丁香酚對異齒裂腹魚的麻醉效果

王萬良，王金林，曾本和，古桑德吉

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏 拉薩 850000）

丁香酚（Eugenol）是一種植物香料，廣泛存在于丁香油、樟腦油和肉桂葉油等芳香油中[1]，能抑制魚類的腦皮質(zhì)而喪失觸覺，然后作用于基底神經(jīng)節(jié)和小腦，使魚類處于極度興奮狀態(tài)，之后作用于脊髓達(dá)到麻醉魚類的作用[2]。丁香酚及其代謝物能很快從血液和組織中排出，不會誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生突變物質(zhì)，廣泛添加在食品中[3]。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織及世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食品添加劑專家委員會報告，每天攝入150mg 丁香酚不會危害人類健康[4]。與美國國家食品及藥物管理局（FDA）推薦的漁用麻醉劑MS-222 相比，丁香酚的毒性更小，很多國家如澳大利亞、智利、芬蘭、新西蘭等認(rèn)為丁香酚無殘留期，是合法的水產(chǎn)麻醉劑[5]。Kildea 等[6]研究了丁香酚在銀鱸Bidyowas bidyous 體內(nèi)積累與清除時發(fā)現(xiàn)，48h后未在魚體中未檢出丁香酚。我國尚未明確規(guī)定水產(chǎn)用何種麻醉劑，但丁香酚成本較低、效果好、安全性高等，被廣泛用于親魚的采卵、活魚運輸?shù)壬a(chǎn)活動和解剖科學(xué)試驗中[7]，我國已對中華鱘Acipenser sinensis、倒刺鲃Spinibarbus denticulatus、大黃魚Larimichthys crocea、虹鱒Oncorhynchus mykiss、大西洋鮭Salmo salar 等魚類進(jìn)行了麻醉試驗，并獲得了較好的效果[8-12]。

異齒裂腹魚Schizothorax oconori 俗稱棒棒魚，屬鯉形目Cypriniformes、鯉科Cyprinidae、裂腹魚亞科Schizothoracinae、裂腹魚屬Schizothorax，主要分布于雅魯藏布江上、中游的干支流及附屬水體，是西藏主要的土著經(jīng)濟(jì)魚類之一[13]。近年來，由于人為干預(yù)頻繁，該魚部分江段數(shù)量銳減，嚴(yán)重破壞了雅魯藏布江漁業(yè)資源[14]。早期研究了異齒裂腹魚的分類學(xué)、起源、演化和分子系統(tǒng)發(fā)育[15,16]；隨之分析了該魚的染色體組型和間冰期生境的改變對其時空分布的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的變化[17-19]；還進(jìn)行了異齒裂腹魚繁殖、發(fā)育、養(yǎng)殖和行為生物學(xué)等研究[20-22]。本試驗研究丁香酚對野生異齒裂腹魚的麻醉效果，可為異齒裂腹魚資源調(diào)查、人工繁育操作及運輸提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

丁香酚（C10H12O2）（2-甲氧-4-丙烯基酚）相對分子量為164.2，純度≥99%，淡黃色液體，難溶于水，易溶于醇類、醚或冰醋酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)。

異齒裂腹魚購自拉薩藥王山水產(chǎn)品批發(fā)市場，在拉薩國家級現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技園區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地平列槽中暫養(yǎng)，水源為曝氣地下水，水溫保持在12～13℃，溶氧≥7mg/L，pH=7.8。試驗選擇體色正常、體表完整、體格健壯、活力強(qiáng)的魚進(jìn)行試驗。

試驗容器1.2 m×1.0 m×1.0 m，連續(xù)曝氣供氧，保持溶氧≥7mg/L，水溫12.5℃。丁香酚與無水乙醇按體積1∶9 的比例配置成母液備用，試驗時現(xiàn)配現(xiàn)用，配置藥液充分?jǐn)嚢瑁鶆蚝箪o置15 min。

1.2 方法

采用靜水方法，使用較大質(zhì)量濃度范圍的丁香酚對體質(zhì)量相近的異齒裂腹魚進(jìn)行麻醉預(yù)試驗。麻醉階段分為A0～A45 個階段，復(fù)蘇階段劃分為R1～R44 個階段，具體劃分標(biāo)準(zhǔn)見表1[23]。當(dāng)魚停止游動，完全失去反應(yīng)能力，僅鰓蓋正常張合時，即判斷為麻醉期（A4）；當(dāng)身體平衡、反應(yīng)靈敏，鰓蓋張合正常，即判斷為魚已復(fù)蘇（R3）。通常將3min 內(nèi)完全麻醉，5min 內(nèi)恢復(fù)自然狀態(tài)的丁香酚濃度作為理想麻醉質(zhì)量濃度。

表1 異齒裂腹魚麻醉與復(fù)蘇階段劃分Tab.1 Classification of anaesthesia and recovery stages of Schizothorax oconori

1.2.1 不同質(zhì)量濃度丁香酚對異齒裂腹魚麻醉的影響試驗

試驗設(shè)9個質(zhì)量濃度：10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L、35 mg/L、40 mg/L、50 mg/L 和60 mg/L，試驗魚平均體質(zhì)量為（1 072±101）g，每個處理3 個平行組，每個平行組10 尾。記錄麻醉時間、復(fù)蘇時間，復(fù)蘇尾數(shù)與麻醉尾數(shù)比值為復(fù)蘇率。試驗結(jié)束后在平列槽暫養(yǎng)3d，觀察成活率。

1.2.2 不同質(zhì)量濃度丁香酚對異齒裂腹魚呼吸頻率的影響試驗

試驗選擇平均體質(zhì)量為（980±86）g 的異齒裂腹魚45 尾，隨機(jī)分9 組，每組5 尾，分別放入質(zhì)量濃度為0 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L、35 mg/L、40 mg/L 和50 mg/L 水體中，測定其1～7 min 內(nèi)鰓動次數(shù)。進(jìn)入深度麻醉后迅速撈出放入清水復(fù)蘇，記錄復(fù)蘇尾數(shù)和3 d 后死亡尾數(shù)。

1.2.3 相同質(zhì)量濃度丁香酚對不同規(guī)格異齒裂腹魚麻醉影響試驗

選擇平均體質(zhì)量為（480±72）g、（1 036±84）g和（1 526±123）g 的異齒裂腹魚，在質(zhì)量濃度30mg/L條件下進(jìn)行試驗，每組10 尾，3 個平行，記錄麻醉時間、復(fù)蘇時間、復(fù)蘇率和死亡率。

1.2.4 空氣暴露時間對深度麻醉魚體復(fù)蘇的影響試驗

選擇平均體質(zhì)量（1 132±116）g 異齒裂腹魚在質(zhì)量濃度30mg/L 深度麻醉，在空氣中暴露0s、300s、600s、900s、1200s、1500s、1800s、2100s 和2400s，隨后迅速放回清水中進(jìn)行復(fù)蘇，記錄復(fù)蘇時間、復(fù)蘇尾數(shù)和死亡尾數(shù)。1.2.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)通過Excel2007 軟件進(jìn)行處理，用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan's 法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05 為各組之間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度丁香酚對魚的麻醉效果

由圖1 和表2 可知，當(dāng)丁香酚濃度在10～60mg/L 范圍內(nèi)，隨著丁香酚質(zhì)量濃度增加，麻醉時間依次遞減，在質(zhì)量濃度35mg/L、40mg/L 和50mg/L 時，麻醉時間差異不顯著（P＞0.05），質(zhì)量濃度與麻醉時間的相關(guān)式為：Y=1516.8e-0.059X，R2=0.9771；而復(fù)蘇時間則隨著丁香酚的質(zhì)量濃度的遞增依次延長，在15mg/L、20mg/L 和25mg/L 質(zhì)量濃度時，復(fù)蘇時間差異不顯著（P＞0.05），質(zhì)量濃度與復(fù)蘇時間的相關(guān)式為：Y=0.1344X2+2.964X+357.12，R2=0.9111，復(fù)蘇率均為100%，3d 后死亡率為0。

圖1 不同質(zhì)量濃度丁香酚對異齒裂腹魚的麻醉效果Fig.1 Anesthetic effect of Schizothorax oconori exposed to different concentrations of eugenol

表2 不同質(zhì)量濃度丁香酚對異齒裂腹魚體的麻醉效果Tab.2 Anesthetic effect of Schizothorax oconori exposed to different concentrations of eugenol

2.2 不同質(zhì)量濃度的丁香酚下異齒裂腹魚的呼吸頻率

如圖2 所示，平均體質(zhì)量（980±86）g 的異齒裂腹魚在麻醉的初始階段，呼吸頻率輕微升高。在7 min 之內(nèi)，10mg/L、15mg/L、20mg/L 和25mg/L 麻醉組與對照組（0mg/L）趨勢的相似。觀察發(fā)現(xiàn)，試驗魚未進(jìn)入麻醉期（A3）之前，呼吸頻率變化不明顯，基本維持在90 次/min 左右。當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度為30～50 mg/L 時，呼吸頻率隨時間的推移而明顯變化，質(zhì)量濃度越高，呼吸頻率降低越快；質(zhì)量濃度為35 mg/L 時，3 min 后進(jìn)入深度麻醉期（A4），而質(zhì)量濃度為40mg/L 和50mg/L 時，2min 即可進(jìn)入深度麻醉期（A4），隨后呼吸頻率降低為0。

圖2 不同質(zhì)量濃度丁香酚對異齒裂腹魚呼吸頻率影響Fig.2 Effects of eugenol at different concentrations on respiratory frequency of Schizothorax oconori

2.3 丁香酚對不同規(guī)格異齒裂腹魚的麻醉效果

如圖3 所示，在丁香酚質(zhì)量濃度為30 mg/L 時，隨著魚體質(zhì)量增加，麻醉時間依次減少，平均體質(zhì)量（1 000±56）g 與（1 500±56）g 異齒裂腹魚麻醉時間差異不顯著（P＞0.05），二者與平均體質(zhì)量（500±56）g 麻醉時間差異顯著（P＜0.05）；復(fù)蘇時間隨著體質(zhì)量增加依次遞增，平均體質(zhì)量（500±56）g與（1 000±56）g 異齒裂腹魚麻醉時間差異不顯著（P＞0.05），二者與平均體質(zhì)量（1 500±56）g 麻醉時間差異顯著（P＜0.05），復(fù)蘇率均為100%，3d 后死亡率為0。

2.4 空氣暴露時間對深度麻醉魚體復(fù)蘇的影響

由表3 和圖4 可知，在0～1 600 s 范圍內(nèi)，隨著空氣暴露時間增加，平均體質(zhì)量（1 132±116）g 異齒裂腹魚復(fù)蘇時間依次遞增，空氣暴露600s，與300s 和900 s 時復(fù)蘇時間差異不顯著（P ＞0.05），與其他時間差異均顯著（P＜0.05）；空氣暴露1 800 s，與1 500s、2 100s 和2 400 s 差異不顯著（P＞0.05），與其他差異均顯著（P＜0.05）；空氣暴露1 800s、2 100s和2 400 s 之間差異不顯著（P＞0.05）；空氣暴露2 400 s時，復(fù)蘇率為80%，3 d 后死亡率為20%；其余各組復(fù)蘇率均為100%，3d 后死亡率為0；空氣暴露時間與復(fù)蘇時間的相關(guān)式為：Y=0.4009X+527.76，R2=0.9537。

圖3 丁香酚對不同體質(zhì)量異齒裂腹魚麻醉效果的影響Fig.3 The anesthesia effect of eugenol on Schizothorax oconori with various body weights

3 討論

我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)大國，水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)和科研活動中廣泛應(yīng)用麻醉劑，目前使用較多的魚類麻醉劑有30 多種，包括MS-222、2-苯氧乙醇和硫酸喹哪啶等[23]?？茖W(xué)合理使用麻醉劑能夠使魚體保持相對安靜，降低采卵、采精和采血等操作時的應(yīng)激反應(yīng)，能高效、順利完成測量和采樣工作；在長途運輸中，麻醉劑可以降低魚體新陳代謝，減少傷害，提高運輸成活率。近些年，丁香酚價格低、對人體和魚體較安全，麻醉效果高，已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)業(yè)。

表3 空氣暴露時間對麻醉的異齒裂腹魚復(fù)蘇的影響Tab.3 Effects of air exposure time on recovery of anesthetized Schizothorax oconori

據(jù)Marking 和Meyer[24]、Meyer 等[25]研究，通常將180s 內(nèi)完全麻醉，300s 內(nèi)恢復(fù)自然狀態(tài)的麻醉劑劑量定為最適麻醉質(zhì)量濃度。劉艷超等[25]研究了MS-222 對兩種規(guī)格的異齒裂腹魚麻醉效果研究，大規(guī)格[體長為（25.0±1.5）cm]和小規(guī)格[體長為（14.8±2.3）cm]在有效濃度150mg/L 條件下，均在250s 內(nèi)完全麻醉，恢復(fù)時間分別為250s 和420s。周裕華等[26]研究了丁香酚對鯔Mugil cephalus 的麻醉效果，在麻醉時間小于180s，復(fù)蘇時間小于300s時，丁香酚的理想麻醉質(zhì)量濃度為30mg/L。本試驗結(jié)果表明，隨著丁香酚質(zhì)量濃度的增加，麻醉時間縮短，復(fù)蘇時間延長，這與大多數(shù)學(xué)者研究結(jié)果一致[27-29]；丁香酚濃度在35～60 mg/L 范圍內(nèi)，均可以使異齒裂腹魚在180 s 內(nèi)完全麻醉；其中在質(zhì)量濃度為60 mg/L 時，麻醉時間最短，顯著低于其他各實驗組，但復(fù)蘇時間很長，需要1 001s，與劉艷超使用MS-222 對大規(guī)格異齒裂腹魚麻醉效果類似，大于理想復(fù)蘇時間300 s，原因可能是丁香酚對異齒裂腹魚極為敏感有關(guān)；平均體質(zhì)量為1 072g 異齒裂腹魚至少在20 齡以上，可能造成其復(fù)蘇時間延長。

低濃度丁香酚抑制了異齒裂腹魚的運動和感覺，但呼吸頻率并沒有發(fā)生較大變化；相反，高濃度丁香酚明顯影響了呼吸頻率，可能原因是魚呼吸中樞的麻醉需要更高濃度的閾值；觀察發(fā)現(xiàn)，呼吸頻率的降低基本處于深度麻醉的過程（A3～A4），說明這一階段魚體的呼吸中樞受到了抑制，這與賈超峰等用丁香酚麻醉真鯛Pagrosomus major×黑鯛Acanthopagrus schlegelii 雜交子一代的效果一致[30]。

一般情況下，丁香酚的麻醉效果與魚體的種類、規(guī)格和年齡等因素有關(guān)，但也有報道不同規(guī)格羅非魚Oreochromis mossambicus 與麻醉效果沒有明顯的相關(guān)性[31]。本試驗在30 mg/L 質(zhì)量濃度條件下，小規(guī)格異齒裂腹魚麻醉時間較長，而復(fù)蘇時間較短，說明小規(guī)格異齒裂腹魚對丁香酚的耐受性更強(qiáng)，這與李靖等對大西洋鮭的研究結(jié)果一致[32]?？赡茉蚴切∫?guī)格魚體鰓部面積較窄，單位時間水交換較少，腦體指數(shù)較大所致[33]。魚體在空氣中暴露主要用于一系列樣品采集、生物學(xué)數(shù)據(jù)收集及人工繁殖操作。本試驗可知，異齒裂腹魚深度麻醉后，隨著空氣中暴露時間越長，復(fù)蘇時間呈現(xiàn)一個遞增的變化趨勢，這與嚴(yán)銀龍等對刀鱭Coilia nasus 的研究結(jié)果一致[34]，而與張志山等對翹嘴鲌Culter alburnus 的研究結(jié)果相反[35]，可能原因是種類不同所致，具體因素還待進(jìn)一步研究。小結(jié)

麻醉劑通過抑制其中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，使魚體保持安靜，減少應(yīng)激損傷，在漁業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。丁香酚對異齒裂腹魚麻醉有效質(zhì)量濃度30～35mg/L，在開展科學(xué)試驗及研究中MS-222 為首選麻醉劑，但考慮商品魚藥殘，丁香酚優(yōu)于MS-222。