不同生長年限、采收期、野生與栽培雷公藤指紋圖譜

江 靜，劉巖庭

（1.泰州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 泰州 225300；2.福建省食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350001）

雷公藤系衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.的根，福建武夷山區(qū)、大金湖地區(qū)的建寧、泰寧、光澤的去皮根原藥材為“雷公藤之鄉(xiāng)”的道地藥材［1］。臨床上它可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑性狼瘡、腎炎等，均獲得滿意療效［2-4］。

鑒于雷公藤的藥用價(jià)值和臨床上的廣泛應(yīng)用，其野生資源日益短缺，人工栽培已受到高度重視，泰寧縣雷公藤育苗與種植技術(shù)目前較為成熟，是全國最大的種植基地［5］。其主要有效成分有二萜類、三萜類和生物堿類［6-7］，同時(shí)也是毒性成分［8］，治療窗口窄，臨床不良反應(yīng)常見。近年來，雷公藤質(zhì)量控制研究主要體現(xiàn)在雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲、雷公藤總生物堿含有量測定［9-13］等，但其藥效發(fā)揮是多種活性成分共同作用的結(jié)果，因此，檢測某有效部位和單一活性成分均不能體現(xiàn)其整體療效和安全性。指紋圖譜可從整體上評價(jià)雷公藤質(zhì)量的穩(wěn)定性，但目前未見不同生長年限、采收期、野生與栽培藥材指紋圖譜比較的報(bào)道［14-18］。本研究采用高效液相色譜串聯(lián)二級質(zhì)譜（HPLC-MS／MS）法建立了15 批雷公藤藥材的指紋圖譜，對不同生長年限、采收期、野生與栽培雷公藤的質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)，以期為該資源開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 LC／MSD Trap 6320 液質(zhì)聯(lián)用儀，配有G1312B 二元泵、G1379B 在線脫氣機(jī)、G1367C 自 動(dòng) 進(jìn) 樣 器、G1316B 柱 溫 箱、G1315C 二極管陣列檢測器、ESI（電噴霧電離）離子源、LC Trap 5.2 和LC Solution 工作站（美國Agilent 公司）；Milli-QA 超純水機(jī)（美國Millipore公司）；S150 超聲波清洗器、RV10 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Elma 公司）；XS205 分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；DK-S26 電熱恒溫水浴鍋（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥 乙腈（色譜純）；甲醇、乙醇、石油醚（30～60 ℃）、乙酸乙酯均為分析純；水為超純水。雷公藤甲素對照品（批號(hào)111567-201404）購自中國食品藥品檢定研究院；雷公藤春堿、雷酚內(nèi)酯、雷公藤堿、雷公藤晉堿、雷公藤次堿對照品均為自制。

雷公藤采自福建三明泰寧和龍巖長汀，經(jīng)福建省食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院金鳴主任藥師鑒定為衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.的根木質(zhì)部，具體見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 取雷公藤甲素、雷公藤春堿、雷酚內(nèi)酯、雷公藤堿、雷公藤晉堿、雷公藤次堿對照品適量，甲醇制成每1 mL 各含0.1 mg 上述成分的溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備 藥材打成細(xì)粉，過3 號(hào)篩，精密稱定約1.0 g，準(zhǔn)確加入70%乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，80 ℃水浴回流2 h，放冷，70%乙醇補(bǔ)足缺失質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液10 mL，減壓濃縮至無醇味，加水10 mL、乙酸乙酯15 mL 萃取，再用30 mL乙酸乙酯分3 次萃取，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，殘?jiān)檬兔?乙酸乙酯（1∶4）2.5 mL溶解，過預(yù)先用5 mL 石油醚-乙酸乙酯（1∶4）預(yù)洗的Waters Sep-pak 中性氧化鋁固相萃取小柱，石油醚-乙酸乙酯（1∶4）10 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，2 mL 乙腈溶解，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.3 條件

2.3.1 色譜條件 ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫，程序見表2；體積流量0.3 mL／min；檢測波長220 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

2.3.2 質(zhì)譜條件 ESI 離子源，正離子掃描模式；霧化氣壓力2.7×105Pa；干燥氣體積流量10 L／min；干燥氣溫度350 ℃；毛細(xì)管電壓3.5 kV；掃描質(zhì)量范圍m／z100～1 000。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密稱定藥材（G9）約1.0 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定6 次，以雷公藤次堿（15 號(hào)峰）為參照峰，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD ＜0.10%，相對峰面積RSD＜2.7%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱定藥材（G9）約1.0 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、3、6、9、18、24 h 在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，以雷公藤次堿（15 號(hào)峰）為參照峰，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD ＜0.29%，相對峰面積RSD＜4.9%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定藥材（G9）約1.0 g，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備5 份供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，以雷公藤次堿（15 號(hào)峰）為參照峰，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD＜0.08%，相對峰面積RSD＜7.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 共有峰確定 按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，選定其中21 個(gè)色譜峰為共有指紋峰，建立指紋圖譜，見圖1～2。以雷公藤次堿（15 號(hào)）作為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，見表3。結(jié)果表明，15 批樣品中21 個(gè)共有峰相對保留時(shí)間RSD 為0.10%～0.49%，相對峰面積RSD 為28.8%～176%；G7 樣品中14 號(hào)峰（雷公藤晉堿）和20 號(hào)峰相對峰面積遠(yuǎn)大于其他峰，使得RSD 上限大于100%，表明各藥材成分組成相似，但含有量差異大。

圖1 15 批樣品指紋圖譜Fig.1 Fingerprints of fifteen batches of samples

圖2 雷公藤對照圖譜Fig.2 Reference chromatogram of T.wilfordii

2.5.2 色譜峰指認(rèn) 以對照品的保留時(shí)間、紫外光譜圖為依據(jù)，結(jié)合HPLC-MS／MS 共指認(rèn)出7 個(gè)化合物，見表4。

2.5.3 相似度分析 采用國家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A 版，對15 批樣品相似度進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)各樣品相對于對照圖譜的相似度在0.711～0.965，相似度低的G7 來源于秋季采集的栽培樣品，見表5。

表3 15 批樣品共有峰相對保留時(shí)間、相對峰面積Tab.3 Relative retention time and peak areas of common peaks of fifteen batches of samples

表4 已指認(rèn)化合物信息Tab.4 Information of identified compounds

表5 15 批樣品相似度Tab.5 Similarities of fifteen batches of samples

2.6 主成分分析 采用SPSS 22.0 軟件對15 批樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，計(jì)算主成分特征值、方差貢獻(xiàn)率，載荷矩陣及主成分綜合得分。

2.6.1 特征值、方差貢獻(xiàn)率 相關(guān)系數(shù)的特征值和方差貢獻(xiàn)率見表6，初始因子載荷矩陣見表7。以特征值＞1 為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到前6 個(gè)主成分的方差累計(jì)貢獻(xiàn)率為93.589% ＞85%，故選取前6 個(gè)主成分進(jìn)行評價(jià)，具有很好的代表性；第1 主成分的特征根為7.011，累計(jì)貢獻(xiàn)率為33.387%，雷公藤甲素、2、3、6、7、雷公藤春堿、雷公藤堿、雷公藤次堿、16、17、18、21 在第1 主成分上有較高載荷，表明第1 主成分主要反映了這12 個(gè)成分指標(biāo)的信息；第2 主成分特征根為5.242，累計(jì)貢獻(xiàn)率為58.349%，主要反映了5、9、12、19 這4 個(gè)成分指標(biāo)的信息。

表6 主成分初始特征值和貢獻(xiàn)率Tab.6 Initial eigenvalues and contribution rates of principal components

表7 初始因子載荷矩陣Tab.7 Component matrices

2.6.2 綜合得分 以6 個(gè)主成分對雷公藤藥材進(jìn)行綜合評價(jià)，計(jì)算主成分得分及綜合得分，見表8。結(jié)果表明，夏季栽培樣品排名較低，生長年限不同的藥材各成分含有量依次為3 年生＞2 年生＞1 年生，采收期不同的藥材依次為秋季＞春季＞夏季，可見藥材的質(zhì)量與來自野生或栽培無必然聯(lián)系。

2.7 聚類分析 基于SPSS 22.0 軟件，采用組間連接法，選取余弦作為度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類分析，見圖3。15 批雷公藤可聚為4 類，G1、G3、G11、G13、G15 為Ⅰ類，G2、G4～G6 為Ⅱ類，G8～G10、G12、G14 為Ⅲ類，G7 單獨(dú)為Ⅳ類，并且除G7 以外的其他樣品最終可歸為一大類。由此可見，夏季栽培藥材同屬一類，不同生長年限、采收期，野生與栽培藥材同屬一類，藥材所屬類別與生長年限、采收期、野生與栽培無明顯正相關(guān)，聚類分析結(jié)果與相似度、主成分分析一致。

圖3 15 批樣品聚類樹狀圖Fig.3 Dendrogram of fifteen batches of samples

3 討論

本研究考察了提取溶劑、萃取溶劑、前處理小柱、流動(dòng)相、檢測波長對各成分含有量和分離度的影響，發(fā)現(xiàn)70% 乙醇提取最為完全；乙酸乙酯萃取的峰面積比正丁醇、氯仿高；過中性氧化鋁小柱基線平穩(wěn)，色譜峰分離效果好；乙腈-水作流動(dòng)相時(shí)基線平穩(wěn)，分離較好；220 nm 波長處獲取的色譜峰信息多，分離效果好。綜合考慮，選用70%乙醇為提取溶劑，乙酸乙酯為萃取溶劑，過中性氧化鋁小柱除雜，以乙腈-水為流動(dòng)相，檢測波長220 nm，并采用HPLC-MS／MS 法定性鑒別了21 個(gè)共有峰中的6 個(gè)，建立了雷公藤指紋圖譜。

表8 主成分得分、綜合得分排序Tab.8 Ranks of principal component scores and comprehensive scores

不同生長年限、采收期，野生與栽培雷公藤成分組成相似，相同成分含有量差異大；相似度低的G7 來源于秋季采集的栽培樣品；提取出6 個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率93.589%；綜合得分表明夏季采收的藥材成分含有量低，3 年生和秋季藥材含有量高；聚類分析可知秋季采收的栽培樣品G7 單獨(dú)聚為一類，與相似度、主成分分析結(jié)果吻合，表明野生藥材質(zhì)量穩(wěn)定，同為秋季采收的栽培樣品質(zhì)量差異顯著。由于雷公藤常于秋季采收入藥，因此應(yīng)優(yōu)化藥材人工栽培技術(shù)，提高其質(zhì)量的均一性。本研究建立了雷公藤指紋圖譜，通過相似度評價(jià)結(jié)合主成分分析、聚類分析可更全面地評價(jià)藥材質(zhì)量，為其合理采收和資源開發(fā)提供參考，也有利于確保相關(guān)制劑的安全穩(wěn)定、有效可控。