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    根瘤菌鐵轉運代謝及其調控機制研究進展

    2019-10-24 09:11:06焦健劉克寒田長富
    生物技術通報 2019年10期

    焦健 劉克寒 田長富

    (農業(yè)生物技術國家重點實驗室 農業(yè)部土壤微生物重點實驗室 中國農業(yè)大學根瘤菌研究中心 中國農業(yè)大學生物學院 北京 100193)

    鐵是所有生命所必需的元素之一,它是細胞內多種重要蛋白或酶的關鍵組分或輔因子,在呼吸、光合、生物固氮以及活性氧和活性氮代謝等多種生命活動中起重要作用。盡管鐵是地球上豐度僅次于鋁的第二大金屬元素,但在大部分生境中主要以極難溶的Fe3+形式存在,很難被生物直接吸收利用。為了滿足對鐵元素的需求,細菌通過進化獲得了多種轉運系統(tǒng)來攝取環(huán)境中的鐵[1]。例如,除了通過Feo等轉運系統(tǒng)直接吸收可溶性的Fe2+外,細菌采取合成分泌鐵載體吸收低可溶性Fe3+的方式更加普遍,一些動物致病菌還可以利用宿主來源的血紅素作為自身鐵源。

    根瘤菌是一類能夠與豆科植物結瘤固氮的革蘭氏陰性細菌的總稱。作為兼性共生菌,根瘤菌的生活周期包括自生和共生兩個階段。其中,大部分時期根瘤菌在土壤中營腐生生活,在此期間它們需要同其他土壤微生物就包括鐵在內的各類營養(yǎng)展開激烈競爭。條件適宜情況下,根瘤菌通過根毛或側根與主根間的縫隙侵染豆科植物的根部皮層細胞,形成固氮器官根瘤[2]。在根瘤侵染細胞中,根瘤菌被來源于植物質膜的共生體膜所包被,進一步增殖分化形成類菌體(Bacteroid)。類菌體通過消耗植物提供的碳源生成ATP和還原力驅動固氮,并將其反饋給植物供其生長利用。根瘤菌在共生固氮階段對鐵的需求相比自生階段會極大提高,這是由于類菌體高效固氮需要表達大量固氮酶以及在低氧條件下維持呼吸作用的氫化酶、細胞色素等含鐵蛋白[3]。其中,每分子固氮酶復合體含34個鐵原子,而它們占全部可溶蛋白的比例可高達約30%(總蛋白的11%)[4-5]。與此同時,根瘤中的植物細胞需要合成大量豆血紅蛋白來維持類菌體固氮所需低氧環(huán)境,同樣對鐵有著極大的需求。事實上,據報道土壤中缺乏鐵會對根瘤菌和豆科植物的共生產生負面影響,例如根瘤菌缺鐵會導致其競爭結瘤能力降低,而植物缺鐵抑制結瘤的起始過程以及根瘤的發(fā)育[6-8]。目前,人們對根瘤內鐵的分配和轉運機制還缺乏清晰的認識。

    從分類角度看,目前已知的根瘤菌分布在α-和β-變形菌綱近20個屬的200多個種,系統(tǒng)發(fā)育多樣性極高[9]。除了少數核心共生基因相對保守外,沒有任何基因是根瘤菌所共有且特有的[10-11]?;蚪M上的巨大差異也導致了根瘤菌在生長、代謝、遺傳調控及共生結瘤等方面表現出極大多樣性[10]。近年來,針對根瘤菌鐵代謝的研究主要集中在豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)和日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)這3個屬于α-變形菌綱的模式物種。其中,前兩者屬于根瘤菌科(Rhizobiaceae),而后者屬于慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae),它們的祖先大約在5億年前分化[12],因而它們在鐵轉運代謝及相關調控方面已表現出顯著差異。本文將總結近年來有關根瘤菌鐵轉運代謝及其調控方面的研究進展,分析歸納出可能的工作模型以及未來仍待解決的問題,為后續(xù)研究者提供借鑒。

    1 根瘤菌中鐵的存在形式及生理功能

    細胞中的鐵一般僅有少部分以游離鐵離子形式存在,大部分則以配體或輔因子的形式與蛋白結合,發(fā)揮活性調節(jié)、電子傳遞等作用。根瘤菌中的含鐵蛋白除了在其他細菌中普遍存在的鐵氧還原蛋白、細胞色素、過氧化氫酶、儲鐵蛋白以及多種轉錄調控蛋白外,還有其共生時特異表達的固氮酶、氫化酶以及高親氧活性呼吸鏈蛋白組分等(圖1)。在這些含鐵蛋白中,血紅素和鐵硫簇是最常見的兩種鐵的存在形式,其中鐵硫簇又可分為[2Fe2S]和[4Fe4S]等不同類型。在固氮酶復合體中,除鐵蛋白結合的[4Fe-4S]簇外,鉬鐵蛋白中的α亞基和β亞基分別與[Mo-7Fe-9S-高檸檬酸]和[8Fe-7S]結合,后兩種特殊的輔因子均由特定的nif基因負責裝配[4,13]。部分根瘤菌編碼的氫化酶(Hydrogenase)可以氧化共生固氮過程中產生的氫氣合成ATP以避免能量的浪費,該酶的催化活性依賴于hyp操縱子負責合成的[NiFe]輔因子[14-15]。

    圖1 根瘤菌中鐵存在的主要形式及參與合成的蛋白

    2 根瘤菌吸收鐵的方式

    基于實驗室純培養(yǎng)條件下的研究表明,根瘤菌可以利用Fe2+、Fe3+和血紅素等不同形式的鐵作為自身鐵源。在自然條件下,根瘤菌很可能依據其在自生和共生不同階段所處環(huán)境中鐵的存在形式采用不同策略獲得鐵(圖2)。

    圖2 假定的根瘤菌鐵吸收機制模型

    2.1 自生條件下根瘤菌吸收鐵的方式

    2.1.1 依賴于鐵載體的Fe3+吸收 當環(huán)境中缺鐵時,通過合成和分泌鐵載體再通過依賴于TonB的轉運系統(tǒng)攝取Fe3+-鐵載體復合物是在細菌中最常見的鐵吸收策略[16]。鐵載體是一類具有高特異性Fe3+螯合能力的低分子量(約300-1 500 Da)有機化合物,盡管其分子結構多樣,但所包含金屬結合基團的變化卻比較有限。根據鐵螯合基團的不同,常見的鐵載體主要被劃分為兒茶酚型、異羥肟酸酯型、α-羥基羧酸型以及復合型幾類,其他類型的金屬離子親和基團如惡唑啉、噻唑啉、羥基吡啶和β-羥基酸等也偶有發(fā)現[17]。根據生物合成過程中非核糖體肽合成酶(Nonribosomal peptide synthetase,NRPS)參與與否,鐵載體又可以分為NRPS依賴型或非NRPS依賴型兩種[18-19]。

    迄今為止,已有3種根瘤菌內源性鐵載體獲得了結構鑒定(圖 3-A-B):(1)R. leguminosarumJM251等菌株合成的三羥肟酸型鐵載體vicibactin;(2)S. melilotiDM1菌株合成的α-羥基羧酸鹽型鐵載體rhizobactin;(3)S. meliloti1021菌株合成的含檸檬酸鹽衍生物的二氫肟酸鹽型鐵載體rhizobactin 1021[20-22]。其中,vicibactin的合成依賴于 NRPS,而后兩者不依賴于NRPS。不同種根瘤菌甚至同種根瘤菌的不同菌株所合成鐵載體通常具有較大差異,如R. leguminosarumIARI 102和Rhizobiumsp(cowpea)RA-1并非合成vicibactin,而是合成結構尚不清楚的兒茶酚類鐵載體[23-24]。

    從遺傳角度講,不同根瘤菌鐵載體合成方面的差異是相關基因差異所導致。例如,R.leguminosarum中vicibactin的合成由vbsGSO/vbsADL/vbsC/vbsP四個操縱子編碼的酶負責,S. meliloti中rhizobactin的合成則由rhbABCDEF操縱子負責,而rhizobactin 1021 可能還需要rhbG的參與[18,21,25-26]。在根瘤菌中,負責鐵載體合成的基因經常位于質?;蛉旧w的基因島,其種屬分布十分不保守,具有顯著的水平基因轉移特征。在S. fredii的某些菌株中,預測到的鐵載體合成基因簇與炭疽桿菌中asbABCDEF同源(蛋白序列相似性31%-47%),該基因簇負責合成與炭疽桿菌致病性密切相關的原兒茶酚型鐵載體 petrobactin(圖 3-C)[27]。

    包括根瘤菌在內的絕大部分革蘭氏陰性細菌都通過依賴于TonB的轉運系統(tǒng)(TonB-dependent transporters,TBDTs)攝取Fe3+-鐵載體復合物,該系統(tǒng)通常由外膜受體通道蛋白和內膜上的TonB/ExbB/ExbD供能系統(tǒng)及ABC轉運子3部分組成[28-29]。分泌到胞外的鐵載體螯合Fe3+后,可以與外膜受體蛋白以不消耗能量的方式特異性結合,然后由質子動力提供能量并通過TonB/ExbB/ExbD復合物傳遞給外膜受體使其發(fā)生構象變化,將Fe3+-鐵載體復合物轉運到周質空間[29]。隨后,周質空間內的Fe3+-鐵載體復合物進一步與ABC轉運子中的底物結合蛋白結合,在ATP水解酶驅動下通過內膜上透性酶轉運至胞內[29]。

    圖3 不同根瘤菌合成的幾種鐵載體的分子結構

    在許多已測序的根瘤菌中,除了針對內源鐵載體的外膜受體蛋白編碼基因外,通常還存在額外的外膜受體編碼基因。這可能意味著在根瘤菌中還普遍存在著利用外源鐵載體吸收鐵的機制,而這很可能對根瘤菌在土壤中的競爭存活是有利的。有意思的是,B. japonicumUSDA110基因組中沒有發(fā)現負責內源性鐵載體合成的基因,但卻編碼至少3個外膜鐵載體受體蛋白(EntR、FegA、FhuE)以及完整的TonB/ExbB/ExbD供能系統(tǒng)[30]。遺傳證據表明,該菌株可以利用這3種外膜受體通過TonB依賴的方式分別特異地轉運desferrioxamine、ferrichrome和enterobactin 等外源鐵載體[30]。

    當Fe3+-鐵載體復合物被吸收到細胞中后,Fe3+通常以被還原成Fe2+的形式釋放,這一還原反應由鐵還原酶催化完成[29]。目前僅在少數細菌中鑒定的鐵還原酶幾乎都是胞質可溶的且它們的催化活性依賴于核黃素[31-32]。此外,某些鐵還原酶則以鐵硫簇作為其輔酶,如FhuF[33]。目前,在根瘤菌中唯一研究較為清楚的鐵還原酶是由B. japonicum編碼的FrcB,其編碼基因與編碼鐵載體外膜受體的pyoR同源基因位于同一操縱子內[34]。FrcB是定位于內膜的二聚體蛋白且其穩(wěn)定性嚴格依賴于其特定保守組氨酸殘基與血紅素的結合,這一特征與真核生物中的鐵還原酶一致[35]。在大腸桿菌中的異源表達以及體外酶活測定實驗均證實FrcB具有鐵還原酶活性,且在缺鐵條件下該蛋白以Irr依賴性方式被強烈誘導表達[34]。然而,最近的一項研究發(fā)現缺失frcB基因的B. japonicum菌株仍可以利用外源鐵載體吸收鐵供自身生長,這意味著該菌還編碼其他鐵還原酶參與鐵載體依賴的鐵吸收[30]。

    2.1.2 血紅素的攝取 通過血紅素轉運及降解獲得鐵曾被認為是動物致病性細菌所特有的鐵吸收方式。直到1997年,Noya等[36]發(fā)現根瘤菌及其他一些非致病性細菌同樣具備在缺鐵條件下利用血紅素以及血紅蛋白作為鐵源進行生長的能力。隨后,人們在B.japonicum、R. leguminosarum和S. meliloti幾種模式根瘤菌中相繼鑒定了相對較為保守的血紅素轉運相關的基因[37-40]。與鐵載體的轉運十分相似,根瘤菌對血紅素的轉運同樣依賴于TonB/ExbB/ExbD供能復合體以及特異性識別血紅素的外膜受體蛋白[29,38]。HmuR和ShmR分別是由B. japonicum和S. meliloti編碼的外膜血紅素受體蛋白,它們對于根瘤菌吸收血紅素是必需的[40-41]。盡管兩者蛋白相似性僅為23%,但它們都含有典型的血紅素受體FRAP/NPNL基序。在R. leguminosarum中,存在與ShmR蛋白序列一致性高達65%的同源蛋白編碼基因。血紅素在TonB/ExbB/ExbD驅動下經外膜受體蛋白進入周質空間后,會進一步由hmuTUV編碼的ABC轉運子將其泵入胞質中[37-38]。值得注意的是,B. japonicum和S. meliloti中hmuTUV缺失突變并不會導致血紅素利用能力的完全喪失,推測它們還編碼其他類型的血紅素轉運系統(tǒng)[38]。進入胞質中的血紅素既可以被根瘤菌直接利用,也可以通過氧化途徑降解卟啉環(huán)釋放出 Fe2+[42]。

    2.1.3 Fe2+的吸收轉運 雖然鐵一般僅在酸性且厭氧環(huán)境中才以Fe2+形式存在,但由于其相對于Fe3+高可溶性和可以直接通過外膜進入周質空間的特點,而被認為是細菌利用鐵的首選形式。因此,大部分細菌都保留了直接吸收Fe2+的能力。目前,在細菌中鑒定的Fe2+轉運系統(tǒng)主要是Feo轉運系統(tǒng),此外還發(fā)現Yfe轉運系統(tǒng)、Efe轉運系統(tǒng)、Sit轉運系統(tǒng)等也具有Fe2+轉運能力[43]。

    在根瘤菌中,研究較多的Fe2+轉運系統(tǒng)是由B. japonicumUSDA110菌株中feoAB基因所編碼的Feo系統(tǒng)。同位素標記實驗表明,Feo轉運系統(tǒng)的功能失活不僅會導致該菌株無法有效吸收Fe2+,而且Fe3+的吸收轉運也會被抑制,但血紅素的吸收不受影響[44]。因此,研究者認為該菌株對Fe3+的吸收是首先在胞外或周質空間將Fe3+還原為Fe2+,然后再進一步通過Feo系統(tǒng)轉運至細胞內的方式實現的。Sinorhizobium和Rhizobium屬的根瘤菌基因組中不含feoAB同源基因,但都編碼另一種在其他細菌中被證實可以非特異地轉運Fe2+的Sit轉運系統(tǒng)[45-46]。盡管S. meliloti編碼的Sit轉運系統(tǒng)主要功能是轉運Mn2+,但同時也具有一定的Fe2+轉運能力,并且調控該系統(tǒng)表達的調控蛋白Mur的活性除了受到Mn2+調節(jié)外,也部分受到Fe2+的影響[46]。

    2.2 類菌體吸收鐵的方式

    如前所述,根瘤菌在共生階段分化形成的類菌體需要合成大量固氮酶、氫化酶以及細胞色素c等與固氮密切相關的含鐵蛋白,因此鐵是與共生固氮效率密切相關的因素之一。Slatni 等[47]研究發(fā)現菜豆根瘤中鐵的含量與其固氮效率呈正相關。在此情況下,類菌體面臨怎樣的鐵營養(yǎng)條件,采用何種策略吸收鐵成為人們所關注的問題。

    根瘤中存在大量豆血紅蛋白,使人們曾一度懷疑根瘤菌是否在共生階段以血紅素作為自身所需的鐵源。然而,考慮到根瘤菌在侵染細胞內被共生體膜所包被,并不與豆血紅蛋白直接接觸,而游離血紅素的濃度通常又非常低,上述猜測的可能性大大降低。另有大量遺傳學研究表明,根瘤菌在自生條件下吸收血紅素所用的轉運系統(tǒng)缺失對共生固氮沒有顯著影響,不是共生所必需的[37-38]。因此,目前普遍認為根瘤菌通過吸收血紅素獲得鐵的機制很可能主要發(fā)生在根瘤衰老階段[3]。

    盡管尚缺乏充分的直接證據,已有的研究表明類菌體很可能主要以吸收Fe2+的方式獲得鐵。一方面,在侵染細胞中類菌體被共生體膜所包被形成共生小體,共生體膜外偏酸和低氧的植物胞質環(huán)境有利于維持鐵離子以Fe2+形式存在。放射性同位素實驗表明,從大豆根瘤中分離純化的共生小體可以吸收 Fe2+和 Fe3+,但吸收 Fe2+速率明顯快于 Fe3+[48-49]。其中,Fe2+的轉運很可能由定位于共生體膜上的NRAMP家族轉運子GmDMT1實現,盡管該轉運子同時還具備Zn2+、Mn2+等其他二價金屬離子轉運能力[50]。共生體膜與類菌體之間的共生周質空間內pH相比于植物細胞質更低(可以達到4.5-5),并且可以檢測到較強的鐵還原酶活性,更進一步確保類菌體胞外微環(huán)境中可以存在較高濃度的Fe2+[49,51]。另一方面,在幾種典型的模式根瘤菌中,僅轉運Fe2+的Feo系統(tǒng)或Sit系統(tǒng)缺失則導致顯著的共生缺陷[44,46,52],而負責鐵載體或血紅素轉運的基因突變則不影響共生表型[26,37-38,40,42,53-55]。以上證據除了證明類菌體很可能以Fe2+方式吸收鐵之外,還強烈暗示侵染細胞中很可能處于相對富鐵的狀態(tài)。支持這一猜想的最新證據來自于S. fredii,其中鐵響應調節(jié)蛋白RirA缺失會導致共生固氮能力降低,而該蛋白已被證實在高鐵條件下會抑制TonB依賴的鐵吸收[56]。

    3 根瘤菌胞內鐵穩(wěn)態(tài)的調控

    盡管鐵具有極其重要的生物學功能,但如果細胞中存在過量的鐵則容易引發(fā)芬頓反應生成活性氧類物質,進而造成毒害作用[57]。因此,細胞內自由鐵離子的濃度必須控制在較低的水平。與其他細菌相一致,根瘤菌內鐵離子穩(wěn)態(tài)通過以下4種途徑實現:(1)調控轉運相關基因的表達;(2)利用鐵儲藏蛋白將鐵轉化為非自由狀態(tài);(3)依據環(huán)境中鐵的多寡選擇性表達依賴或非依賴于鐵的酶類;(4)調控鐵外排通道蛋白的表達。在大腸桿菌等模式物種中,鐵代謝相關基因主要受全局性鐵代謝調控蛋白Fur調控[58]。雖然大部分根瘤菌也都編碼Fur同源蛋白,但它們主要負責調控與錳離子轉運相關的基因,因而被重新命名為Mur[41,59]。實際上,根瘤菌中鐵穩(wěn)態(tài)的實現主要依賴于另外兩種調控蛋白Irr和RirA所介導的調控(圖4)[58]。

    圖4 R.leguminosarum中Irr和RirA介導的鐵代謝的調控機制(改自[58])

    Irr屬于Fur調控蛋白家族,該蛋白最早被發(fā)現在B. japonicum中調控血紅素合成途徑[60],而現已被證實是廣泛分布于α-變形菌綱根瘤菌和非根瘤菌中響應低鐵條件的全局轉錄調控因子[61]?;诨蛐酒霓D錄組分析發(fā)現,B. japonicum中大多數受外源鐵調節(jié)的基因在轉錄水平上受到Irr調控[62]。其中,與鐵吸收以及血紅素降解相關的基因受正調控,而與鐵的利用、貯藏以及外排相關的基因如bfr則受負調控。然而,在R. leguminosarum和S. meliloti中的研究卻僅發(fā)現Irr作為抑制子發(fā)揮作用,負調控下游靶基因的表達[61,63]。基于體外蛋白-DNA互作以及定點突變等分析的結果表明,B. japonicum中Irr與受其正調控和負調控的基因啟動子區(qū)均存在結合作用,因此Irr可能除了抑制基因表達外,在某些情況下還扮演激活子角色[62,64-65]?;谛蛄斜葘Ψ治觯藗儼l(fā)現在許多受Irr調控的基因啟動子區(qū)存在被命名為ICE(Iron control element)的保守順式作用元件[37,66]。

    非常有趣的是,Irr與 Fur、Zur、Nur、Mur等其他Fur家族成員不同,它并非直接與特定金屬離子結合進而激活自身DNA結合活性,而是通過與血紅素結合間接感知細胞內鐵的含量。在B. japonicum中,不結合血紅素的Irr結構較穩(wěn)定,而當其與血紅素結合時則被降解[67]。現有研究表明,Irr的降解依賴于其自身所包含的兩個血紅素結合域HRM(Heme-regulatory motif)和 HXH(Histidine-x-histidine)結構域[68-69]。由R. leguminosarum編碼的 Irr缺少HRM結構域,而HXH結構域與血紅素結合只對其DNA結合活性有影響,但并不會導致蛋白的降解[70]。

    除了Irr之外,屬于Rhizobiaceae科的細菌還普遍編碼屬于Rrf2家族的鐵響應轉錄調控蛋白RirA[59,71-75]。與 Irr恰巧相反,RirA 在高鐵條件下負調控許多與鐵載體合成轉運以及血紅素吸收相關的基因[76]。與此相一致,RirA缺失突變體通常表現出在高鐵培養(yǎng)基中生長遲緩的表型,且對H2O2更加敏感[73,75]?;谵D錄組和蛋白質組學的研究發(fā)現,S. meliloti和R. leguminosarum中受RirA調控的基因除了參與鐵吸收之外,還涉及硫代謝、能量代謝以及胞外多糖合成等途徑[71,73]。通過生物信息學方法,Rodionov和Yeoman等在受RirA調控的基因啟動子區(qū)發(fā)現了保守的IRO調控元件(Iron-Rhodobox)[59,72]。與其他 Rrf2家族蛋白類似,RirA 蛋白序列中含有可以與鐵硫簇結合的保守Cys殘基。最新研究表明,雖然RirA可以與[2Fe2S]和[4Fe4S]兩種鐵硫簇都發(fā)生結合,但僅在與[4Fe4S]結合時具備較強的DNA結合活性[77]。因此,RirA的調節(jié)活性除了依賴于細胞內鐵的濃度外,還受到硫元素以及氧氣含量的調節(jié)[77]。

    在同時含Irr和RirA的根瘤菌中,一些下游基因通常同時受到兩者的協(xié)同調控,其中包括編碼這兩種調控蛋白的基因本身,這種嚴密的協(xié)同調控可能有利于細胞對自身鐵營養(yǎng)狀態(tài)做出快速響應[59,63,78]。除此之外,受 RirA 和 Irr調控的基因還編碼一些菌株特異性的局部鐵代謝調節(jié)蛋白,如HmuP、RhrA和RpoI等。在S. meliloti中,HmuP的表達受RirA負調控,而其本身對于shmR的表達是必需的[79]。然而,在缺少RirA的B. japonicum中,HmuP則通過與Irr協(xié)同作用激活hmuR操縱子的表達[80]。RhrA是屬于AraC家族的轉錄調控因子,在S. meliloti中該蛋白可以激活負責rhizobactin 1021合成的rhbABCDEF操縱子[26,81]。在R. leguminosarum中,負責合成vicibaction的vbs基因啟動子依賴于特殊的σ因子RpoI起始轉錄[25]。

    4 結語

    鐵在根瘤菌中參與許多重要蛋白的合成,尤其在共生固氮過程中發(fā)揮極其重要的作用。基于大量自生條件下的研究,人們發(fā)現根瘤菌可利用多種轉運系統(tǒng)吸收不同形式的鐵,并通過Irr和RirA等調節(jié)蛋白介導的精密調控實現細胞鐵穩(wěn)態(tài)。然而,共生階段根瘤菌在宿主細胞內通過何種方式獲取鐵以及如何與宿主協(xié)調實現鐵營養(yǎng)的平衡至今仍沒有清晰答案。根瘤菌遺傳多樣性以及鐵轉運系統(tǒng)的冗余客觀上為此方面研究造成了困難,進一步的研究需針對特定菌株構建遺傳背景更加清晰的突變體展開。相應地,鐵在根瘤內的轉運代謝途徑同時也需要從宿主植物方面展開。近年來日益發(fā)展成熟的同步輻射X光吸收譜(X-ray absorption fine spectroscopy,XAFS)可以實現原位金屬離子分布及化學形態(tài)的檢測,應用此技術或可在上述方面取得突破性進展。鑒于鐵廣泛參與了與共生固氮密切相關的物質、能量以及信號分子代謝,如何通過改變根瘤菌鐵代謝調控共生固氮效率也是未來值得研究的方向。

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