健脾清化方對AngⅡ刺激下大鼠系膜細(xì)胞NADPH／p38MAPK 氧化應(yīng)激通路的影響

鄒 赟，何立群?

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腎病科，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腎病研究所，上海 201203；3.上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203）

健脾清化方是由何立群教授根據(jù)李東垣脾胃學(xué)說中“火與元?dú)獠粌闪?，一勝則一負(fù)，脾胃氣虛則下流于腎，陰火得以乘土位”的主要學(xué)術(shù)理論所制，其補(bǔ)虛之外清熱燥濕之功尤著，切中慢性腎衰與濕熱密不可分的密切關(guān)系，在長期的臨床應(yīng)用中已被證明具有顯著改善腎功能的作用［1］。在前期的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，健脾清化方干預(yù)可顯著下調(diào)了AT1／NADPH／p38MAPK 氧化應(yīng)激通路的活化狀態(tài)，從而有效減少了炎癥因子的分泌，為其顯著的臨床療效提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)［2］。本研究從體外實(shí)驗(yàn)的角度培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞（MCs），觀察其在AngⅡ的刺激下NADPH／p38MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，活性氧標(biāo)志物MDA、SOD 的表達(dá)，以及健脾清化方的干預(yù)作用，旨在進(jìn)一步從細(xì)胞水平驗(yàn)證該方改善慢性腎衰大鼠氧化應(yīng)激可能的作用途徑。

1 材料

1.1 動物、細(xì)胞株 正常大鼠腎臟系膜細(xì)胞株（HBZY-1）購自上海復(fù)盟基因生物科技有限公司。健康成年雄性SD 大鼠（SPF 級），8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)有限公司提供［SCXX（滬）2013-0016］，共12 只，分籠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，25 ℃、12 h 光照、45%相對濕度的環(huán)境中，自由飲水，喂以標(biāo)準(zhǔn)普通飼料。

1.2 試藥 氯沙坦鉀片，100 mg／片（杭州默沙東制藥有限公司，批號100395）。胎牛血清（FBS）、MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；AngII、胰蛋白酶（美國Sigma 公司）；Trizol 法總RNA 抽提試劑盒、cDNA 第一條鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR real-time 試劑盒（瑞士Roche 公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（中國南京建成生物工程研究所）；p-p38MAPK 多克隆抗體（美國CST 公司）；β-actin、二抗羊抗兔IgG（美國Santa Cruse）；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國密理博公司）；乙二胺四乙酸EDTA（法國Biowest 公司）。

2 方法

2.1 健脾清化方水煎劑制備 組方藥材黨參15 g、生黃芪15 g、草果仁6 g、蒼術(shù)10 g、黃連3 g、制大黃9 g，共計(jì)58 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所提供，水煎濃縮為生藥量0.58 g／mL。

2.2 含藥血清的制備 12 只SD 大鼠隨機(jī)分為正常組、健脾清化方組、氯沙坦組，每組4 只，氯沙坦鉀片研成細(xì)粉，用生理鹽水配成1 mg／mL 的混懸液。健脾清化方組按5.8 g／kg 灌胃，氯沙坦組按10 mg／kg 灌胃，用藥劑量按人體（70 kg 體質(zhì)量）每公斤體質(zhì)量用藥量6 倍進(jìn)行換算，1 次／d，共3 d；正常組同體積生理鹽水灌胃。末次給藥后2 h 腹主動脈取血，冷凍離心機(jī)3 000 r／mim 離心10 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝，放入-80 ℃低溫冰箱凍存。

2.3 細(xì)胞分組及給藥 大鼠腎小球系膜細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為溫度37 ℃，飽和濕度5% CO2，每2～3 d 用含0.05% EDTA 的胰酶消化傳代，傳代后第3～5代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。取對數(shù)生長期的系膜細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，接種于6 孔無菌培養(yǎng)板，置于5% CO2、37 ℃飽和濕度下培養(yǎng)，待系膜細(xì)胞生長至80%融合，改用無血清培養(yǎng)液靜置孵育24 h使細(xì)胞生長同步。細(xì)胞分組為①10%大鼠正常血清組，給予10%正常大鼠血清；②10%健脾清化方含藥血清組，給予10%健脾清化方含藥血清；③10%氯沙坦含藥血清組，給予10% 氯沙坦含藥血清；④10% 正常大鼠血清+Ang Ⅱ組，同時給予100 nmol／L AngⅡ和10%正常大鼠血清；⑤10%健脾清化方含藥血清+AngⅡ組，同時給予100 nmol／L AngⅡ和10%健脾清化方含藥血清；⑥10%氯沙坦含藥血清+Ang Ⅱ組，同 時 給 予100 nmol／L Ang Ⅱ和10%氯沙坦含藥血清，培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基上清，用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞1～2 次，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，冰水浴超聲裂解以充分破壞細(xì)胞，使其釋放出細(xì)胞內(nèi)成分，超聲結(jié)束后離心收集上清，-70 ℃低溫冰箱中保存。

2.4 檢測不同時間點(diǎn)Ang Ⅱ刺激下系膜細(xì)胞p47phoxmRNA 表達(dá) 將系膜細(xì)胞傳到培養(yǎng)板中，加入100 nmol／L Ang Ⅱ，分別處理不同時間（30 min、4 h、8 h、12 h、24 h）后收取細(xì)胞，Trizol 法提取大鼠腎小球系膜細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用RT-PCR 法檢測系膜細(xì)胞在AngⅡ刺激下不同時間點(diǎn)p47phoxmRNA 表達(dá)，并在保證實(shí)驗(yàn)效果和穩(wěn)定性的前提下，以表達(dá)量最高峰時對應(yīng)的時間點(diǎn)作為后續(xù)各項(xiàng)指標(biāo)的檢測時間點(diǎn)。p47phoxmRNA 基因引物序列見表1。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃10 min，然后95 ℃15 s，60 ℃1 min，共40 個循環(huán)，計(jì)算p47phox和β-actin的Ct值（基因擴(kuò)增到超過熒光最低檢測水平的循環(huán)數(shù)），cDNA 的擴(kuò)增倍數(shù)用β-actin作為校正基因，mRNA 表達(dá)的相對水平使用livak 法計(jì)算。每個樣品做3 個復(fù)孔，取平均值。

2.5 檢測各組含藥血清對系膜細(xì)胞p47phoxmRNA表達(dá)的影響 采用RT-PCR 法。按“2.3”項(xiàng)下方法處理各組細(xì)胞，檢測各組系膜細(xì)胞p47phoxmRNA 表達(dá)。每組均設(shè)3 個樣品，每個樣品測定2 次。

2.6 檢測各組含藥血清對系膜細(xì)胞MDA、SOD 水平的影響 采用化學(xué)發(fā)光法。按“2.3”項(xiàng)下方法處理各組細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書步驟操作，計(jì)算MDA、SOD 水平。每組均設(shè)3 個樣品，每個樣品測定2 次。

2.7 檢測各組含藥血清對系膜細(xì)胞p-p38MAPK 水平的影響 采用Western blot 法。按“2.3”項(xiàng)下方法處理各組細(xì)胞，BCA 蛋白定量法測定各組蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)8% SDS-PAGE 電泳分離蛋白質(zhì)，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后，TBS-T 洗膜3 次，5 min／次，然后加入一抗4 ℃孵育過夜，次日TBS-T 洗膜洗3次，5 min／次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBS-T 洗膜后加入化學(xué)發(fā)光試劑曝光，用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描分析條帶的面積和灰度，蛋白區(qū)帶用積分灰度值表達(dá)，以β-actin 作為對照。每組均設(shè)3 個樣品，每個樣品測定2 次。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 15.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 AngⅡ刺激下系膜細(xì)胞不同時間點(diǎn)p47phoxmRNA 表達(dá) 100 nmol／L Ang Ⅱ分別于0 min、30 min、4 h、8 h、12 h、24 h 處理系膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)p47phoxmRNA 表達(dá)呈時間依賴性升高，0 min時最低（1.00±0.17），24 h 時最高（4.75±0.40）。

3.2 各組含藥血清對系膜細(xì)胞p47phoxmRNA 表達(dá)的影響 如表2 所示，與10%正常大鼠血清組比較，10%正常大鼠血清+AngⅡ組p47phoxmRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與10% 正常大鼠血清+AngⅡ組比較，10%健脾清化方+AngⅡ組、10%氯沙坦+Ang Ⅱ組明顯降低了p47phoxmRNA 表達(dá)（P＜0.01）。

3.3 各組含藥血清對系膜細(xì)胞MDA、SOD 水平的影響 如表3 所示，與10%大鼠正常血清組比較，10%大鼠正常血清+AngⅡ組SOD 水平顯著降低，MDA 水平顯著升高（P＜0.01）；與10%大鼠正常血清+AngⅡ組比較，10% 健脾清化方+AngⅡ組、10%氯沙坦+AngⅡ組能明顯上調(diào)SOD 水平，下調(diào)MDA 水平（P＜0.01）。

表2 各組含藥血清對系膜細(xì)胞p47phox mRNA 表達(dá)的影響（±s， n=3）Tab.2 Effects of medicated serum on MCs p47phox mRNA expression of each group（±s， n=3）

表2 各組含藥血清對系膜細(xì)胞p47phox mRNA 表達(dá)的影響（±s， n=3）Tab.2 Effects of medicated serum on MCs p47phox mRNA expression of each group（±s， n=3）

注：與10%大鼠正常血清組比較，??P＜0.01；與10%大鼠正常血清+AngⅡ組比較，＃＃P＜0.01

表3 各組含藥血清對系膜細(xì)胞MDA、SOD 水平的影響（±s， n=3）Tab.3 Effects of medicated serum on MCs MDA，SOD levels of each group（±s， n=3）

表3 各組含藥血清對系膜細(xì)胞MDA、SOD 水平的影響（±s， n=3）Tab.3 Effects of medicated serum on MCs MDA，SOD levels of each group（±s， n=3）

注：與10%大鼠正常血清組比較，??P＜0.01；與10%大鼠正常血清+AngⅡ組比較，＃＃P＜0.01

3.4 各組含藥血清對系膜細(xì)胞p-p38MAPK 蛋白表達(dá)的影響 如圖1、表4 所示，與10%大鼠正常血清組比較，10% 大鼠正常血清+Ang Ⅱ組p-P38MAPK 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與10%大鼠正常血清+AngⅡ組比較，10% 健脾清化方+AngⅡ組、10% 氯沙坦+AngⅡ組p-P38MAPK 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。

圖1 各組含藥血清對p-p38MAPK 蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of medicated serum on p-p38MAPK protein expression of each group

表4 各組含藥血清對p-p38MAPK 蛋白表達(dá)的影響（±s， n=3）Tab.4 Effects of medicated serum on p-p38MAPK protein expression of each group（±s， n=3）

注：與10%大鼠正常血清組比較，??P＜0.01；與10%大鼠正常血清+AngⅡ組比較，＃＃P＜0.01

4 討論

腎小球系膜細(xì)胞（MCs）是腎小球中最具有活性的固有細(xì)胞［3］，體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明其增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的增加幾乎是所有呈慢性進(jìn)行性發(fā)展的腎臟疾病一個最主要的組織學(xué)特征［4-5］。因此，這部分體外實(shí)驗(yàn)選取系膜細(xì)胞為研究對象，模擬慢性腎衰的共同病變過程-腎纖維化的病理變化過程進(jìn)行研究。

AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的主要活性肽產(chǎn)物［6］，有研究發(fā)現(xiàn)，它還與腎小球系膜細(xì)胞增殖肥大以及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)，而這些均是導(dǎo)致腎小球硬化的關(guān)鍵因素［7］，眾多實(shí)驗(yàn)顯示其機(jī)制可能與促炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)［8］。Lv 等［9］報(bào)道，AngⅡ介導(dǎo)了系膜細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，而AT1R 拮抗劑坎地沙坦可抑制這個過程，具有抗凋亡和抗氧化作用。作為NADH／NADPH 氧化酶重要的刺激因子［10］，AngⅡ可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞等產(chǎn)生過多的ROS，啟動氧化應(yīng)激反應(yīng)［11］。

體外實(shí)驗(yàn)顯示，AngⅡ刺激后腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)NADPH 氧化酶亞基p47phoxmRNA 的表達(dá)與刺激時間呈正相關(guān)，至24 h 達(dá)峰值，且表達(dá)穩(wěn)定，故在隨后的指標(biāo)觀察中均選擇24 h 這個時間點(diǎn)進(jìn)行觀察。10% 大鼠正常血清加入Ang Ⅱ刺激后p47phox表達(dá)顯著升高，提示NADPH 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激途徑由AngⅡ誘發(fā)而迅速活化，10%大鼠正常血清+AngⅡ組與10%健脾清化+AngⅡ組、10%氯沙坦+AngⅡ組的比較顯示，健脾清化方和科素亞的干預(yù)能顯著減少p47phoxmRNA 的表達(dá)。表2 說明，健脾清化方能有效調(diào)控腎小球MCs 氧化應(yīng)激反應(yīng)中重要環(huán)節(jié)NADPH 氧化酶亞基p47phoxmRNA 的表達(dá)，從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。ROS 是氧化應(yīng)激反應(yīng)的核心環(huán)節(jié)，通過檢測SOD 和MDA 這2 種氧化應(yīng)激標(biāo)志物來反映ROS 的表達(dá)情況。由表3 可知，大鼠正常血清加入AngⅡ培養(yǎng)后系膜細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化平衡被打破，SOD 的顯著下降顯示存在抗氧化防御能力的代償不足，最終導(dǎo)致了氧化應(yīng)激發(fā)生，生物膜的脂質(zhì)過氧化增加，使MDA大量生成，兩者與正常血清組差異明顯（P＜0.01）并呈氧化應(yīng)激狀態(tài)；加入藥物干預(yù)后，無論是健脾清化方還是氯沙坦，都能明顯降低MDA 水平，提高SOD 水平，與前期的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全一致。

已有研究發(fā)現(xiàn)［12］，在血管緊張素Ⅱ的刺激下，由NADPH 氧化酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激產(chǎn)生過量ROS，后者又是誘導(dǎo)MAPKs 磷酸化、活化MAPK 信號通路的重要因素。此次研究也發(fā)現(xiàn)（表4），正常大鼠血清加入AngⅡ后p-p38MAPK 表達(dá)量顯著升高，推測氧化應(yīng)激可能與炎癥因子相關(guān)，與p38 的信號通路激活也密不可分，與前期報(bào)道一致。健脾清化方和氯沙坦干預(yù)后，磷酸化p38 表達(dá)明顯下降（P＜0.01），說明兩者均能明顯抑制系膜細(xì)胞p38MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的磷酸化。

本研究證實(shí)，AngⅡ可以上調(diào)腎小球系膜細(xì)胞NADPH 氧化酶亞基p47phox基因和刺激細(xì)胞內(nèi)ROS 的生成，活化p38MAP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，健脾清化方和AT1R 拮抗劑氯沙坦干預(yù)后能夠明顯抑制上述氧化反應(yīng)，并抑制繼而發(fā)生的p38 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路磷酸化，進(jìn)一步從細(xì)胞水平驗(yàn)證了氧化應(yīng)激在慢性腎衰發(fā)病中的作用機(jī)制以及健脾清化方臨床取效的作用途徑，提示AngⅡ可能部分通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)NADPH 介導(dǎo)的ROS 產(chǎn)生，激活p38 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)下游炎癥因子，從而引起腎小球系膜基質(zhì)增生和系膜區(qū)增寬，最終導(dǎo)致腎小球纖維化、腎功能衰竭，而健脾清化方治療對于氧化應(yīng)激的改善作用可能有助于延緩慢性腎衰的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。鑒于中藥多層次多靶點(diǎn)的治療特色，今后可考慮從其他氧化應(yīng)激通路和炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以及各信號通路之間的相互關(guān)系進(jìn)行更為深入的研究。