洗潔精對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管的刺激性評(píng)價(jià)

陳梓靈, 徐穎愉, 劉香梅, 劉冬虹, 龐增雄

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院, 廣州511447)

洗潔精作為一種重要的日常洗滌劑，除清潔、去污以外，近年來(lái)隨著生活水平的提高，大眾對(duì)其提出了新的要求——綠色環(huán)保以及對(duì)皮膚的低刺激或者無(wú)刺激性。在3R原則和動(dòng)物福利倫理日漸受到重視的今日，多重替代動(dòng)物試驗(yàn)的體外方法得到開發(fā)和應(yīng)用[1,2]。其中雞胚尿囊膜試驗(yàn)(hen’s egg test on the chorioallantotic membrane,Het-Cam)作為化妝品兔眼刺激性試驗(yàn)的替代試驗(yàn)之一，大多數(shù)評(píng)估結(jié)論認(rèn)為Het-Cam在表面活性劑和以表面活性劑為基礎(chǔ)的配方等物質(zhì)的測(cè)試中與傳統(tǒng)的Drauze兔眼試驗(yàn)顯示較好相關(guān)性[3]。本文旨在通過(guò)Het-Cam對(duì)市面上銷售的幾款洗潔精的刺激性進(jìn)行研究，比較Het-Cam刺激性評(píng)分與洗潔精中表面活性劑含量之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討Het-Cam在洗潔精刺激性研究以及洗潔精質(zhì)量提升中的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

5種市售洗潔精樣品，均由廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院化工檢驗(yàn)部監(jiān)督抽樣提供, 分別標(biāo)為A、B、C、D和E。白來(lái)杭雞0日齡雞胚，35個(gè)，購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2014-0002]。

1.2 主要試驗(yàn)儀器與試劑

LRH250F型生化培養(yǎng)箱, 上海一恒科學(xué)儀器有限公司; Stemi 2000C型體視顯微鏡, 德國(guó)蔡司公司。氯化鈉, 廣州化學(xué)試劑廠, 批號(hào)為20140701-2; 氫氧化鈉，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)為20141102-1。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 Het-Cam 將各洗潔精用去離子水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的水溶液。參照出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2329-2009《化妝品眼刺激性/腐蝕性的雞胚尿囊膜試驗(yàn)》[4]，由于受試物均為透明液體，本次實(shí)驗(yàn)采用反應(yīng)時(shí)間法。0日齡雞胚于培養(yǎng)箱中37.5 ℃孵育至9日齡，照蛋檢查后用牙科鋸齒彎鑷剝?nèi)ヒ褬?biāo)記氣室位置的蛋殼部分。用鑷子去除蛋內(nèi)膜，將100 μL樣品水溶液滴加于尿囊膜表面，觀察Cam反映情況，并記錄作用5 min內(nèi)出血、血管融解、凝血的毒性效應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間，并進(jìn)行拍照。每種樣品做6次平行試驗(yàn)，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9% NaCl溶液為陰性對(duì)照，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4% NaOH溶液為陽(yáng)性對(duì)照。

參照文獻(xiàn)[4]，采用刺激評(píng)分法(irritation score,IS)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，應(yīng)用以下公式計(jì)算刺激評(píng)分(IS)，結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后兩位:

式中:

secH(出血時(shí)間)即尿囊膜上觀察到開始發(fā)生出血的平均時(shí)間(s);

secL(血管融解時(shí)間)即尿囊膜上觀察到開始發(fā)生血管融解的平均時(shí)間(s);

secC(凝血時(shí)間)即尿囊膜上觀察到開始發(fā)生凝血的平均時(shí)間(s)。

1.4.2 總活性物含量測(cè)定 依據(jù)GB 9985-2000《手洗餐具洗滌劑》中附錄A總活性物質(zhì)含量的檢測(cè)方法[5]，由本院化工檢驗(yàn)部對(duì)各受試物進(jìn)行總活性物含量測(cè)定。

1.4.2.1 活性物含量的測(cè)定稱取各受試物2 g于燒杯中置(105±2)℃烘箱中2 h后取出，冷卻至室溫后加入50 mL三氯甲烷，置50 ℃水浴上加熱至完全溶解，再冷卻至室溫靜置沉降，傾倒上清液至過(guò)濾漏斗進(jìn)行抽濾，再以三氯甲烷重復(fù)洗滌抽濾3次。將三氯甲烷溶液由抽濾瓶轉(zhuǎn)入已恒重的底瓶中，通過(guò)索氏抽提器在水浴鍋上回收溶劑，待底瓶?jī)?nèi)容物蒸干時(shí)加入3 mL丙酮，待完全蒸發(fā)后將底瓶放入(105±2) ℃烘箱中2 h后取出放在干燥器內(nèi)冷卻30 min，稱重。

1.4.2.2 尿素含量的測(cè)定稱取各受試物0.5 g至碘量瓶中，加入50 mL蒸餾水溶解后加入1滴甲基橙指示劑，用鹽酸中和至橙色，加入0.2g尿素酶后加塞，置于50 ℃水浴中，40 min后取出冷卻，用0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至如同中和時(shí)出現(xiàn)的橙色。同時(shí)設(shè)置空白試驗(yàn)。

1.4.2.3 結(jié)果計(jì)算

式中:

m1為三氯甲烷溶解物質(zhì)量(g);

m為試驗(yàn)份的質(zhì)量(g)

式中:

V1為樣品消耗0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(mL);

V0為空白試驗(yàn)消耗0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(mL);

c為0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L);

m為試驗(yàn)份質(zhì)量(g)

2 結(jié)果

2.1 Het-Cam

根據(jù)1.4.1中的試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)并根據(jù)公式計(jì)算IS值，具體結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知，與陰性對(duì)照相比，5種洗潔精樣品的出血時(shí)間和血管融解時(shí)間均有不同程度縮短，未出現(xiàn)凝血現(xiàn)象。樣品中IS值最高為C款洗潔精，IS值最低為A款洗潔精，5種樣品IS值均未達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照IS值。5種樣品及對(duì)照組的雞胚絨毛尿囊膜在5 min時(shí)血管及血管網(wǎng)的受損程度見(jiàn)圖1。

2.2 總活性物含量檢測(cè)

根據(jù)1.4.2中的試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)并根據(jù)公式計(jì)算總活性物含量，5種洗潔精樣品中總活性物含量最高為B款洗潔精，含量最低為C款洗潔精(表 1)。

表 1 5款洗潔精Het-Cam與總活性物含量檢測(cè)結(jié)果Table 1 The results of Het-Cam and total active matter content in 5 dishwashing liquids

3 討論

天然、安全和無(wú)刺激作為當(dāng)今洗潔精等洗滌劑最大的賣點(diǎn)與未來(lái)發(fā)展方向，需要對(duì)其對(duì)生物機(jī)體的刺激性有更有效的評(píng)價(jià)方法。Het-Cam試驗(yàn)作為傳統(tǒng)Drauze兔眼試驗(yàn)的替代試驗(yàn)之一，與皮膚刺激性試驗(yàn)對(duì)應(yīng)的替代試驗(yàn)相比較，有著試驗(yàn)所需設(shè)施設(shè)備少、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉以及對(duì)表面活性劑敏感的優(yōu)勢(shì)。由此可見(jiàn), 利用Het-Cam試驗(yàn)對(duì)洗潔精的刺激性進(jìn)行評(píng)分，對(duì)洗潔精的配方和質(zhì)量?jī)?yōu)化等有一定意義。

圖 1 5款洗潔精反應(yīng)5 min雞胚絨毛尿囊膜情況Figure 1 Reaction of 5 dishwashing liquids in chick chorioallantoic membrane for 5 minutes

Het-Cam結(jié)果顯示，樣品C和B刺激性評(píng)分較高，分別為10.07和8.84，而樣品A和D刺激性評(píng)分較低，分別為5.69, 6.75。而相應(yīng)的總活性物含量也分別為15.34%、28.21%和16.37%、17.14%。由此可得，洗潔精刺激性與洗潔精中總活性物含量具有一定的正相關(guān)性，總活性物含量較高的洗潔精的刺激性評(píng)分大部分偏高。因此，Het-Cam可以初步測(cè)定不同洗潔精產(chǎn)品的刺激性，在研究洗潔精刺激性方面具有可行性。但是洗潔精的刺激性評(píng)分并不嚴(yán)格隨著總活性物含量升高而升高，樣品C的Het-Cam刺激性試驗(yàn)評(píng)分是5個(gè)樣品中最高，IS評(píng)分為10.07，但其總活性物含量在5款洗潔精中為最低，分析原因，可能與配方其他成分、原料品質(zhì)、制作工藝或產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的其他風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)有關(guān)。在常規(guī)的洗潔精理化檢測(cè)項(xiàng)目中，檢測(cè)項(xiàng)目一般為總表面活性物質(zhì)或單一活性物質(zhì)的含量，僅從活性物的含量對(duì)洗潔精的刺激性進(jìn)行判斷，容易忽視活性物質(zhì)原料質(zhì)量以及活性物質(zhì)配方引起的洗潔精刺激性的變化。從Het-Cam結(jié)果可以看出，在以總活性物種類和含量作為洗潔精質(zhì)量高低的標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)，也需要對(duì)其原料質(zhì)量、配方等進(jìn)行考量，因此，使用Het-Cam對(duì)洗潔精的刺激性進(jìn)行評(píng)分，也有助于洗潔精的質(zhì)量?jī)?yōu)化。

表面活性劑對(duì)皮膚的刺激作用主要體現(xiàn)在當(dāng)它與皮膚角質(zhì)層中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)相互作用后，會(huì)破壞角質(zhì)層屏障, 導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)紅斑、干燥和瘙癢癥狀[6]。例如十二烷基硫酸鈉(SLS)作為表面活性劑中陰離子表面活性劑脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉的一種, 具有抗硬水性好, 氣泡性能、濕潤(rùn)性能好, 與皮膚有良好的相容性的特點(diǎn), 被廣泛應(yīng)用于香波、沐浴用品、剃須膏等盥洗衛(wèi)生用品和各種洗滌劑、清潔劑中[7]。但是實(shí)驗(yàn)表明SLS作用于角質(zhì)層的脂質(zhì)及蛋白結(jié)構(gòu), 引起腫脹并破壞角質(zhì)層, 致使其屏障功能受到影響。低濃度的SLS(低于1%)主要導(dǎo)致皮膚屏障的損傷，高濃度的SLS(高于1%)引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)和皮膚屏障損傷的進(jìn)一步增強(qiáng)[8]。本次試驗(yàn)也證明市售成品稀釋至1.5%時(shí)，以表面活性劑為主要配方物質(zhì)的洗潔精仍然對(duì)雞胚絨毛尿囊膜有較大的刺激性。

綜上所述，Het-Cam在洗潔精刺激性評(píng)價(jià)方面既具有可行性，也具有試驗(yàn)意義。我們也將進(jìn)一步探索Het-Cam在洗潔精刺激上的更詳細(xì)具體的試驗(yàn)方法和等級(jí)劃分方法。