穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機(jī)制

李 建，冷錦紅

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，主要累及感覺(jué)神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)，產(chǎn)生感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)障礙。3%～25%的糖尿病患者會(huì)經(jīng)歷這種神經(jīng)病理性疼痛，表現(xiàn)為肢體的疼痛、麻木，嚴(yán)重者會(huì)形成潰瘍或壞疽，最終選擇截肢，嚴(yán)重地影響了患者的生活質(zhì)量［1］。由于其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，現(xiàn)有的治療只能緩解癥狀，而尚未有有效的治療方法來(lái)逆轉(zhuǎn)痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的進(jìn)展。

穿山龍為薯蕷科植物穿龍薯蕷Dioscorea nipppnicaMak.的干燥根，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、活血止痛等功效，在治療腰腿疼痛、筋骨麻木、風(fēng)寒濕痹、跌打損傷等疾病有明顯療效?，F(xiàn)代藥理研究表明，穿山龍有抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血脂、鎮(zhèn)咳平喘等多種藥理作用。有關(guān)穿山龍單品或提取物治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的研究近年來(lái)多見報(bào)道［2-3］，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)［4］出發(fā)，從系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)的角度在分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的層面，通過(guò)對(duì)穿山龍藥效成分進(jìn)行計(jì)算機(jī)虛擬篩選，構(gòu)建穿山龍活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路相互作用網(wǎng)絡(luò)，認(rèn)識(shí)中藥穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的整體作用機(jī)制。以期揭示穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的藥效基礎(chǔ)，為更好的開發(fā)治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變藥物提供參考依據(jù)。

1 方法

1.1 分析平臺(tái) 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的主要材料是分析軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究中采用的數(shù)據(jù)庫(kù)和分析軟件主要有中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php，Version：2.3）、TCM Database＠taiwan 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tcm.cmu.edu.tw／）、Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）、Molinspiration 網(wǎng)站（http：//www.molinspiration.com／cgi-bin／properties）、PharmMapper 服務(wù)器（http：//59.78.98.102／pharmmapper／index.php）、UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org／）、Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genecards.org／）、String 10.5 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org／cgi／input.pl）、DAVID 6.8 數(shù)據(jù)（https：//david.ncifcrf.gov／home.jsp）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genome.jp／kegg／）、CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ctdbase.org／）、Cytoscape 3.5.1 軟件。

1.2 化學(xué)成分的獲得 以“穿山龍、穿龍薯蕷”為關(guān)鍵字，分別檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）和臺(tái)灣中醫(yī)藥資料（TCM Database＠taiwan），并參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，對(duì)穿山龍的化學(xué)成分信息進(jìn)行收集。將收集的化學(xué)成分逐一輸入至Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)，下載這些成分的分子結(jié)構(gòu)圖，以?.mol 的格式存儲(chǔ)。

1.3 類藥性分析 Lipinski 類藥性五規(guī)則是藥物分子設(shè)計(jì)和藥物篩選的常用規(guī)則之一，可以比較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)藥物中化合物的吸收或滲透性能，使藥物開發(fā)者能夠盡早準(zhǔn)確地篩選出有效藥物成分，降低藥物開發(fā)成本。將上述已獲得的化合物在Molinspiration 網(wǎng)站中預(yù)測(cè)其吸收性質(zhì)。之后依據(jù)LR［5］原則，對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)分析出的穿山龍化學(xué)成分進(jìn)行篩選：（1）相對(duì)分子量（MW）≤500；（2）氫鍵供體（與O 和N連接的氫原子數(shù)nOHNH）≤5；（3）氫鍵受體（O 和N 的數(shù)量，nON）≤10；（4）脂水分配系數(shù)（miLogP）≤4.15。滿足上述至少2 種條件的化合物為口服活性藥物。若數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物不符LR 原則但已有相關(guān)報(bào)道明確為穿山龍活性成分的化合物予以納入。

1.4 靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選 PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)采用“反向藥效團(tuán)匹配方法”，以活性小分子為探針、搜尋潛在藥物靶標(biāo)、進(jìn)而預(yù)測(cè)化合物生物活性［6］。因此，登陸Pharm-Mapper 數(shù)據(jù)庫(kù)上傳穿山龍活性成分的?.mol 格式文件，將“Maximum Generated Conformations”值設(shè)為300，“Select Targets Set”設(shè) 為 Human Protein Targets Only（v2010，2241），“Number of Reserved Matched Targets（Max 1，000）”設(shè)為300，收集排名前100 的靶點(diǎn)。由于檢索到的藥物靶點(diǎn)存在命名不規(guī)范等問(wèn)題，因此，本研究使用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中UniProtKB 搜索功能，通過(guò)輸入蛋白名稱并限定物種為人，將檢索得到的所有蛋白校正為其官方名稱，經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和轉(zhuǎn)化操作，獲取與活性成分相關(guān)的蛋白信息，去除重復(fù)靶點(diǎn)后，同時(shí)獲取這些靶點(diǎn)相應(yīng)的基因名稱。利用Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)以“Painful diabetic peripheral neuropathy”為關(guān)鍵詞，檢索已報(bào)道的與痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)的基因，與上述PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)返回的靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，作為穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的潛在作用靶點(diǎn)。

1.5 靶點(diǎn)通路注釋分析 通過(guò)DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)獲得的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路注釋分析，藥物靶點(diǎn)富集的信號(hào)通路被認(rèn)為是藥物作用的重要通路。在CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)上以“Painful diabetic peripheral neuropathy”“diabetic neuropathy”為關(guān)鍵詞檢索痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)信號(hào)通路，將得到的通路與上述通路進(jìn)行匹配分析，作為穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的潛在通路。

1.6 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 為了闡明靶點(diǎn)蛋白在系統(tǒng)水平上的作用，本研究將穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入String 10.5 數(shù)據(jù)庫(kù)中，限定物種為人，通過(guò)參數(shù)設(shè)置將評(píng)分條件設(shè)定為＞0.90，以保證信息的高置信度，獲取蛋白相互作用關(guān)系，結(jié)果保存成TSV格式，并將文件中的node1、node2 和combined score 信息導(dǎo)入到Cytoscape 軟件繪制相互作用網(wǎng)路，將節(jié)點(diǎn)大小和顏色設(shè)置用于反映Degree 的大小，邊的粗細(xì)設(shè)置用于反映Combine score 的大小，導(dǎo)出可視化圖形進(jìn)行研究分析。

1.7 構(gòu)建“活性成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖 將27 個(gè)活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)結(jié)果和通路分析，在Excel 表中分別構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”“靶點(diǎn)-通路”之間的相互關(guān)系，然后將其導(dǎo)入到Cytoscape3.5.1 軟件中建立“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。圖中以活性成分、靶點(diǎn)蛋白和通路為3類節(jié)點(diǎn)（node），它們之間有相互關(guān)系的分別用邊（edge）相連，節(jié)點(diǎn)的Degree 越大，則節(jié)點(diǎn)的大小越大，圖中三角形節(jié)點(diǎn)代表活性成分，圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，菱形節(jié)點(diǎn)代表信號(hào)通路，經(jīng)Cytoscape 3.5.1 軟件處理，得到穿山龍相關(guān)靶點(diǎn)通路預(yù)測(cè)圖。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析，探究其治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的活性成分篩選 通過(guò)Database＠taiwan 數(shù)據(jù)庫(kù)、TCMSP、Pubchem 和文獻(xiàn)檢索［7-8］的方式，收集到45 種化學(xué)成分，對(duì)其進(jìn)行類藥性分析，以進(jìn)一步獲得活性成分。此外，穿山龍中薯蕷皂苷、纖細(xì)皂苷雖不符合LR 原則，但已有研究［7］表明這兩種化合物為穿山龍中含有量較高的活性成分，故均予納入研究，因此共得到活性成分27 種。為方便后續(xù)研究，將它們分別編號(hào)為D1～D45，其中D1～D27 為穿山龍的潛在活性成分。詳見表1。

2.2 穿山龍的主要活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 通過(guò)Pharm-Mapper 服務(wù)器反向分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，預(yù)測(cè)出了27 種活性成分的作用靶點(diǎn)為316 個(gè)。通過(guò)與GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索到的靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，篩選出穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變靶點(diǎn)129 個(gè)。其中，化合物diosgenin acetate（D12）、diosgenin-3，6-dione（D23）、1，7-bis（4-hydroxyphenyl）hepta-4E，6E-dien-3（D25）對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)最多，達(dá)到57個(gè)，提示了化合物D12、D23、D25 可能是穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的潛在有效成分。

2.3 GO 生物過(guò)程分析 通過(guò)對(duì)穿山龍活性成分作用靶點(diǎn)GO 富 集 分 析，結(jié)果 表 明，在 生 物 學(xué) 過(guò) 程（biological process）方面（圖1），主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白水解、氧化還原、對(duì)缺氧的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化、MAPK 級(jí)聯(lián)等生物過(guò)程；在細(xì)胞組分（cellular component）方面（圖2），主要存在于細(xì)胞質(zhì)、核、質(zhì)膜、線粒體等細(xì)胞組分當(dāng)中；在分子功能（molecular function）方面（圖3），主要參與蛋白質(zhì)結(jié)合、鋅離子結(jié)合、蛋白激酶活性、類固醇激素受體活性等分子功能。

2.4 KEGG 代謝通路分析 將穿山龍129 個(gè)治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的靶點(diǎn)導(dǎo)入到DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行通路分析，取P＜0.05 的通路，通過(guò)KEGG、CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)挖掘等方式，對(duì)計(jì)算出的通路進(jìn)行綜合分析。結(jié)果共富集到90 條信號(hào)通路，其中與痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變密切相關(guān)的有33 條（表2），涉及PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、VEGF signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、PPAR signaling pathway 等信號(hào)通路。富集結(jié)果表明，大多數(shù)基因顯著富集到PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、VEGF signaling pathway 這3 條信號(hào)通路上，表明這些通路可能是穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的關(guān)鍵通路。

表1 45 個(gè)化合物信息

圖1 穿山龍主要活性成分的生物過(guò)程（BP）富集分析

圖2 穿山龍主要活性成分的細(xì)胞成分（CC）富集分析

圖3 穿山龍主要活性成分的分子功能（MF）富集分析

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 為了更好地理解穿山龍的作用機(jī)制，基于PPI 關(guān)系，利用String 10.5 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的靶點(diǎn)蛋白之間相互作用的關(guān)系，并導(dǎo)入到Cytoscape 3.5.1 軟件中繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖4。節(jié)點(diǎn)的大小和顏色表示Degree 值的大小，節(jié)點(diǎn)大小越大，顏色由橙色變藍(lán)色對(duì)應(yīng)的Degree 值越大；邊的粗細(xì)表示Combine score，邊越粗Combine score 值越大。PPI 網(wǎng)絡(luò)包含129 個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，290 條相互作用關(guān)系（連線），平均Degree 為4.8，其中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)蛋白，每條邊表示靶點(diǎn)蛋白之間的作用關(guān)系。根據(jù)節(jié)點(diǎn)的Degree 繪制出Degree 排名前15 的Hub 蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的條形圖（圖5）。包括原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基α（PIK3R1）、GTPase HRas（HRAS）、促分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、酪氨酸蛋白激酶JAK2（JAK2）、胰島素樣生長(zhǎng)因子I（IGF1）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等。穿山龍靶點(diǎn)蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖顯示，這些靶點(diǎn)是網(wǎng)絡(luò)的樞紐節(jié)點(diǎn)，是穿山龍抗痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的核心靶點(diǎn)。

表2 KEGG 代謝通路

圖4 穿山龍靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖5 各蛋白信息

2.6 穿山龍活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 3.5.1 軟件構(gòu)建穿山龍活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖。直觀地呈現(xiàn)了27 個(gè)活性成分、129 個(gè)靶蛋白、33 條作用通路和痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變疾病間的關(guān)聯(lián)（圖6）。由此可見，穿山龍主要活性成分的作用靶點(diǎn)分布于不同的通路，相互協(xié)調(diào)、共同調(diào)節(jié)藥物治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用機(jī)制。從穿山龍活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖中可知，穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用機(jī)制與代謝紊亂、血管損害、氧化應(yīng)激的損傷、炎癥反應(yīng)、自身免疫的損傷等多種發(fā)病學(xué)說(shuō)均有相關(guān)性，可從不同角度揭示穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用機(jī)制。

圖6 化合物-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

目前，痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究認(rèn)為痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制與代謝紊亂、血管損害、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、氧化應(yīng)激的損傷、炎癥反應(yīng)、自身免疫的損傷、遺傳因素、神經(jīng)元細(xì)胞膜離子通道功能障礙、蛋白激酶C（PKC）、致痛因子等因素相關(guān)。因此，痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療主要通過(guò)控制血糖、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、改善循環(huán)、改善代謝、抗氧化應(yīng)激、抗炎鎮(zhèn)痛等方式改善癥狀［9］。

穿山龍中的薯蕷皂苷元與薯蕷皂苷均為已報(bào)道的具有抗痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變作用的活性成分。本實(shí)驗(yàn)前期研究已表明［3］，中藥穿山龍?zhí)崛∥锸硎氃碥眨―2）可明顯減少糖尿病大鼠血清致痛物質(zhì)HA 和5-HT 的表達(dá)，療效強(qiáng)于強(qiáng)的松。已有研究［2］表明，薯蕷皂苷元（D1）可改善STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠氧化應(yīng)激和炎癥水平以及抗氧化能力，增加機(jī)械痛閾和熱痛閾值并降低疼痛。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，化合物D1、D2 連接的靶點(diǎn)分子數(shù)目較多分別是54、44，因此，這兩種活性成分是穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的關(guān)鍵成分。除此之外，未見其他化學(xué)成分有治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的報(bào)道。本研究對(duì)獲取的27 種具有相關(guān)生物活性的化學(xué)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)diosgenin acetate（D12）、diosgenin-3，6-dione（D23）、1，7-bis（4-hydroxyphenyl）hepta-4E，6E-dien-3（D25）等對(duì)應(yīng)的痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)靶點(diǎn)個(gè)數(shù)最多，說(shuō)明該成分可能是穿山龍發(fā)揮抗痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變作用的重要成分，為進(jìn)一步篩選其有效成分提供了理論依據(jù)。

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)顯示，排名前15 的Hub 蛋白包括SRC、PIK3R1、STAT1、MAPK1、JAK2、IGF-1、IL-2 等。據(jù)報(bào)道，Src 激酶可通過(guò)調(diào)節(jié)TRPV1 通道，從而緩解STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠機(jī)械性異常性疼痛［10］。Mauvais-Jarvis［11］研究發(fā)現(xiàn)，PI3-激酶在胰島素的代謝作用中起著核心作用，通過(guò)雜合破壞PIK3R1 基因可降低p85α，AS53 和p50α 的水平提高胰島素敏感性，降低空腹和餐后血糖水平，并顯著降低與遺傳性胰島素抵抗相關(guān)的糖尿病發(fā)病率；Chu 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）治療可逆轉(zhuǎn)糖尿病周圍神經(jīng)病變小鼠的痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象并改善其活動(dòng)能力，文獻(xiàn)證明這些基因大都涉及炎癥、氧化應(yīng)激和胰島素信號(hào)調(diào)節(jié)等環(huán)節(jié)，它們參與了痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變基本病理生理過(guò)程。

穿山龍的靶點(diǎn)GO 富集分析結(jié)果表明穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白水解、氧化還原、對(duì)缺氧的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化、MAPK 級(jí)聯(lián)等生物過(guò)程，涉及細(xì)胞質(zhì)、核、質(zhì)膜、線粒體等細(xì)胞組分，涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、鋅離子結(jié)合、蛋白激酶活性、類固醇激素受體活性等分子功能，是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。KEGG 通路分析顯示，穿山龍可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、PPAR 信號(hào)通路、TLRS 信號(hào)通路、JAK／STAT 信號(hào)通路等信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)調(diào)節(jié)血糖、抗氧化應(yīng)激、抗炎鎮(zhèn)痛從而發(fā)揮治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用。

PI3K-Akt 信號(hào)通路存在機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞中，對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生物過(guò)程起重要的調(diào)節(jié)作用。已有研究表明［13］，持續(xù)抑制PI3K／Akt 信號(hào)通路可緩解糖尿病神經(jīng)病理痛的癥狀并改善其神經(jīng)功能。此外，PI3K-Akt 信號(hào)傳導(dǎo)通路的阻滯是外周組織胰島素抵抗及2型糖尿病發(fā)生的最基本機(jī)制之一［14］。在KEGG 分析中，PI3K-Akt 信號(hào)通路是富集基因最多的信號(hào)通路，因此，推測(cè)穿山龍可通過(guò)抑制PI3K-Akt 信號(hào)通路，減輕疼痛癥狀的同時(shí)改善胰島素抵抗，這為痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療提供新方向，有望通過(guò)調(diào)控PI3K／Akt 信號(hào)通路來(lái)預(yù)防其發(fā)生。

MAPK 信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1／2（ERK1／2），c-Jun 氨 基（N）-末 端 激 酶 1／2／3（JNK1／2／3），p38MAPK 和ERK5 四條途徑［15］。MAPK 信號(hào)通路與腫瘤、炎癥、氧化應(yīng)激密切相關(guān)［16-17］。王超等［18］研究發(fā)現(xiàn)，通心絡(luò)膠囊能夠降低糖尿病周圍神經(jīng)病變小鼠氧化應(yīng)激損失，改善坐骨神經(jīng)中SOD、MDA、p-p38MAPK 的表達(dá)，同時(shí)能夠提高痛閾值和神經(jīng)傳導(dǎo)速度；Sweitzer 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，p38αMAPK 抑制劑SD-282 可改善STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的機(jī)械性異常性疼痛、熱痛覺(jué)過(guò)敏及福爾馬林誘導(dǎo)的炎性疼痛，因此，通過(guò)干預(yù)MAPK 信號(hào)通路對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變具有一定的保護(hù)作用。在KEGG 分析中，MAPK 信號(hào)通路是富集基因較多的信號(hào)通路，因此推測(cè)MAPK 通路可能是穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的關(guān)鍵通路。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是血管生成的主要介質(zhì)，VEGF 在糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。Di等［20］發(fā)現(xiàn)VEGF-B 可以減輕糖尿病小鼠感覺(jué)神經(jīng)元中過(guò)量分泌的ROS，提示VEGF-B 的神經(jīng)保護(hù)作用可能通過(guò)激活糖尿病感覺(jué)神經(jīng)元的抗氧化防御實(shí)現(xiàn)；Li 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，紅花提取物和乙酰谷酰胺（SA）注射液能減輕糖尿病周圍神經(jīng)病變引起的神經(jīng)損傷，其保護(hù)作用可能與促進(jìn)VEGFB，NGF 和GDNF 的表達(dá)有關(guān)。VEGF-B 不僅可以保護(hù)中樞神經(jīng)，還可以促進(jìn)周圍神經(jīng)的損傷修復(fù)。在KEGG 分析中，VEGF 信號(hào)通路是富集基因較多，因此，調(diào)節(jié)VEGF 信號(hào)通路可能是穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的關(guān)鍵通路之一。

Toll 樣受體（TLRs）是涉及先天免疫和病原體識(shí)別的天然免疫受體。TLR 通過(guò)募集銜接蛋白活化核因子-κB（NF-κB）、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、干擾素（IFN）調(diào)節(jié)因子，來(lái)激動(dòng)多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途經(jīng)，以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，趨化因子和干擾素在炎癥中的表達(dá)，在固有免疫系統(tǒng)中起著重要作用［22-23］。Yan 等［24］在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏糖尿病大鼠中發(fā)現(xiàn)TLR4 mRNA 表達(dá)上調(diào)，此外，TLR4 表達(dá)與機(jī)械刺激的爪壓撤回閾值和對(duì)熱刺激的爪縮回潛伏期有關(guān)。TLR4 信號(hào)通路的兩種下游促炎細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1β 的蛋白水平也顯著升高，并與糖尿病大鼠的機(jī)械／熱超敏反應(yīng)相關(guān)。最近有研究顯示［25］，薯蕷皂苷可通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4 ／MyD88 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥，對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷起保護(hù)作用。因此，筆者推測(cè)Toll 樣受體信號(hào)通路可能是穿山龍發(fā)揮抗炎作用一條通路。

JAK-STAT 信號(hào)通路是近年發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫和炎癥等許多重要的生物學(xué)過(guò)程［26］。最近有報(bào)道稱，JAK／STAT 通路失調(diào)導(dǎo)致肥胖和糖尿病的發(fā)生［27］。Ma 等［28］發(fā)現(xiàn)抗氧化劑如白藜蘆醇可通過(guò)抑制JAK／STAT 信號(hào)通路來(lái)抑制小鼠巨噬細(xì)胞中的炎癥通路；Liu 等［29］在STZ 誘導(dǎo)的糖尿病心肌纖維化大鼠中發(fā)現(xiàn)硫化氫（H2S）可改善糖尿病大鼠心肌纖維化，其機(jī)制可能與下調(diào)JAK ／STAT 信號(hào)通路有關(guān)，從而抑制氧化應(yīng)激和ER 應(yīng)激，炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。因此，JAK ／STAT 信號(hào)通路可能是穿山龍發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激的一條潛在通路。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是參與多種生理過(guò)程的配體激活轉(zhuǎn)錄因子，在諸如葡萄糖和脂質(zhì)代謝，能量平衡，細(xì)胞增殖，炎癥，免疫和腫瘤等方面均有著舉足輕重的作用。PPARs 由PPARα、PPARβ 和PPARγ 3 種亞型組成［30］，其中PPARγ 是PPAR 通路最為重要的靶點(diǎn)，PPARγ 具有抗炎和抗氧化應(yīng)激的作用［31］。目前，PPARs 激動(dòng)劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于糖尿病、脂質(zhì)紊亂、代謝綜合征等疾病的臨床治療。說(shuō)明了穿山龍可能通過(guò)作用于PPARγ 蛋白調(diào)控PPAR 通路來(lái)調(diào)節(jié)血糖、改善炎癥和氧化應(yīng)激。此外，KEGG 分析顯示穿山龍還可通過(guò)INSR、MAPK1 等靶點(diǎn)與胰島素信號(hào)通路、AMPK 信號(hào)通路來(lái)控制糖脂代謝的正常運(yùn)行。

痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變?cè)谥嗅t(yī)學(xué)中屬于“消渴痹癥”范疇，消渴日久，損傷氣陰，氣血運(yùn)行不暢致瘀血阻滯絡(luò)脈，絡(luò)脈淤閉，不通則痛，因此，“血瘀”和“絡(luò)損”是消渴痹癥的基本病機(jī)之一。中藥穿山龍具有活血通絡(luò)止痛之功效，對(duì)于“絡(luò)脈瘀阻”所致的該疾病具有良好療效。張?zhí)m教授［32］認(rèn)為除微血管和微循環(huán)之外，神經(jīng)組織在形態(tài)和功能上與中醫(yī)的“絡(luò)脈”也很類似，并將其歸屬“絡(luò)脈”范疇；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病主要受兩方面因素影響，即血液供應(yīng)受損的血管因素和神經(jīng)元或神經(jīng)纖維內(nèi)部因高血糖導(dǎo)致病理生理改變的代謝因素［33］，這與中醫(yī)“血瘀絡(luò)損”的病機(jī)觀有一定相似性。本研究根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，預(yù)測(cè)了穿山龍活血通絡(luò)止痛的治療機(jī)制可能通過(guò)調(diào)節(jié)血糖，改善氧化應(yīng)激水平，減輕神經(jīng)血管損傷，抑制炎癥反應(yīng)，從而緩解糖尿病神經(jīng)病理性疼痛。

綜上所說(shuō)，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，通過(guò)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、類藥性分析、GO 基因富集分析和KEGG 通路注釋分析技術(shù)構(gòu)建了穿山龍靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，從系統(tǒng)層面研究了穿山龍活性成分治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變多成分-多靶點(diǎn)-多信號(hào)通路的作用機(jī)制。從理論預(yù)測(cè)、整體分析角度，闡明了穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的潛在作用機(jī)制，為未來(lái)驗(yàn)證穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用機(jī)制提供了思路與線索。