基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討菊葉香藜精油藥理活性及作用機(jī)制

付蘇宏，張勇群，郝豆豆，張鵬飛，施 靜

（西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院 分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610000）

菊葉香藜Dysphania schraderiana屬藜科刺藜屬植物，廣泛生長于我國高海拔地區(qū)，如西藏、青海、內(nèi)蒙古等省份［1］。作為傳統(tǒng)蒙藥，菊葉香藜全草入藥，用于治療頭痛、感冒、金傷、麻疹不透、皮膚瘙癢［2］，富含精油而帶有強(qiáng)烈的刺鼻性氣味。大量研究表明，精油對人體有著重要的調(diào)節(jié)作用，因此，菊葉香藜精油也具有潛在的生物活性功能，近年來陸續(xù)報(bào)道了其生物活性研究。雷鳴等［3］發(fā)現(xiàn)菊葉香藜精油可濃度依賴地抑制昆蟲玉米象的活力；石夢菲等［1］發(fā)現(xiàn)菊葉香藜精油可抑制枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的生長；劉志龍等［4］發(fā)現(xiàn)菊葉香藜精油具有防治植物螨蟲的功效。此外，課題組前期利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對菊葉香藜精油的化學(xué)成分進(jìn)行了鑒定，總共鑒定出52 種化合物，主要為脂肪族類化合物（54.23%）和萜類化合物及其含氧衍生物（31.94%）［1］。有研究表明，α-杜松醇表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗螨蟲活性［5］；紫蘇醇可以通過作用于自由基治療腦瘤［6］；β-欖香烯可通過誘導(dǎo)凋亡抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖［7］。然而，菊葉香藜精油中的化學(xué)成分眾多且復(fù)雜，并呈“多成分、多靶點(diǎn)”相互協(xié)同作用，因此綜合分析菊葉香藜精油的藥理功能和作用機(jī)制顯得更為重要。

隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，各類“組學(xué)”技術(shù)相繼出現(xiàn)，海量數(shù)據(jù)的產(chǎn)生和計(jì)算方法的飛速發(fā)展標(biāo)志著人類已經(jīng)進(jìn)入一個全新的生物信息時(shí)代［8］。基于此，英國藥理學(xué)家Hopkins 于2007 年率先提出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念，通過各類組學(xué)技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)分析與可視化技術(shù)來揭示藥物、靶點(diǎn)、疾病之間錯綜復(fù)雜的關(guān)系，多層面地分析疾病的分子基礎(chǔ)、預(yù)測藥物的藥理學(xué)作用機(jī)制，彌補(bǔ)傳統(tǒng)藥理試驗(yàn)研究盲目、耗時(shí)長、費(fèi)用高、不系統(tǒng)等弊端［9］。目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已被廣泛用于構(gòu)建“藥物分子-靶標(biāo)-功能”網(wǎng)絡(luò)，高耀等［10］應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法揭示了逍遙散與開心散“同病異治”抑郁癥的作用機(jī)制；任瑩璐等［11］采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建了芪參顆粒治療心血管疾病的“成分-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)”，這些研究充分證明對于化學(xué)成分組成復(fù)雜多樣的傳統(tǒng)方劑來說，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是揭示其藥理作用機(jī)制的有效方法。因此，本研究將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路與方法，構(gòu)建菊葉香藜精油“化學(xué)成分-靶標(biāo)-功能”網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測其作用機(jī)制，為今后相關(guān)藥理功效研究與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菊葉香藜精油化學(xué)組成鑒定 菊葉香藜精油化學(xué)成分通過GC-MS 測定，共鑒定得到52 個化合物［1］。表1 列舉了精油化學(xué)成分的中文名，以及在PubChem 數(shù)據(jù)中的編號。

表1 菊葉香藜精油化學(xué)組成Tab.1 Chemical compositions of essential oil in Dysphania schraderiana

1.2 菊葉香藜精油化學(xué)成分靶點(diǎn)預(yù)測 BATMANTCM 數(shù)據(jù)庫可對化合物與靶點(diǎn)蛋白的相關(guān)性進(jìn)行評分，利用在線數(shù)據(jù)庫BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org／batman-tcm／）對菊葉香藜精油中的化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行預(yù)測［12］，通過參數(shù)設(shè)置可篩選得到可信度較高的蛋白靶點(diǎn)。分別輸入51 個化合物的PubChem 編號進(jìn)行檢索（其中1 個未查詢到相應(yīng)的PubChem 編號），設(shè)置靶點(diǎn)的打分閾值為55，AdjustedP值為0.05，獲取每一個化合物所對應(yīng)的作用靶點(diǎn)。

1.3 靶點(diǎn)蛋白的生物功能分析 生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov／）提供一套綜合的功能注釋工具，可幫助研究者理解基因或蛋白背后的生物學(xué)意義［13］。將上述篩選得到的靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體（GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，篩選P＜0.05 的GO 條目和KEGG 通路。

1.4 “化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫對作用靶點(diǎn)進(jìn)行TTD（Therapeutic Target Database，TTD）疾病分類，獲取疾病富集信息。篩選顯著性前20 的TTD 疾病分類，整理其對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白信息以及靶點(diǎn)蛋白對應(yīng)化學(xué)成分信息，利用Cytoscape 3.6.1 本地軟件［14］構(gòu)建“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，并對網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點(diǎn)大小、形狀以及顏色進(jìn)行設(shè)置，獲取最終美化的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 菊葉香藜精油作用靶點(diǎn) 運(yùn)用在線數(shù)據(jù)庫BATMAN-TCM 對菊葉香藜精油的化學(xué)成分逐一進(jìn)行檢索，篩選出分值＞55 的靶點(diǎn)蛋白。52 個化合物中有1 個未檢索到相應(yīng)的PubChem 編號（1-羰基-2-異丙基-5-甲基-3-環(huán)己烯，相對含有量1.946%），未在BATMAN-TCM 平臺上進(jìn)行檢索；有3 個化合物在BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫中未檢索到相應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白［t-杜松醇、α-蓽澄茄油烯和4（14），5-依蘭油烯，相對含有量分別為6.779%、0.561%、0.115%］；有9 個化合物沒有相應(yīng)的分值＞55 的靶點(diǎn)蛋白［蘭桉醇、喇叭茶醇、δ-綠花白千層醇、石竹素、2-（4-甲基苯基）丙-2-醇、α，α，γ-三甲基-苯丙醇、（Z）-3，7-二甲基-2，6-亞辛基-1-醇丙酸酯、3-甲基-2-丁烯酸乙酯、反式辣薄荷醇相對含有量分別為2.587%、1.582%、1.139%、0.484%、0.216%、0.186%、0.121%、0.074%、0.116%］。去除所有不符合條件的化學(xué)成分后，總共有39 種成分及其靶點(diǎn)蛋白展示于圖1 中，其中1，1，3-三甲基茚具有最多的潛在作用靶點(diǎn)（57 個），此外共有17 個化合物的潛在作用靶點(diǎn)為31 個，包括δ-杜松萜烯、長葉烯、（-）-γ-杜松萜烯、β-欖香烯、γ-欖香烯、反式石竹烯、甘香烯、α-律草烯、α-杜松萜烯、大牛兒烯D、4-蒈烯、β-廣藿香烯、α-蒎烯、β-順式-金合歡烯、檸檬烯、α-水芹烯、3-異丙基-6-亞甲基-1-環(huán)己烯。

圖1 菊葉香藜精油化學(xué)組成與潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Network of chemical compositions and potential targets of essential oil in Dysphania schraderiana

2.2 GO 功能和KEGG 通路富集分析 利用DAVID 6.8 對上述得到的126 個靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO功能與KEGG 通路富集分析。GO 功能分析方面，分子功能分類中較顯著的主要是延遲整流鉀通道活性、腎上腺素結(jié)合、去甲腎上腺素結(jié)合；細(xì)胞組分分類中較顯著的主要是電壓門控鉀通道復(fù)合體、質(zhì)膜整體組分、鈉離子通道復(fù)合物；生物過程分類中較顯著的主要是腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素受體信號通路、蛋白質(zhì)同源寡聚、細(xì)胞-細(xì)胞信號（圖2）；KEGG 通路富集方面，顯著性靠前的通路主要有神經(jīng)活性配體-受體交互作用、視黃醇代謝、鈣信號通路、cGMP-PKG 信號通路、酪氨酸代謝（圖3）。

2.3 “化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析 根據(jù)治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（TTD）對菊葉香藜精油的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫疾病分類，顯著性前20 的如表3所示，主要?dú)w屬為心血管系統(tǒng)疾病、疼痛、神經(jīng)精神類疾病。心血管系統(tǒng)疾病主要有高血壓、心律失常、系統(tǒng)性動脈血管舒張、心力衰竭、局部缺血性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化；疼痛疾病主要有疼痛、急性輸尿管的絞痛、偏頭痛；神經(jīng)精神類疾病主要涉及刺激、精神分裂癥、焦慮癥、抑郁癥、可卡因成癮。

圖2 菊葉香藜精油潛在作用靶點(diǎn)GO 功能分析Fig.2 GO functional analysis of potential targets for essential oil in Dysphania schraderiana

圖3 菊葉香藜精油潛在作用靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析Fig.3 Enriched KEGG pathways of potential targets for essential oil in Dysphania schraderiana

表3 菊葉香藜精油潛在作用靶點(diǎn)治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫疾病分類Tab.3 Enriched therapeutic target database diseases of potential targets for essential oil in Dysphania schraderiana

分別構(gòu)建心血管系統(tǒng)疾病、疼痛和神經(jīng)精神類疾病的“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。如圖4A 所示，1，1，3-三甲基茚通過作用于組胺H1 受體（HRH1）、組胺H2 受體（HRH2）、β3腎上 腺 素 受 體（ADRB3）、β2 腎 上 腺 素 受 體（ADRB2）、α-2B 腎上腺素受體（ADRA2B）與系統(tǒng)性動脈血管舒張、心律失常、高血壓、心力衰竭相關(guān)聯(lián)；共18 種精油成分可作用于電壓門控鉀離子通道KQT 樣亞家族成員1（KCNQ1）和鳥苷酸環(huán)化酶1β3（GUCY1B3），分別與心律失常和心力衰竭相關(guān)聯(lián)，18 種精油成分為γ-欖香烯、3-異丙基-6-亞甲基-1-環(huán)己烯、大牛兒烯D、檸檬烯、δ-杜松萜烯、β-順式-金合歡烯、α-水芹烯、β-廣藿香烯、α-律草烯、α-蒎烯、（-）-γ-杜松萜烯、長葉烯、α-杜松萜烯、反式石竹烯、甘香烯、β-欖香烯、4-蒈烯、3-異丙基-6-亞甲基-1-環(huán)己烯）；P-傘花烴可通過作用于凝固因子Ⅱ（F2）與冠狀動脈粥樣硬化相關(guān)聯(lián)，此外，有15 個精油成分可作用于雌激素受體1（ESR1）與冠狀動脈粥樣硬化相關(guān)聯(lián)（反式-對-薄荷-2-烯-1-醇、斯巴醇、香榧醇、α-杜松醇、芳樟醇、1-羥基-1，7-二甲基-4-異丙基-2，7-環(huán)癸二烯、α-松油醇、八氫四甲基萘甲醇、三環(huán) ［4.4.0.02，7］癸-8-烯-3-甲醇，α，α，6，8-四甲基-，立體異構(gòu)體、蓽澄茄油烯醇、α-桉葉油醇、胡蘿卜醇、順式-對-薄荷-2-烯-1-醇、四甲基環(huán)癸二烯甲醇、反式-薄荷醇）。在圖4B 中，1，1，3-三甲基茚可作用于多個蛋白，包括5-羥色胺受體7（HTR7）、5-羥色胺受體2 A（HTR2A）、5-羥色胺受體2C（HTR2C）、煙堿型膽堿能受體α7（CHRNA7）、電 壓 門 控 鈉 離 子 通 道1α 亞 基（SCN1A）、非 電 壓 門 控 鈉 離 子 通 道1α 亞 基（SCNN1A）、腺苷激酶（ADK），與偏頭痛、急性輸尿管的絞痛、疼痛和止痛劑相關(guān)聯(lián)；此外，有18 個化合物可作用于電壓門控鉀離子通道亞族D成員3（KCND3）和Discs 大同源物4（DLG4）與疼痛和止痛劑相關(guān)聯(lián)［γ-欖香烯、3-異丙基-6-亞甲基-1-環(huán)己烯、大牛兒烯D、檸檬烯、δ-杜松萜烯、β-順式-金合歡烯、α-水芹烯、β-廣藿香烯、α-律草 烯、α-蒎烯、（-）-γ-杜松萜烯、長葉烯、α-杜松萜烯、反式石竹烯、甘香烯、β-欖香烯、4-蒈烯、3-異丙基-6-亞甲基-1-環(huán)己烯］。相較于前2 類疾病，與神經(jīng)精神類疾病相關(guān)的化學(xué)成分較少，檸檬醛作用于丁酰膽堿酯酶（BCHE）與精神分裂癥相關(guān)聯(lián)，桉樹腦作用于瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族M 成員8（TRPM8）和瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族A 成員1（TRPA1）與刺激相關(guān)聯(lián)，1，1，3-三甲基茚通過作用于多個蛋白與焦慮癥、抑郁癥可卡因成癮、精神分裂癥和刺激相關(guān)聯(lián)。

圖4 “化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Network of“chemical components-targets-diseases”

3 討論

傳統(tǒng)中藥、民族藥是開發(fā)現(xiàn)代新藥的重要資源庫，然而中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多層次的特點(diǎn)，作用機(jī)制廣泛，不易明確，大大限制了其在臨床上的應(yīng)用。目前，中藥研究的主要方法是對有效成分進(jìn)行分離純化，逐一對每個單體進(jìn)行活性篩選，再作進(jìn)一步的新藥開發(fā)，這一方法雖然獲得了些許成效，但耗時(shí)耗力，花費(fèi)高，回報(bào)小，并且不符合中藥“辨證論治”的理念［11］。隨著“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”概念的提出，將其與中藥研究結(jié)合是目前的研究熱點(diǎn)之一［15］，基于多種數(shù)據(jù)平臺充分利用化學(xué)成分、疾病靶點(diǎn)已有的研究成果，系統(tǒng)地對中藥組分的作用靶標(biāo)、協(xié)同作用進(jìn)行研究，實(shí)現(xiàn)中藥新藥的開發(fā)。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對菊葉香藜精油的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行挖掘，并推測其藥理作用機(jī)制，預(yù)測其可治療的疾病。結(jié)果表明，菊葉香藜精油中總共40 種化學(xué)成分在BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫中有其對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，總共得到126 個潛在的作用靶點(diǎn)；功能富集分析顯示，總共分類到112 個GO條目，其中較顯著的有電壓門控鉀通道復(fù)合體、延遲整流鉀通道活性、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素受體信號通路等；總共注釋到25 條KEGG 通路，其中較顯著的有神經(jīng)活性配體-受體交互作用、視黃醇代謝、鈣信號通路、cGMP-PKG 信號通路、酪氨酸代謝等；富集的TTD 疾病類型共59 類，較顯著的TTD 疾病主要與心血管疾病、疼痛、神經(jīng)精神疾病相關(guān)。

在KEGG 通路注釋中，cGMP-PKG 信號通路、醛固酮調(diào)節(jié)的鈉重吸收通路、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號傳導(dǎo)通路、腎素分泌通路、AMPK 信號通路均涉及機(jī)體的心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)［16-20］，提示這些通路可能是菊葉香藜精油治療心血管疾病的作用機(jī)制。此外，菊葉香藜精油的潛在靶點(diǎn)蛋白還富集到神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、鈣信號途徑、血清素激活的神經(jīng)突觸通路，均與神經(jīng)精神類疾病相關(guān)，其中血清素激活系統(tǒng)參與大腦多個區(qū)域的神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)，血清素失調(diào)是目前公認(rèn)的導(dǎo)致抑郁癥的主要因素［21］；Ca2+在突觸的聯(lián)系調(diào)節(jié)中扮演著重要的角色，中樞神經(jīng)的Ca2+失調(diào)在多種神經(jīng)精神類疾病如阿爾茨海默癥、雙相感情障礙、精神分裂癥中發(fā)揮著重要的作用［22］，也有研究報(bào)道調(diào)節(jié)神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路可改善帕金森癥［23］；炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)的TRP 通道、鈣信號途徑均參與機(jī)體疼痛信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，這可能也是菊葉香藜精油緩解疼痛的主要機(jī)制［24-25］。

在“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)中，有18 種精油成分可作用于電壓門控鉀離子通道KQT 樣亞家族成員1（KCNQ1）、鳥苷酸環(huán)化酶 1β3（GUCY1B3）、電壓門控鉀離子通道亞族D 成員3（KCND3）和Discs 大同源物4（DLG4），它們分別與心律失常、心力衰竭、疼痛和止痛劑相關(guān)；此外，共有15 種精油成分可作用于雌激素受體1（ESR1），與冠狀動脈粥樣硬化相關(guān)聯(lián)。電壓門控鉀離子通道KQT 樣亞家族成員1 與一些心臟功能紊亂有關(guān)，包括長QT 綜合征（LQTS）、先天性心房顫動和短QT 綜合征等，是心律失常的重要靶點(diǎn)［26］；鳥苷酸環(huán)化酶1β3 可通過合成信號分子cGMP 來調(diào)控對一氧化氮的反應(yīng)，而一氧化氮是一種很強(qiáng)的舒張血管物質(zhì)，在心血管功能的調(diào)節(jié)中起到重要作用；電壓門控鉀離子通道亞族D 成員3存在于神經(jīng)元中，與神經(jīng)興奮相關(guān)［27］，可能與痛覺傳導(dǎo)有關(guān)；Discs 大同源物4 是突觸膜關(guān)聯(lián)鳥苷酸激酶蛋白家族中的一員，與神經(jīng)突觸下游信號傳導(dǎo)途徑的受體調(diào)控、組織和定位密切相關(guān)［28］，可能是痛覺傳導(dǎo)過程中重要的一環(huán)；雌激素受體1 可介導(dǎo)雌激素調(diào)節(jié)的脂肪細(xì)胞分化、脂解作用和抑制脂質(zhì)合成［29］，而脂質(zhì)代謝障礙為動脈粥樣硬化的病變基礎(chǔ)。在精油成分中，1，1，3-三甲基茚可與多個靶點(diǎn)相互作用，與心血管疾病、疼痛、神經(jīng)精神疾病均相關(guān)，可見該化合物可能具有協(xié)同調(diào)節(jié)的作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對菊葉香藜精油進(jìn)行藥理活性及其作用機(jī)制研究，在現(xiàn)有化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)研究成果的基礎(chǔ)上進(jìn)行潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測，具有較高的準(zhǔn)確性。根據(jù)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行菊葉香藜精油的生物功能分析發(fā)現(xiàn)，多條KEGG通路和疾病富集分析均顯示菊葉香藜精油具有潛在的治療心血管疾病、神經(jīng)精神疾病、疼痛的功效，但還需進(jìn)一步藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究揭示了菊葉香藜精油多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)，為今后進(jìn)一步相關(guān)藥理活性及其作用機(jī)制的考察奠定了基礎(chǔ)。