丹參總酚酸滴丸的制備及質(zhì)量評價(jià)

何銀舟，胡正明，潘 旻，嵇 晶，程建明?

（1.淮安市淮安醫(yī)院，江蘇 淮安 223001；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

丹參為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，是臨床上較為常用的中藥，在治療心血管疾病、抗腫瘤、抗氧化等方面的應(yīng)用日益廣泛［1-3］。大量藥理研究表明［4-6］，丹參水溶性成分丹酚酸可用于心腦血管疾病的治療，已成功研發(fā)出了注射用丹參多酚酸、多酚酸鹽等相關(guān)制劑，臨床療效良好，目前以注射劑為主，雖然起效迅速，生物利用度較高，但也存在給藥不方便、患者順應(yīng)性差的問題，同時(shí)直接入血，對生產(chǎn)工藝要求高，一旦出現(xiàn)質(zhì)量問題將引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，而且該類成分吸收消除快，無法維持長時(shí)間較高血藥濃度，也導(dǎo)致相關(guān)注射劑只適合臨床急救。目前，丹參總酚酸常用劑型主要有顆粒劑、片劑、脂質(zhì)體、滴丸、磷脂復(fù)合物等，但由于該類成分大多不耐熱，給相關(guān)生產(chǎn)工藝帶來了難度。

滴丸是指將固體或液體藥物與適當(dāng)基質(zhì)加熱熔化混勻后，滴入不相混溶的冷凝液中，收縮冷凝而成的小丸狀制劑［7-8］，具有生產(chǎn)工藝簡單、生物利用度高、起效迅速、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，發(fā)展前景廣闊。因此，本實(shí)驗(yàn)以丹酚酸中主要活性物質(zhì)丹酚酸B、迷迭香酸為指標(biāo)，對丹參總酚酸滴丸制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，以期為該類成分深入研究和相關(guān)制劑開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 滴丸機(jī)由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥藥劑教研室提供；Waters E2695 高效液相色譜儀，配置Waters 2489 UV 檢測器（美國Waters 公司）；BT125D 型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；DW-2 型調(diào)溫電熱器（南通市通州申通電熱器廠）；FA2004 型電子分析天平（上海上平儀器有限公司）；YP6002 型電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）；Unique-s15 型超純水系統(tǒng)（北京佰億新創(chuàng)科技有限公司）。

1.2 試藥 丹參總酚酸中間體（自制，批號20170304）。液體石蠟、二甲基硅油（上海泰坦科技股份有限公司）；聚乙二醇4000、聚乙二醇6000（無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司，批號20170301）。丹酚酸 B（含有量98%，批號Y26O7H23683）、迷迭香酸對照品（含有量98%，批號P26A7F13802）（上海源葉生物科技有限公司）。毛細(xì)管（華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司）。甲醇（美國賽默飛世爾科技公司，批號LOT18055159）、乙腈（德國默克公司，AS1122-801），以及磷酸（批號D629033）、冰醋酸（批號E1702076）［阿拉丁試劑（上海）有限公司］均為色譜純；乙酸乙酯（批號 14061411310 ）、三氯化鐵（批號14071210994）、鐵氰化鉀（批號15100210410）、鹽酸（批號160912100825）（南京化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（批號10014128，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 滴丸制備工藝

2.1.1 冷卻劑種類 固定藥物與基質(zhì)配比1∶5，取丹參總酚酸凍干粉1.5 g，加入混合基質(zhì)7.5 g（PEG4000∶PEG6000=4∶1），65 ℃水浴熔融并攪拌混勻，80 ℃下分別滴入二甲基硅油、液體石蠟中，以滴丸下降速度、成型情況為指標(biāo)考察冷卻劑。結(jié)果，二甲基硅油處理時(shí)滴丸下降速度合適，丸形規(guī)則圓整；液體石蠟處理時(shí)滴丸下降速度過快，部分帶有小尾巴，可能與其密度較小有關(guān)，故選擇前者作為冷卻劑。

2.1.2 基質(zhì)配比 PEG4000 具有良好的分散力及較大的內(nèi)聚力，符合滴丸對基質(zhì)的要求，再加入一定比例黏度較大的PEG6000 以調(diào)整基質(zhì)成型。兩者按1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 比例混合熔融后滴入二甲基硅油中，制備空白滴丸，以易滴程度、空白滴丸成型情況為指標(biāo)進(jìn)行篩選，結(jié)果見表1。由表可知，隨著PEG4000 比例增大滴速變快，不易控制；當(dāng) PEG4000、PEG6000 比例為3∶1 時(shí)，基質(zhì)較易滴出，而且空白滴丸成型性較好，滴丸圓整，硬度適宜，故選擇其作為基質(zhì)。

表1 基質(zhì)配比考察結(jié)果Tab.1 Results of matrix ratio investigation

2.1.3 藥物與基質(zhì)配比 滴丸中藥物與基質(zhì)的配比一般在1∶1～1∶10 范圍內(nèi)，但其過高時(shí)易導(dǎo)致滴丸成型困難，而過低時(shí)又會使載藥量偏低，故在1∶1～1∶6 范圍內(nèi)進(jìn)行考察，結(jié)果見表2。由表可知，1∶5 時(shí)效果最理想，故選擇其作為藥物與基質(zhì)配比。

表2 藥物與基質(zhì)配比考察結(jié)果Tab.2 Results of drug-matrix ratio investigation

2.1.4 滴距、滴速 滴距過小時(shí)，液滴到達(dá)二甲基硅油中后來不及收縮，導(dǎo)致滴丸不圓整；滴距過大時(shí)，液滴容易呈扁形，或者因重力作用而被跌散生小丸［9］，本實(shí)驗(yàn)篩選空白滴丸時(shí)發(fā)現(xiàn)，滴距為6 cm時(shí)滴丸圓整度較好。滴速過快時(shí)，滴丸連續(xù)下沉到冷卻劑中，容易相互粘連，圓整度不佳；滴速過慢時(shí)，雖然滴丸圓整度好，成型性符合要求，但混合基質(zhì)易凝固，導(dǎo)致滴口堵塞，并且容易增加丸重差異，從而影響滴丸質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)在不影響成型效果、圓整度的情況下適度提高滴速，控制在60 滴／min。

2.1.5 料溫 料溫過低時(shí)，滴丸易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，圓整度差；料溫過高時(shí)，滴丸圓整度降低，若滴制過快則易粘連。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，混合基質(zhì)在58 ℃時(shí)開始熔融，65 ℃時(shí)全部熔融，由于丹酚酸類成分高溫不穩(wěn)定，故選擇65 ℃作為料溫。

2.1.6 其他滴制條件 根據(jù)滴丸成型性和圓整度，確定冷卻劑溫度為上常溫下低溫，滴口內(nèi)、外徑為3、4.5 mm。

2.1.7 工藝驗(yàn)證 根據(jù)上述優(yōu)化工藝參數(shù)，制備3 批滴丸（批號20170410、20170411、20170412），發(fā)現(xiàn)其丸形圓整，色澤均一，硬度較好，無拖尾、粘連現(xiàn)象，表明工藝穩(wěn)定可行。

2.2 滴丸質(zhì)量評價(jià)

2.2.1 HPLC 法測定丹酚酸B、迷迭香酸含有量

2.2.1.1 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-1%醋酸（B），梯度洗脫，程序見表3；體積流量1.0 mL／min；檢測波長280 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取丹酚酸B 對照品4.85 mg、迷迭香酸對照品3.80 mg，分別置于25、250 mL 棕色量瓶中，80%甲醇稀釋，即得（190.12、14.90 μg／mL）。

表3 梯度洗脫程序Tab.3 Gradient elution programs

2.2.1.3 供試品溶液制備 取滴丸10 粒，置于100 mL 具塞錐形瓶中，精密稱定質(zhì)量，加入50 mL 80% 甲醇，超聲（功率140 W、頻率42 kHz）20 min，放冷，80% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，即得。

2.2.1.4 專屬性考察 取空白滴丸、含藥滴丸適量，按“2.2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由表可知，PEG4000、PEG6000 對測定無干擾，方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of various constituents

2.2.1.5 線性關(guān)系考察 精密量取190.12 μg／mL丹酚酸B 對照品溶液、14.90 μg／mL 迷迭香酸對照品溶液各1、2、4、6、8、10 mL，80% 甲醇定容至10 mL，在“2.2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得到丹酚酸B、迷迭香酸方程分別為Y=6 216.4X-1 019.6（R2=0.999 66）、Y=10 996X-153.46（R2=0.999 8），分別在19.01～190.12、1.49～14.90 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.1.6 精密度試驗(yàn) 取152.10 μg／mL 丹酚酸B對照品溶液、8.94 μg／mL 迷迭香酸對照品溶液適量，在“2.2.2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測定6次，測得丹酚酸B、迷迭香酸峰面積RSD 分別為0.88%、1.62%，表明儀器精密度良好。

2.2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批滴丸，按“2.2.2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得丹酚酸B、迷迭香酸含有量RSD 分別為1.72%、1.17%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批滴丸，按“2.2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.2.1”項(xiàng)色譜條件下于0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣測定，測得丹酚酸B、迷迭香酸含有量RSD 分別為1.72%、1.17%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.1.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 分別取同一批滴丸25、100 粒，置于100 mL 具塞錐形瓶中，加入相當(dāng)于滴丸中成分含有量80%、100%、120%的對照品后進(jìn)行提取，取續(xù)濾液，在“2.2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，丹酚酸B、迷迭香酸平均加樣回收率分別為 97.92%、96.58%，RSD 分別為2.45%、1.64%。

2.2.1.10 樣品含有量測定 取3 批滴丸，按“2.2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行3 份，在“2.2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表4。以平均值的-20% 為下限，初步確定丹酚酸B、迷迭香酸含有量分別不得低于5.45%、0.46%。

表4 各成分含有量測定結(jié)果（n=3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（n=3）

2.2.2 TLC 法定性鑒別

2.2.2.1 供試品溶液制備 取滴丸15 丸，加水1 mL、稀鹽酸2 滴，充分振搖，再加乙酸乙酯3 mL振搖1 min，離心2 min，上清液蒸干至2 mL，即得。

2.2.2.2 對照藥材溶液制備 取丹參對照藥材，按“2.2.2.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.2.3 展開條件 硅膠G 薄層板；展開劑乙酸乙酯-水-甲酸（14∶2∶3）上層溶液；顯色劑1%三氯化鐵-1% 鐵氰化鉀（1∶1）溶液，臨用時(shí)配制。

2.2.2.4 鑒別方法 取3 批滴丸，按“2.2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2015 年版《中國藥典》薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

圖2 各成分TLC 色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of various constituents

2.2.3 重量差異限度檢查 精密稱取滴丸20 粒，計(jì)算其總重和每粒丸重，根據(jù)2015 年版《中國藥典》一部附錄判斷重量差異是否符合要求。結(jié)果，20 粒 滴 丸 丸 重 分 別 為25.56、25.51、25.43、25.57、25.48、25.48、25.43、25.49、25.51、25.54、25.39、25.55、25.62、25.58、25.53、25.53、25.61、25.47、25.45、25.51 mg，平 均25.51 mg＜0.03 g，RSD 為0.24%。藥典規(guī)定，重量差異限度應(yīng)±15%，每粒滴丸丸重應(yīng)在21.68～29.33 mg 范圍內(nèi)，超出標(biāo)準(zhǔn)限度的不得多于2 丸，不得有1 丸超出標(biāo)準(zhǔn)限度的1 倍，由此可知，本實(shí)驗(yàn)所制滴丸符合相關(guān)要求。

2.2.4 溶散時(shí)限檢查 取6 粒滴丸于溶出儀的吊籃中，溫度設(shè)定為37 ℃，發(fā)現(xiàn)所有滴丸在5 min內(nèi)均完全溶解，符合2015 年版《中國藥典》一部滴丸劑項(xiàng)下溶散時(shí)限不得超過30 min 的規(guī)定。

3 討論

目前，丹酚酸類成分的緩控釋制劑仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，未見市售產(chǎn)品。張麗紅等［10］以大豆卵磷脂制備丹參總酚酸長循環(huán)脂質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)它可減緩丹酚酸在體內(nèi)的消除，延長體內(nèi)滯留時(shí)間，提高生物利用度；咸銀庫等［11］以丹參總酚酸為原料制備速釋的口腔崩解片，可提高生物利用度；Jin 等［12］通過制備丹參總酚酸磷脂復(fù)合物，改善了脂溶性差的問題；此外，也有關(guān)于丹參總酚酸滴丸、胃滯留緩釋片的報(bào)道［13-15］，為相關(guān)制劑研究提供了參考。

本實(shí)驗(yàn)以滴丸成型性和圓整度為依據(jù)，考察了冷卻劑、基質(zhì)配比、藥物與基質(zhì)配比等影響滴丸成型工藝的因素，最終確定最優(yōu)工藝為將丹參總酚酸凍干粉研細(xì)混勻備用，以PEG4000、PEG6000 為成型基質(zhì)，按3∶1 比例混合，65 ℃水浴加熱熔融，按藥物與基質(zhì)配比1∶5 分次加入凍干粉，攪拌均勻，在滴距6 cm，滴口內(nèi)、外徑3、4.5 mm，滴速60 滴／min 的條件下滴入二甲基硅油冷凝劑（上常溫下低溫）中，冷卻，固化成丸，取出，濾紙吸干表面冷卻劑，即得，所得滴丸外觀圓整、硬度適宜，制備工藝合理可行。其中，丹酚酸B、迷迭香酸平均含有量分別為6.81%、0.58%，平均丸重為25.51 mg，重量差異限度、溶散時(shí)限均符合藥典要求。由此可知，該工藝操作簡單，生物利用度高，起效迅速，穩(wěn)定性好，具有廣闊的發(fā)展前景，可為丹參酚酸類成分研究和相關(guān)制劑開發(fā)提供參考。