達里湖鯽和人工選育紅鯽雜交子代對NaHCO3堿度的耐受力

常玉梅，孫博，張立民，梁利群

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，中國水產科學研究院特殊生境魚類種質特性與抗逆育種重點實驗室，農業(yè)農村部淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室，淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

我國北方地區(qū)有很多水質理化因子特殊的鹽堿水域，如鹽堿湖泊、地下咸水和鹽堿化沼澤等，尚未得到有效開發(fā)利用。實踐證明，“以漁治堿”是開發(fā)利用鹽堿水域的有效途徑之一[1]。篩選培育耐鹽堿、生長快、抗病力強的魚類新品種或雜交種，對改善鹽堿水域生態(tài)環(huán)境，拓寬宜漁水面，發(fā)展節(jié)水養(yǎng)殖具有重要的戰(zhàn)略意義。

雜交育種是水產生物育種的重要途徑之一。目前，在全國范圍內廣泛開展的魚類品種間雜交選育，尤以鯉Cyprinus carpio 品種間的雜交效果最好[2]。迄今，已獲得諸如豐鯉（C.carpio var.Xingguo♀×C.carpio var.mirror splittered ♂）、荷元鯉（C.carpio var.Wuyuanensis ♀× C.carpio Yuanjiang♂）、建鯉（C.carpio var.Jian）、荷包紅鯉抗寒品系（C.carpio var.Wuyuanensis）、松浦鯉（C.carpio var.Songpu）等十幾個具有明顯雜種優(yōu)勢的雜交種[2,3]。鯽Carassius auratus 是我國大宗淡水主要養(yǎng)殖種之一，具有適應性強、性成熟周期短、養(yǎng)殖成本低等特點，是良好的育種材料。目前培育出的鯽品種有異育銀鯽中科三號C.gibelio[4]、異育銀鯽C.gibelio[5]、湘云鯽（triploid crucian carp,crucian carp ♀× allotetraploid carp♂）[6]、高郵鯽（C.auratus auratus ♀×C.auratus Cuvieri ♂）[7]和藍花長尾鯽（goldfish ♀×red crucian carp ♂）[2]等。

達里湖鯽C.auratus 生活在內蒙古高鹽堿湖泊—達里湖，常年耐受堿度53.57 mmol/L、pH 高達9.69 的惡劣水域中，成為該湖除瓦氏雅羅魚Leuciscus waleckii 外的另一主要經濟魚類。但是，達里湖鯽的生長速度一般比同齡淡水鯽慢1～2 年[7]。雖然鹽堿鯽和淡水鯽的表型差異較小，但二者的基因組組成和結構已開始分化。筆者利用微衛(wèi)星分子標記（SSR）分析達里湖鯽和黑龍江雙鳳水庫鯽C.auratus 的基因型，發(fā)現二者基因組遺傳分歧較大（常玉梅等，待發(fā)表）。該研究結果與池炳杰等[9]分析鹽堿瓦氏雅羅魚和淡水瓦氏雅羅魚的遺傳差異的結果一致。因此，鹽堿鯽和淡水鯽雜交獲得的雜交種極有可能產生雜種優(yōu)勢。本課題組以達里湖鯽為選育主體開展了鯽種內和種間雜交，發(fā)現種內正反交的F1雜種優(yōu)勢明顯，達里湖鯽的耐鹽堿特性在雜交F1中均得到了保持，平均耐受能力也顯著高于其他常規(guī)主養(yǎng)魚類，同時具有一定的生長優(yōu)勢[10]。

本研究通過測定達里湖鯽雜交子代的生長、潛在免疫力及耐高堿等性狀的相關指標，并采用單因素變量、主成分以及多因素線性回歸等統(tǒng)計方法進行了分析，以期為科學評估雜交鯽的綜合生產性能及良種申報提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗用達里湖鯽自交F1（J，母本）和黑龍江水產研究所人工選育紅鯽（H，父本）的雜交子一代（JH，F1）約2 000 尾，在中國水產科學研究院黑龍江水產研究所呼蘭實驗站室外土池飼養(yǎng)122d，隨機挑選180 尾，平均體質量約90g 的雜交F1運回實驗室進行后續(xù)實驗。

1.2 生長和免疫指標測定

暫養(yǎng)2d 后（換水、不投飼），測定每個個體的體質量（BW），然后從尾靜脈抽取約0.5mL 的血液（無抗凝劑），為了明確每個檢測指標的對應關系，將所有180 尾個體進行剪鰭標記等量分配到6 個大小相同、循環(huán)、溫控的水族箱內（96.5cm×52.5cm×45.5cm）繼續(xù)暫養(yǎng)，用于后續(xù)的耐高堿實驗。血液樣本4℃靜置過夜后，3 500r/min 離心10min 獲取血清，根據南京建成科技有限公司生產的試劑盒說明書，采用酶標儀（Bio-Teck）分別測定血清中的丙二醛（MDA）含量、堿性磷酸酶（AKP）、總超氧化物歧化酶（TSOD）及過氧化氫酶（CAT）的活性。

1.3 耐高堿性狀測定

前期抽血測定免疫指標對魚體造成了一定損傷，為了規(guī)避后續(xù)實驗誤差，所有實驗魚在6 個上述水族箱內繼續(xù)暫養(yǎng)40d，其中每2 個水族箱共享一個循環(huán)槽，保證實驗有三組平行，每個平行有2個重復。在體能恢復期間，水質為曝氣的自來水，每天換水1/3，飼喂2 次，水溫17～18℃、溶解氧7.24～8.21mg/L、pH7.29～7.44、鹽度0.11～0.17mg/L、堿度0.44～0.48 mmol/L。

鹽堿湖泊生存的魚類通常能夠耐受較高的氨氮含量[11]。因此，本研究以成活和死亡個體血液的氨氮含量作為衡量其耐堿性狀的生理指標。具體實驗步驟如下：實驗魚饑餓48h 后，以20mmol/L/d 為梯度，將NaHCO3等量地添加到每個水族箱內，至第6d 增至120mmol/L；根據預實驗結果，第7d 增加10mmol/L 至130 mmol/L（pH9.2～9.3），實驗魚開始出現死亡。維持該堿度，以96h 累計死亡率超過50%為基準，后續(xù)成活個體視為耐堿個體。分別抽取瀕死個體和成活個體少量血液，利用南京建成科技有限公司生產的試劑盒，測定血氨（Ammonia-N）和尿素氮（Urea-N）含量。實驗期間不投飼，全程采用YSI水質分析儀監(jiān)測水中的溶氧、鹽度、pH 和氨氮等參數。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

采用SAS 9.4 軟件統(tǒng)計分析所測得的生長、潛在免疫力和耐高堿性狀數據。首先對三組性狀指標進行Pearson 相關性分析，然后分析高堿脅迫下雜交F1的成活和死亡個體三組性狀所有指標的差異性，對影響耐鹽堿存活的多個因素進行主成分分析和多因素Logistic 線性回歸分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。由于Logistic 分析不能對數據采集不完整的個體和極端值進行分析，因此在數據分析中剔除了數據缺失和極端數值，用于最后數據分析的有效個體為131 尾。

2 結果與分析

2.1 表型和血液生理指標的相關性分析

采用Pearson 關聯(lián)分析對雜交F1的7 個指標進行相關性分析。結果如表1 所示，BW 與MDA（r=0.195）和TSOD（r=0.245），MDA與TSOD（r=0.237）、Ammonia-N（r=0.311）和Urea-N（r=0.199），以 及Ammonia-N 和Urea-N（r=0.668）之間均呈顯著正相關（P＜0.05）；AKP 與Ammonia-N（r=-0.262）和Urea-N（r=-0.173）、TSOD 和CAT（r=-0.355）則呈顯著負相關（P＜0.05）。

2.2 存活與死亡個體表型和血液生理指標的單因素變量分析

表1 雜交子鯽代（F1）7 個表型和血液生理指標的相關系數（N=131）Tab.1 Pearson’s correlation coefficients among seven traits（N=131）in the hybrid crucian carp

表2 雜交F1存活和死亡個體表型和血液生理指標的差異（平均值±標準差）Tab.2 Differences of growth and blood physiological indices between the survivor and the death in the hybrid crucian carp（mean ± sd）

如表2 所示，高堿脅迫下F1存活和死亡個體除平均BW 和CAT 活性之間無顯著差異外，二者的其它指標均存在顯著差異（P＜0.05）。其中存活個體的AKP 平均活性顯著高于死亡個體，而MDA、Ammonia-N 和Urea-N 的平均含量及TSOD 活性顯著低于死亡個體（P＜0.05）。

2.3 存活與死亡個體表型和血液生理指標的主成分分析

變量BW 和CAT 不符合Kaiser-Meyer-Olkin（KMO）（KMO＜0.5）標準[12]，只對其他5 個變量MDA、AKP、TSOD、Ammonia-N 和Urea-N 進行主成分分析（PCA）。由表3 可知，前3 個主成分的特征值均大于1，方差貢獻率分別為39.0%、22.3%和20.1%，累計貢獻率為81.4%，第一主成分貢獻率明顯大于其他主成分貢獻率。進一步權重系數分析顯示，第一主成分起主要作用的是MDA、Ammonia-N 和Urea-N，均具有正向的載荷值，分別為0.513、0.883 和0.808，解釋了變異的43.3%；第二主成分起主要作用的是MDA 和TSOD，也具有正向的載荷值，分別為0.626 和0.691，解釋變異的32.1%；第三主成分起主要作用的為AKP 和TSOD，具有正向載荷值0.751和負向載荷值-0.525，解釋變異的24.6%（表4）。

2.4 存活與死亡個體多因素logistic 線性回歸分析

為利用現有性狀數據建立預測鯽雜交后代耐受NaHCO3堿度存活特性的多因素線性回歸模型，以存活和死亡作為因變量，將具有統(tǒng)計學差異的各項單因素和主成分中對模型貢獻率大的因子納入多因素Logistic 模型分析。由表5 可知，AKP、MDA、Ammonia-N 和Urea-N 以及MDA×Urea-N 和Ammonia-N×Urea-N 等多個因子及因子相互作用對雜交個體耐受性存在顯著影響（P＜0.05），其中MDA、Ammonia-N 和Urea-N 預測的系數為負值，說明這3 個參數對鯽雜交子代耐受性是負調控。AKP、MDA×Urea-N 之間的互作、Ammonia-N×Urea-N之間的互作正面影響雜交F1的存活。AKP 酶活性變化影響鯽耐受的存活概率，存活個體是死亡個體幾率的1.758 倍；其他變量，如MDA×Urea-N 及Ammonia-N×Urea-N 相互作用的比率比接近1，和其他較小比率比的變量，如與Urea-N 相比，這些變量增加了耐受個體存活的概率。多因素Logistic 模型擬合度預測分析顯示，利用此模型預測50%個體存活的假陽性7.4%，假陰性11.7%，正確率90.1%，敏感度84.7%和特異性94.4%（表5）。

表4 主成分的權重系數Tab.4 Weight coefficient of principal components

表5 雜交子鯽代（F1）存活和死亡個體多因素Logistic 分析Tab.5 Multifactor logistic analysis between the survivor and the death in the hybrid crucian carp

3 討論

3.1 鯽雜交F1綜合生產性能評價

雜交是傳統(tǒng)育種手段之一，旨在通過動植物屬間、種間、種群間的個體的交配，謀求雜種優(yōu)勢（heterosis 或hybrid vigor），獲得在生長性能、繁殖力、適應力、抗病性、肉質等方面超越雙親或兼具雙親某些特點的雜種。雜種優(yōu)勢是生物界的普遍現象。如在農作物中，雜交玉米和雜交水稻均取得巨大成功，為中國乃至世界的糧食保障做出了巨大貢獻；魚類中也開展了雜交F1的制種工作并獲得了可喜成就，如澳大利亞銀鱸Bidyanus bidyanus 的種間雜交Murray River×Cataract Dam 獲得的MC 雜交種具有顯著的生長優(yōu)勢[13,14]；尼羅羅非魚Oreochromis niloticus × 薩羅羅非魚Sarotherodon melanotheron有較高的耐鹽性能[15]。

本團隊前期經過連續(xù)兩年的池塘生長對比實驗發(fā)現，以達里湖鯽和人工選育紅鯽制備的雜種F1優(yōu)勢相對穩(wěn)定，這與兩個親本的種質相對比較“純”有直接關系。達里湖鯽親本是由野生親本經人工馴養(yǎng)后構建的自交家系，紅鯽則是人工選育品種。為了更好地度量雜交子代的生產性能，本研究測定了其生長、潛在免疫力以及耐高堿等性狀的相關指標，并用單因素變量、主成分以及多因素線性回歸等統(tǒng)計方法進行了深入剖析。

從7 個表型和血液生理指標的相關性分析（表1）可以看出，MDA 和Ammonia-N 及Urea-N 之間存在顯著的正相關，而AKP 與Ammonia-N 及Urea-N之間存在顯著的負相關。該結果與個體堿耐受能力測定結果相一致：耐堿存活個體的AKP 含量顯著高于死亡個體，而MDA、Ammonia-N 及Urea-N 含量顯著低于死亡個體；TSOD 與MDA 呈正相關，間接影響個體的堿耐受力，而BW 和CAT 活性則對子代耐堿能力強弱無明顯影響。主成分分析提取到了3個主成分，累計貢獻率高達81.4%，較好地反映了影響雜交鯽耐高堿的大部分信息，進一步驗證了單因素相關性的分析結果。

多因素Logistic 模型預測分析表明：MDA、Ammonia-N 和Urea-N 對雜交子代的耐堿能力具有顯著的負調控作用，而AKP 的正調控作用更明顯，其在存活/死亡個體中的占比達到1.758∶1，遠高于其他指標。進一步的預測能力檢測顯示，本研究采用的以50%存活或死亡為基準的判定方法的假陽性率低，正確率和特異性都在90%以上，表明此方法的可信度高。

綜上，無論從單因素、主成分還是多因素線性回歸分析來看，鯽雜交子代的生長與堿耐受力無顯著關聯(lián)，而潛在免疫力指標及氨氮含量與魚類的耐堿能力相關性顯著，MDA、Ammonia-N 和Urea-N 為負調控，AKP 為正調控。

3.2 耐鹽堿魚類血液生理適應性機制

排氨是魚類必需的生理過程。環(huán)境中高pH 或高氨濃度使魚體內正常的“血液-水”的NH3擴散梯度下降或逆轉，血液和組織內氨大量積累，導致魚類死亡[16]。但是，在許多高鹽堿湖泊，仍有一些魚類存活并繁衍生息。如肯尼亞馬加迪湖（Lake Magadi,pH 10）的馬加迪羅非魚Oreochromis alacalicus grahami[17]、美國內華達州皮拉米德湖（Pyramid Lake,pH 9.4）的鉤吻鱒Oncorhynchus clarki henshawi[18]、土耳其凡湖（Lake Van，pH 9.8）的卡拉白魚Chalcalburnus tarichi[19]、我國青海湖（pH9.1～9.5）的裸鯉Gymnocypris przewalskii[20]和內蒙古達里湖（pH 9.6）的瓦氏雅羅魚[21]等。

耐鹽堿魚類通常能夠耐受較高的氨氮含量，如馬加迪羅非魚LC50的氨氮含量是其他常規(guī)硬骨魚類的6 倍；卡拉白魚血液氨氮含量高達1 300 μmol N/L，遠高于虹鱒400μmol N/L[11]。這些耐鹽堿魚類是如何解決高鹽堿環(huán)境下的排氨難題呢？據報道，耐鹽堿魚類具有特殊的氨氮排泄機制：一是血液中的高氨氮含量有助于“血液-水”的氨分壓梯度（ΔPNH3），使魚體內氨持續(xù)外泄[11]；二是將過多的氨氮轉換成毒性較弱的游離氨基酸或尿素排出體外，如隨著堿度的升高，達里湖瓦氏雅羅魚血漿游離氨基酸含量顯著增加，其中非必需氨基酸含量作為能量代謝底物增加更為明顯[22]；三是氨氮排泄基因顯著富集表達，如達里湖瓦氏雅羅魚和鯉Cyprinus carpio 鰓組織中參與魚體排氨過程的4 種Rh 基因（Rhag，Rhbg，Rhcg1 和Rhcg2），全部富集上調表達[23-25]。本研究中，高堿脅迫下存活個體的氨氮含量顯著低于死亡個體（表2），即存活雜交個體獲得了母本達里湖鯽的氨氮排泄策略（同瓦氏雅羅魚），或將體內多余的氨氮轉換為毒性較弱的尿素和游離氨基酸，或通過高表達排氨氮基因將體內的氮代謝廢物排出體外，適應高堿環(huán)境。

AKP 是衡量機體免疫機能和健康狀況的重要指標，可將代謝產物水解成磷酸和乙醇，然后將這些生成的小分子物質排出體外[26]。已有研究發(fā)現，青海湖裸鯉[27]、文昌魚Branchiostoma lanceolatum[28,29]、中國明對蝦Fenneropenaeus chinensis[30,31]、草魚Ctenopharyngodon idellus[32]等受到鹽堿、pH、化學藥物及重金屬等因子脅迫時，魚體會提高AKP 酶活性以適應不良環(huán)境，這與本研究結果一致。由此可看出，AKP 可以作為魚類鹽堿耐受能力的一個重要預測指標，即AKP 活性高的個體，鹽堿耐受力高，這可能是耐鹽堿個體通過加強AKP 酶的去磷酸化反應，參與代謝產物的降解及調節(jié)Na+/K+-ATP 活性[33,34]，維持體內穩(wěn)態(tài)適應高鹽堿環(huán)境。