirA的調(diào)節(jié)活性除了依賴于細(xì)胞內(nèi)鐵的濃度外，還受到硫元素以及氧氣含量的調(diào)節(jié)［77］。

在同時(shí)含Irr和RirA的根瘤菌中，一些下游基因通常同時(shí)受到兩者的協(xié)同調(diào)控，其中包括編碼這兩種調(diào)控蛋白的基因本身，這種嚴(yán)密的協(xié)同調(diào)控可能有利于細(xì)胞對(duì)自身鐵營養(yǎng)狀態(tài)做出快速響應(yīng)［59，63，78］。除此之外，受 RirA 和 Irr調(diào)控的基因還編碼一些菌株特異性的局部鐵代謝調(diào)節(jié)蛋白，如HmuP、RhrA和RpoI等。在S. meliloti中，HmuP的表達(dá)受RirA負(fù)調(diào)控，而其本身對(duì)于shmR的表達(dá)是必需的［79］。然而，在缺少RirA的B. japonicum中，HmuP則通過與Irr協(xié)同作用激活hmuR操縱子的表達(dá)［80］。RhrA是屬于AraC家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在S. meliloti中該蛋白可以激活負(fù)責(zé)rhizobactin 1021合成的rhbABCDEF操縱子［26，81］。在R. leguminosarum中，負(fù)責(zé)合成vicibaction的vbs基因啟動(dòng)子依賴于特殊的σ因子RpoI起始轉(zhuǎn)錄［25］。

4 結(jié)語

鐵在根瘤菌中參與許多重要蛋白的合成，尤其在共生固氮過程中發(fā)揮極其重要的作用?；诖罅孔陨鷹l件下的研究，人們發(fā)現(xiàn)根瘤菌可利用多種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)吸收不同形式的鐵，并通過Irr和RirA等調(diào)節(jié)蛋白介導(dǎo)的精密調(diào)控實(shí)現(xiàn)細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)。然而，共生階段根瘤菌在宿主細(xì)胞內(nèi)通過何種方式獲取鐵以及如何與宿主協(xié)調(diào)實(shí)現(xiàn)鐵營養(yǎng)的平衡至今仍沒有清晰答案。根瘤菌遺傳多樣性以及鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的冗余客觀上為此方面研究造成了困難，進(jìn)一步的研究需針對(duì)特定菌株構(gòu)建遺傳背景更加清晰的突變體展開。相應(yīng)地，鐵在根瘤內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝途徑同時(shí)也需要從宿主植物方面展開。近年來日益發(fā)展成熟的同步輻射X光吸收譜（X-ray absorption fine spectroscopy，XAFS）可以實(shí)現(xiàn)原位金屬離子分布及化學(xué)形態(tài)的檢測(cè)，應(yīng)用此技術(shù)或可在上述方面取得突破性進(jìn)展。鑒于鐵廣泛參與了與共生固氮密切相關(guān)的物質(zhì)、能量以及信號(hào)分子代謝，如何通過改變根瘤菌鐵代謝調(diào)控共生固氮效率也是未來值得研究的方向。