HPLC法同時測定銀翹解毒丸（水蜜丸）中5種成分的研究

北京市昌平區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心（102200）范宇佳

北京市昌平區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局（102200）徐立民 張愛華

銀翹解毒丸處方源于銀翹散，銀翹散出自我國清代著名醫(yī)家吳瑭所著的《溫病條辨》一書[1]，演變于金元四大醫(yī)學(xué)家之一李東垣的清心涼膈散。原文記載的本方藥物組成為“銀花一兩，連翹一兩，苦桔梗六錢，薄荷六錢，竹葉四錢，生甘草五錢，荊芥穗四錢，淡豆豉五錢，牛蒡子六錢，用鮮蘆根湯煎煮后服用”。主要用于治療流行性感冒、上呼吸道感染、急性扁桃腺炎、咽喉炎、肺炎、皰疹、麻疹、流行性腮腺炎等病毒性感染疾病[2]，也有用于手足口病、艾滋病等治療的文獻(xiàn)報道[3][4]。

附表1 5種成分線性關(guān)系

附表2 5種成分加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

附表3 5種成分含量測定結(jié)果（mg/g）

作為我國中藥傳統(tǒng)劑型口服散劑的銀翹散，雖然具有吸收快、起效快等特點，但也存在服用量大、服用次數(shù)多，不便于服用等缺點。目前國內(nèi)由銀翹散為處方改制的中成藥品種有26個，其中銀翹解毒丸、銀翹解毒片是應(yīng)用最為廣泛的原方改劑品種，是治療風(fēng)熱感冒的常用中成藥，該藥療效穩(wěn)定，臨床應(yīng)用廣泛。

銀翹解毒丸（水蜜丸）收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十九冊[5]，該標(biāo)準(zhǔn)中通過顯微鑒別、薄層色譜定性檢測金銀花、桔梗、連翹、牛蒡子、荊芥、薄荷、甘草七種中藥材，無定量檢測項目。對其質(zhì)量控制的研究報道，主要集中在以HPLC測定其中的綠原酸、牛蒡子苷、連翹苷等單個成分的含量[6-9]。本實驗采用高效液相色譜（HPLC）方法，同時測定銀翹解毒丸（水蜜丸）中綠原酸、連翹苷、牛蒡苷、甘草苷和甘草酸等特征性成分的含量，該方法簡單、高效，可有效控制質(zhì)量，確保臨床療效。

附圖 5種成分HPLC色譜圖。1：綠原酸；2：甘草苷；3：連翹苷；4：牛蒡苷；5：甘草酸

1 儀器

XS205DU電子天平（0.01mg，美國梅特勒公司）；KQ-500DV 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；LC-20A高效液相色譜儀（配置在線真空脫氣裝置、四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱恒溫箱、SPD-20A紫外檢測器，日本島津公司）。

2 試藥

綠原酸（含量96.6%，批號110753-201314）、連翹苷（含量95.3%，批號110821-201213）、牛蒡苷（含量95.7%，批號110819-201309）、甘草苷（含量93.7%，批號111610-201106）、甘草酸銨（含量92.6%，批號110731-201317）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；銀翹解毒丸（水蜜丸）（每100粒重10g）購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠；甲醇、乙腈均為色譜純（美國Fisher Scientific公司）；水為超純水。

3 方法與結(jié)果

3.1色譜條件 ThermoC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相A為乙腈，B為0.5%磷酸，梯度洗脫（0～8min，5%A；8～12min，5%→15%A；12～30min，15%A；30～50min，15%→40%A；50～60min，40%→60%A；60～70min，60%→100%A；70～80min，100%→5%A），體積流量0.8mL/min；檢測波長230nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量供試品溶液10μL，對照品溶液5μL。

3.2對照品溶液制備 精密稱取連翹苷對照品5.42mg置10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成連翹苷對照品貯備液；再分別精密稱取綠原酸對照品8.14mg，牛蒡苷對照品10.12mg，甘草苷對照品2.51mg，甘草酸銨對照品7.91mg置同一50mL量瓶中，并精密加入上述連翹苷對照品貯備液1mL，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1mL含綠原酸0.1573mg，連翹苷0.0103mg，牛蒡苷0.1937mg，甘草苷0.0470mg，甘草酸0.1435mg（甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207）的混合對照品溶液。

3.3供試品溶液制備 取銀翹解毒丸（水蜜丸）適量，研細(xì)，取約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲提取30min，放冷，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過（0.45μm微孔濾膜），取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3.4陰性樣品溶液制備 按銀翹解毒丸（水蜜丸）處方及工藝，制備金銀花陰性樣品、連翹陰性樣品、牛蒡子陰性樣品和甘草陰性樣品，再按“3.3”項下方法分別制備金銀花陰性供試品溶液、連翹陰性供試品溶液、牛蒡子陰性供試品溶液和甘草陰性供試品溶液。

3.5系統(tǒng)適用性試驗 精密吸取“3.2”～“3.4”項下溶液適量，在“3.1”項色譜條件下測定，結(jié)果見附圖。由附圖可知，各成分分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于30000，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

3.6線性關(guān)系考察 取“3.2”項下對照品溶液，按“3.1”色譜條件分別進(jìn)樣1、2、4、6、8、10、12μL，測定。以對照品溶液的進(jìn)樣體積（μL）為橫坐標(biāo)（x），各對照品色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見附表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.7精密度試驗 精密吸取供試品溶液10μL，在“3.1”項色譜條件下測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算綠原酸、連翹苷、牛蒡苷、甘草苷、甘草酸峰面積的RSD分別為0.05%、0.47%、0.08%、0.36%、0.15%，表明儀器的精密度良好。

3.8重復(fù)性試驗 取樣品（批號12031242）6份，按“3.3”項下方法制備供試品溶液，在“3.1”項色譜條件下測定，測得綠原酸、連翹苷、牛蒡苷、甘草苷、甘草酸含量的RSD分別為0.34%、1.48%、0.28%、1.20%、1.78%，表明該方法的重復(fù)性良好。

3.9穩(wěn)定性試驗 取樣品（批號12031242）1份，按“3.3”項下方法制備供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、10 h后，在“3.1”項色譜條件下測定，測得綠原酸、連翹苷、牛蒡苷、甘草苷、甘草酸峰面積的RSD分別為0.12%、0.53%、0.20%、0.11%、1.73%，表明供試品溶液在室溫下10h內(nèi)穩(wěn)定。

3.10加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的銀翹解毒丸（批號12031242）6份，每份取0.50g，置于具塞錐形瓶中，精密加入“3.2”項下混合對照品溶液2ml，按“3.3”項下方法制備供試品溶液，在“3.1”項色譜條件下測定，計算加樣回收率，結(jié)果見附表2。

3.11樣品含量測定 取3批樣品，按“3.3”項下方法制備供試品溶液，在“3.1”項色譜條件下測定，結(jié)果見附表3。

4 討論

4.1流動相選擇 在流動相的選擇上，選取乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液等溶劑系統(tǒng)，分別測定同一供試品溶液中5種被測成分的峰面積。在乙腈-0.5%磷酸溶液流動相系統(tǒng)，梯度洗脫的色譜條件下，綠原酸、牛蒡苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸分離效果良好，峰形較好，在60min 內(nèi)就能實現(xiàn)良好的分離。確定乙腈-0.5%磷酸溶液為流動相系統(tǒng)。

4.2檢測波長選擇 在檢測波長的選擇上，取5種被檢測成分綠原酸、連翹苷、牛蒡苷、甘草苷和甘草酸（以甘草酸銨計）的對照品，分別加甲醇配制成對照品溶液，在200～400nm波長范圍內(nèi)掃描測定紫外吸收光譜，測得各成分的最大吸收波長，通過分析比較，選取230nm、250nm、280nm作為備選檢測波長。在備選檢測波長下分別測定同一供試品溶液中5種被測成分的峰面積。為保證5種被測成分均有較大吸收，確定檢測波長為230nm。

4.3柱溫選擇 分別考察了25℃、30℃、40℃柱溫時對樣品峰形、保留時間、分離度的影響，最終選擇25℃作為最佳柱溫。

5 結(jié)論

該實驗采用HPLC法同時測定銀翹解毒丸（水蜜丸）中綠原酸、連翹苷、牛蒡苷、甘草苷、甘草酸含量的方法，操作簡便、專屬性強、結(jié)果可靠，能快速、直觀和全面地反映銀翹解毒丸（水蜜丸）內(nèi)在質(zhì)量，可應(yīng)用于銀翹解毒丸（水蜜丸）的質(zhì)量控制及生產(chǎn)過程質(zhì)量控制。