仙茅鹽炙工藝的優(yōu)化

呂彤彤 ，鞠成國(guó)，2?，劉博男，賈天柱，2

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600）

仙茅為石蒜科植物仙茅Curculigo orchioidesGaertn.的干燥根莖［1］，始載于 《雷公炮炙論》，其性辛、溫，味苦，有毒，歸肝、腎經(jīng)［2］，具有補(bǔ)腎助陽(yáng)、益精血、強(qiáng)筋骨、行血消腫的功效?，F(xiàn)代植物化學(xué)研究表明，仙茅成分比較復(fù)雜，主要包括酚及酚苷類(lèi)、木脂素類(lèi)、皂苷元及皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、桉烷類(lèi)、脂肪族類(lèi)、生物堿類(lèi)、甜味蛋白、多糖類(lèi)、揮發(fā)油等［3-6］；現(xiàn)代藥理研究顯示，仙茅主要具有抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)免疫、補(bǔ)腎壯陽(yáng)、抗炎、抗憂郁、抗老年癡呆等作用［7-12］，臨床上多用于治療骨質(zhì)疏松癥、乳腺增生、絕經(jīng)后關(guān)節(jié)炎、更年期綜合征及陽(yáng)痿、再生障礙性貧血、原發(fā)性高血壓等疾?。恢嗅t(yī)臨床上常用其炮制品以增強(qiáng)補(bǔ)益作用，但2015 年版《中國(guó)藥典》還未收載酒仙茅、鹽仙茅等炮制品。

基于“入鹽走腎臟”傳統(tǒng)炮制理論，仙茅經(jīng)鹽炙后可引藥下行入腎，明顯增強(qiáng)其補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨的作用。另外，酚苷類(lèi)是仙茅補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中仙茅苷為苯甲酸酯酚苷類(lèi)，是其補(bǔ)肝腎的有效成分之一，更是藥典規(guī)定的指標(biāo)性成分；苔黑酚葡萄糖苷為苔黑酚類(lèi)酚苷，是仙茅強(qiáng)筋骨的有效成分之一，含有量最高［13-15］。目前對(duì)鹽炙仙茅的研究較少，本實(shí)驗(yàn)擬結(jié)合UPLC 法，以仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷含有量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對(duì)鹽炙工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為該藥材規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Waters H-Class UPLC 超高效液相色譜儀（包括四元高壓梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、Empower2 數(shù)據(jù)處理工作站，美國(guó)Waters 公司）；電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；FA1004B 型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DFT-100 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司）。

1.2 試藥 仙茅購(gòu)自康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定室翟延君教授鑒定為石蒜科植物仙茅Curculigo orchioidesGaertn.的干燥根莖。仙茅苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)MUST-15062710，含有量99.17%）；苔黑酚葡萄糖苷對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批 號(hào)MUST-14041601，含 有 量98.81%）。食 鹽（江蘇金橋鹽化集團(tuán)古淮制鹽有限公司，GB5461）；甲醇、磷酸、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽炙品制備 取適量?jī)粝擅┒?0 g 置適宜容器內(nèi)，加入鹽水（取0.4 g 鹽，以不同鹽水比例拌勻）悶潤(rùn)，待鹽水被吸盡后置炒制容器內(nèi)，不同溫度下不斷翻炒一段時(shí)間，取出，放涼，打粉，即得［16］。

2.2 仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷含有量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 ACQUITY UHPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～4 min，3%A；4～5 min，5% A；5～5.5 min，7% A；5.5～6 min，10% A；6～8 min，11% A；8～8.5 min，12% A；8.5～9.5 min，13%A；9.5～10 min，13%A；10～13 min，15% A；13～15 min，15% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；體積流量0.3 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量1 μL。理論板數(shù)按仙茅苷計(jì)算應(yīng)不低于3 000。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取仙茅苷對(duì)照品4.11 mg、苔黑酚葡萄糖苷對(duì)照品2.21 mg，置10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，稀釋得到0.102 75、0.110 5 mg／mL 對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 稱取不同條件下鹽炙品粉末（過(guò)3 號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，取出，放冷，稱定質(zhì)量，甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液20 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓浦?0 mL 量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 鹽水比例 取飲片6 份，每份20 g，加入鹽水（每100 kg 藥材用食鹽2 kg，比例1∶4、1∶5、1∶7、1：10、1∶15、1∶20）至密閉容器內(nèi)，悶潤(rùn)3 h 后，于140～150 ℃下炒制5 min 后出鍋，放涼，備用，結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知，不同鹽水比例下酚苷含有量有所差異，表明鹽水比例是影響仙茅酚苷含有量變化的主要因素；鹽水比例1∶7、1∶10、1∶15 時(shí)雖然含有量差異不足10%，在誤差允許范圍內(nèi)，但在實(shí)際操作過(guò)程中1∶7 和1∶10 存在鹽水與飲片無(wú)法完全拌勻的情況，所以結(jié)合實(shí)際，選擇1∶15 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.2 炒制溫度 取飲片6 份，每份20 g，加入鹽水（每100 kg 藥材用食鹽2 kg，比例1∶7）至密閉容器內(nèi)悶潤(rùn)3 h，分別在120～130、130～140、140～150、150～160、160～170、170～180 ℃下炒制5 min 后取出，晾涼，備用，結(jié)果見(jiàn)表2，采用120～130 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.3 炒制時(shí)間 取飲片5 份，每份20 g，加入鹽水（每100 kg 藥材用食鹽2 kg，比例1∶7）至密閉容器內(nèi)悶潤(rùn)3 h，在140～150 ℃下分別炒制3、4、5、6、7 min 后取出，放涼，備用，結(jié)果見(jiàn)表3，可知炒制時(shí)間為5 min 時(shí)，綜合評(píng)分最高，故選擇其進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表2 炒制溫度考察結(jié)果Tab.2 Results of frying temperature investigation

表3 炒制時(shí)間考察結(jié)果Tab.3 Results of frying time investigation

2.3.4 悶潤(rùn)時(shí)間 取飲片6 份，每份20 g，加入鹽水（每100 kg 藥材用食鹽2 kg，比例1∶7）至密閉容器內(nèi)分別悶潤(rùn)1、2、3、4、6、8 h，在140～150 ℃下分別炒制5 min 后取出，放涼，備用，結(jié)果見(jiàn)表4，可知悶潤(rùn)時(shí)間超過(guò)2 h 后酚苷含有量變化不大，表明悶潤(rùn)時(shí)間不是其主要因素。

表4 悶潤(rùn)時(shí)間考察結(jié)果Tab.4 Results of dull time investigation

2.4 正交試驗(yàn) 由上述單因素考察可以看出，影響鹽炙仙茅酚苷成分的主要因素有鹽水比例、炒制溫度、炒制時(shí)間。以仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷含有量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行優(yōu)化。因素水平見(jiàn)表5，結(jié)果見(jiàn)表6，方差分析見(jiàn)表7。

表5 因素水平Tab.5 Factors and levels

表6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.6 Design and results of tests

表7 方差分析Tab.7 Analysis of variance

結(jié)果表明，鹽水比例（A）和炒制時(shí)間（C）是影響仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷含有量的主要因素，各因素影響程度依次為炒制時(shí)間（C）＞鹽水比例（A）＞炒制溫度（B）。綜合分析，確定最佳工藝為A2B1C2，即每100 kg 仙茅飲片用2 kg 食鹽（食鹽∶水=1∶15），悶潤(rùn)2 h，在110～120 ℃下炒制5 min。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別取仙茅苷對(duì)照品0.010 3、0.030 8、0.051 4、0.102 8、0.154 1、0.205 5 μg，苔黑酚葡萄糖苷對(duì)照品0.022 5、0.045 0、0.067 5、0.090 0、0.112 5、0.135 0 μg，在“2.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得仙茅苷回歸方程為Y=2×106X-4 094.7（r=0.999 3），在0.010 3～0.205 5 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；苔黑酚葡萄糖苷回歸方程為Y=4×106X+4 556.5（r=0.999 4），在0.022 5～0.135 0 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密稱取鹽炙品1 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，每次1 μL，測(cè)得仙茅苷和苔黑酚葡萄糖苷峰面積RSD 分別為1.21% 和0.28%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取同一份供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)條件下于0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，每次1 μL，得仙茅苷和苔黑酚葡萄糖苷峰面積RSD 分別為0.76%和0.43%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批鹽炙品粉末6 份，每份1 g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)條件下各吸取1 μL 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得仙茅苷和苔黑酚葡萄糖苷含有量RSD 分別為1.6% 和0.97%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定仙茅苷和苔黑酚葡萄糖苷含有量已知的鹽炙品粉末6 份，每份0.1 g，分別加入2 種對(duì)照品粉末0.15 mg 和0.59 mg，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.8 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 取3 批生品（每批100 g），按優(yōu)化工藝制備3 份樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表9，可知仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷平均含有量分別為0.10%和0.490 2%，綜合評(píng)分99.2，表明工藝穩(wěn)定可靠，合理可行。

表9 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.9 Results of verification tests（n=3）

3 討論

為了更準(zhǔn)確地檢出酚苷類(lèi)成分，色譜柱考察了ACQUITY UHPLC BEH C18（2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）和Ultimate UHPLC AQ-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動(dòng)相考察了甲醇或乙腈與0.1%磷酸或甲酸的不同比例，檢測(cè)波長(zhǎng)考察了220、280 nm，最終確定為“2.2.1”項(xiàng)下條件。

酚苷類(lèi)是仙茅補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的物質(zhì)基礎(chǔ)［17］，故選用其中含有量較高的苔黑酚葡萄糖苷和藥典指標(biāo)成分仙茅苷作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并進(jìn)行加權(quán)求和（權(quán)重比例設(shè)為1∶1），優(yōu)化仙茅鹽炙工藝，具有一定的科學(xué)性與合理性。仙茅苷和苔黑酚葡萄糖苷作為仙茅酚苷類(lèi)主要成分，含有量測(cè)定方法有薄層層析-紫外分光光度法、高效液相色譜法、紫外分光光度法等，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC 法［18］，與HPLC法相比操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好。