頭燈下經(jīng)口直視的大鼠非暴露式氣管滴注法的建立

龍隆, 譚紅, 楊鴻波

(1. 中國(guó)鐵路成都局集團(tuán)有限公司重慶疾病預(yù)防控制所, 重慶400014;2. 貴州省分析測(cè)試研究院, 貴陽(yáng)550000)

呼吸暴露是外界物質(zhì)進(jìn)入人機(jī)體最主要途徑之一，氣管滴注法在呼吸系統(tǒng)相關(guān)研究中因其具有穩(wěn)定和精準(zhǔn)等特點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用[1,2], 雖然近年來(lái)自然吸入染毒法的應(yīng)用呈上升趨勢(shì), 但其成本較高,還存在暴露倉(cāng)內(nèi)濃度分布不均, 均一性和穩(wěn)定性都難以滿足實(shí)驗(yàn)要求等諸多問(wèn)題，氣管滴注法在國(guó)內(nèi)仍然擁有較高的使用率。由于大鼠聲門(mén)位置較高，插管時(shí)聲門(mén)暴露困難，迅速而準(zhǔn)確行氣管滴注操作十分關(guān)鍵，暴露式氣管滴注方法雖然簡(jiǎn)便快捷，但對(duì)動(dòng)物機(jī)體損傷比較大，在慢性或亞慢性實(shí)驗(yàn)中，往往需要反復(fù)多次滴注，組織反復(fù)損傷及術(shù)后感染都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的機(jī)體造成損傷。本研究在總結(jié)了既往國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究和探索改良的基礎(chǔ)上, 設(shè)計(jì)出一種兼顧安全和高效的非暴露式氣管滴注方法, 為今后相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

SPF級(jí)雄性SD大鼠20只, 體質(zhì)量200～350 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]，常規(guī)飼養(yǎng)于貴州健安德科技有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)(IVC)中[SYXK(黔)2016-005]。12 h明暗晝夜交替, 設(shè)施溫度22～24 ℃,相對(duì)濕度50%～70%，正常飲食飲水。

將22G Y型靜脈留置針針芯的針尖磨平去掉約2 mm(以免插管時(shí)損傷氣管)后回插入留置針套管, 但不完全插入, 針尖與套管前端保留大約3 mm的距離，防止針尖對(duì)動(dòng)物氣道造成損傷(圖1)。強(qiáng)光變焦頭燈(直徑65 mm，深度60 mm)(圖2)。其他材料包括棉簽、紗布、膠帶纏繞過(guò)的小夾子、解剖板、皮筋、絲線、1 mL注射器。

1.2 方法

1.2.1 麻醉與固定采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉按30 mg/kg體質(zhì)量進(jìn)行麻醉，用絲線套住大鼠上切牙，仰臥吊于45～60°傾斜的解剖板上固定，用皮筋將大鼠四肢固定于解剖板，并在動(dòng)物頸后部墊一塊紗布抬高氣管位置，便于后續(xù)插管。

圖 1 自制滴注裝置

圖 2 強(qiáng)光變焦頭燈

1.2.2 氣管插管和滴注 實(shí)驗(yàn)人員帶好頭燈，將臺(tái)燈發(fā)散的光源照進(jìn)動(dòng)物口腔，左手拇指和食指將動(dòng)物舌體輕輕牽拉至一側(cè)后用包裹了膠帶的小夾子將舌體輕輕夾住，再用棉簽擦拭動(dòng)物咽部分泌物的同時(shí)輕壓舌體并固定，左手中指用于調(diào)整動(dòng)物體位，調(diào)整好操作手法以及頭燈角度后可以清晰看見(jiàn)咽部和忽明忽暗的聲門(mén)裂，右手持含有針芯的磨鈍的自制靜脈留置針套管在頭燈的輔助下迅速插入氣管口約3 cm，輕輕將針芯從套管中抽出，并用膠帶將套管固定，松開(kāi)牽出的舌體，此時(shí)可以觀察到導(dǎo)管內(nèi)有呼吸所致蒸氣貼壁現(xiàn)象，將細(xì)棉絲放置于套管的注射器接口，能夠看見(jiàn)細(xì)棉絲伴隨著大鼠呼吸而飄動(dòng)，如若不然，則需重新插管。用1 mL注射器吸取0.1 mL生理鹽水后連接套管并緩慢注入，再注入同體積空氣。

1.2.3 滴注后操作 迅速拔出靜脈留置針套管, 關(guān)閉光源, 懸掛約半分鐘后平放于手術(shù)臺(tái)上旋轉(zhuǎn), 模擬真實(shí)給藥染毒, 使生理鹽水在兩肺內(nèi)均勻分布。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用隔日滴注，每只動(dòng)物分7 d滴注4次，共進(jìn)行40次大鼠氣管滴注操作，全部一次性成功，滴注操作大約3 min，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在操作過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)呼吸急促等現(xiàn)象均能保持較平穩(wěn)呼吸，沒(méi)有出現(xiàn)窒息或死亡，動(dòng)物蘇醒后進(jìn)食、飲水、活動(dòng)等一般觀察均無(wú)異常，解剖后檢查也未見(jiàn)氣管損傷等情況。

3 討論

方法建立注意事項(xiàng): ①掌握合適的麻醉深度是完成氣管插管的前提。麻醉過(guò)淺會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不能進(jìn)入麻醉狀態(tài)或進(jìn)入麻醉狀態(tài)較慢, 甚至在氣管滴注過(guò)程中出現(xiàn)強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng), 從而影響動(dòng)物生理狀態(tài)。麻醉劑量過(guò)大容易造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生呼吸抑制而死亡，這就要求我們需要協(xié)調(diào)麻醉速度與氣管滴注操作速度, 使其穩(wěn)步有序。經(jīng)過(guò)前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)和大量文獻(xiàn)的收集, 我們發(fā)現(xiàn)腹腔注射1%戊巴比妥鈉按30 mg/kg體質(zhì)量進(jìn)行麻醉能使動(dòng)物較快、較好進(jìn)入麻醉狀態(tài), 并且用小鑷子輕夾大鼠的四趾腳趾, 大鼠無(wú)任何反應(yīng)。②牽拉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物舌體時(shí)手法要輕柔, 在保證撐開(kāi)口腔的同時(shí)要避免損傷到動(dòng)物。③行氣管滴注操作前要對(duì)套管插入深度進(jìn)行解剖觀察，切勿盲插，減少對(duì)動(dòng)物的損傷。④正式實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行滴注液體體積的測(cè)試。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中, 使用不同的靜脈留置針和注射器在行滴注操作過(guò)程時(shí), 實(shí)際的滴注劑量有所偏差,并且滴注時(shí)使用的注射器底部容易殘留液體, 導(dǎo)致實(shí)際給藥往往小于理論給藥, 偏差大約在0.01 mL以內(nèi)。因此在進(jìn)行正式滴注染毒操作前需先測(cè)試其體積, 反復(fù)充盈整個(gè)滴注裝置, 觀察實(shí)際劑量與注射劑量的差值, 確保染毒劑量的精準(zhǔn)。⑤滴注完畢后可以適當(dāng)補(bǔ)氣, 防止動(dòng)物窒息, 同時(shí)應(yīng)注意控制補(bǔ)氣速度和補(bǔ)氣量。根據(jù)既往研究和預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們?cè)诘巫⑼戤吅髮? mL空氣1.5 s內(nèi)注入氣道，達(dá)到分散染毒物質(zhì)以及避免動(dòng)物窒息等問(wèn)題。⑥整個(gè)滴注操作過(guò)程應(yīng)盡量迅速, 筆者認(rèn)為，滴注操作應(yīng)控制在2 min以內(nèi)為宜, 若滴注時(shí)間較長(zhǎng)容易發(fā)生缺氧或窒息。同時(shí)動(dòng)物在麻醉期間體溫容易下降，需要采取一定的保溫措施。

現(xiàn)階段與呼吸系統(tǒng)相關(guān)的研究呈逐年上升的趨勢(shì)，但自然吸入法受到多種條件的限制并未廣泛開(kāi)展，目前國(guó)內(nèi)外采用氣管滴注法還是比較常見(jiàn)，但操作方式并不一致[2-4]。本文介紹的氣管滴注法與既往的滴注法相比具有更安全、廉價(jià)和更快捷、高效等特點(diǎn)。

早在1980年代就有學(xué)者采用盲探插管法成功率高達(dá)90%[5]，但插管耗時(shí)較長(zhǎng)，同時(shí)還存在需反復(fù)試插，對(duì)動(dòng)物咽喉部及氣道造成損傷的缺點(diǎn)，該法對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高，因此并未廣泛開(kāi)展，高效而精準(zhǔn)的氣管滴注法仍需借助其他設(shè)備。有學(xué)者[6,7]使用自制的光纖引入口腔內(nèi)照明進(jìn)行氣管插管，成功率較高，但成本高、過(guò)程較慢。Fuentes等[8]使用電子內(nèi)鏡輔助操作，保證了成功率，但操作繁雜無(wú)法達(dá)到快速插管的缺點(diǎn)。有研究提出將顯微導(dǎo)絲應(yīng)用于氣管滴注[9]，但也存在上述問(wèn)題。據(jù)報(bào)道，在透射燈以及額鏡下行氣管滴注效果較好[10]。

本研究通過(guò)總結(jié)國(guó)內(nèi)外氣管滴注相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究, 探索出頭燈下經(jīng)口直視氣管滴注法, 事先將動(dòng)物分批麻醉, 然后使用頭燈行氣管滴注的操作, 不僅廉價(jià)安全而且可靠, 僅需一個(gè)實(shí)驗(yàn)人員便能完成整個(gè)滴注操作, 與傳統(tǒng)滴注需要兩位實(shí)驗(yàn)人員相比,效率進(jìn)一步提高。綜上所述，應(yīng)用頭燈行氣管滴注操作簡(jiǎn)單，快速，安全，廉價(jià)，可重復(fù)性強(qiáng)，可廣泛應(yīng)用于大鼠呼吸道給藥染毒等相關(guān)研究。