miR-125b-5p對喉鱗狀細胞癌細胞能量代謝及增殖的影響

陳永果 邢軍

作者單位：274400 菏澤 1曹縣人民醫(yī)院耳鼻喉科；250117 濟南 2山東省腫瘤醫(yī)院放療科

喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是喉癌最常見的病理類型，約占頭頸部細胞癌的25%［1］。手術(shù)切除是早期LSCC最有效的治療方式，目前缺乏早期診斷的生物標志物，易誤診為晚期癌癥轉(zhuǎn)移，5 年生存率不理想［2-3］。微小 RNA（miRNA）是內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，廣泛參與細胞增殖、分化、遷移、轉(zhuǎn)化和凋亡［4-6］。如miR-503通過靶向程序性細胞死亡蛋白4促進LSCC的發(fā)生［7］；miR-26b通過靶向ATF2抑制喉癌的順鉑耐藥。miRNAs可能是LSCC發(fā)生和治療的新靶點［8］。糖酵解過程需要表達幾種負責將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸的酶，己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）是其一［9-11］。miR-125b-5p 在HK2的3'-UTR處存在結(jié)合位點［12］，HK2可能在糖酵解中發(fā)揮關(guān)鍵功能，在癌細胞能量代謝中發(fā)揮重要作用。本研究通過檢測miR-125b-5p在LSCC細胞中的表達和功能，并分析HK2的調(diào)節(jié)作用，旨在探討miR-125b-5p對LSCC能量代謝和增殖的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

LSCC細胞系和人正常支氣管上皮細胞系購自美國 Sciencell公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-125b-5p模擬物和模擬對照miRNA（5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'）購自中國銳博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司；miRNeasy Mini試劑盒購自美國Qiagen公司；One Step PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒購自中國Takara公司；抗HK2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；葡萄糖攝取比色測定試劑盒和乳酸鹽比色測定試劑盒購自美國Milpitas公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 LSCC細胞和人正常支氣管上皮細胞置于Dulbecco改良的含10%胎牛血清Eagle培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2中培養(yǎng)。實驗分為miR-125b-5p轉(zhuǎn)染組（miR-125b-5p模擬物轉(zhuǎn)染LSCC）和對照組（空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LSCC細胞）。取對數(shù)生長期的LSCC細胞置于6孔板中培養(yǎng)。孵育過夜后，將miR-125b-5p模擬物和模擬對照miRNA經(jīng)Lipofectamine 2000根據(jù)制造商的說明將miRNA轉(zhuǎn)染到LSCC細胞中。轉(zhuǎn)染12 h后，用含10%FBS的新鮮DMEM替換培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，細胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)環(huán)境為100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、含5%CO2的37°C濕潤環(huán)境。

1.2.2 RT-qPCR檢測LSCC細胞miR-125b-5p的表達水平 采用miRNeasy Mini試劑盒從LSCC細胞系中提取miRNA。使用NanoDrop-2000分光光度計測量RNA的濃度，將miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用ABI7500實時PCR系統(tǒng)進行RT-qPCR。PCR擴增反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 10 μL，Primer set 1 μL，probe 0.4 μL，cDNA 8.6 μL。PCR 擴增條件為：95.0 ℃3 min，95.0 ℃ 12 s，62.0 ℃ 40 s，95.0 ℃ 12 s，循環(huán)40次。以β-actin為內(nèi)參對照。采用2-ΔΔCt法分析miR-125b-5p的相對表達水平。miR-125b-5p的RT-qPCR引物序列：Forward primer（5'-3'）為TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA；Reverse primer（5'-3'）為 AGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC。β-actin的RT-qPCR引物序列：Forward primer（5'-3'）為 TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC；Reverse primer（5'-3'）為 CCAGTGCAGGGTCCGAGGT。

1.2.3 CCK-8實驗檢測LSCC細胞的增殖能力 將miR-125b-5p轉(zhuǎn)染組和對照組細胞接種于96孔板中，每孔 1 000 個細胞。分別在 0 h、24 h、48 h、72 h 和96 h時間點用CCK-8測定LSCC細胞的活力。向培養(yǎng)基中加入10 μL CCK-8試劑，并在37℃下再孵育2 h。用酶標儀檢測450 nm處每孔的吸光度（OD）。實驗重復3次取平均值。細胞增殖率的計算公式：細胞活力=［（OD加藥-OD空白）/（OD加藥0-OD空白）］×100%。其中，OD加藥為具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度；OD空白為具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度；OD加藥0為具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度；細胞活力指細胞增殖活力或細胞毒性活力。

1.2.4 平板集落形成實驗檢測LSCC細胞集落形成能力 將miR-125b-5p轉(zhuǎn)染組和對照組的LSCC細胞接種在6孔板中，每孔500個細胞。在37℃下培養(yǎng)2周后，在室溫下用甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色。采用磷酸鹽-鹽水（PBS）洗滌2次，并用顯微鏡計算集落數(shù)。集落抑制率=（1-miR-125b-5p轉(zhuǎn)染組落形成數(shù)/對照組集落形成數(shù)）×100%。

1.2.5 檢測miR-125b-5p與HK2的3'-UTR結(jié)合情況 采用 TargetScan（www.targetscan.org/vert_71/）預測miR-125b-5p的下游靶基因，在HK2的3'-UTR1370-1377的核苷酸處發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p結(jié)合的靶位點（CCUCAGGGA）。為檢測HK2是否是miR-125b-5p的功能靶標，通過在miR-125b-5p轉(zhuǎn)染組或?qū)φ战M下轉(zhuǎn)染野生型和突變體（3'-UTR mut）并進行熒光素酶報告基因測定。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測LSCC細胞的凋亡情況 將miR-125b-5p轉(zhuǎn)染組和對照組的細胞轉(zhuǎn)染48 h后，通過離心獲取細胞并用預冷PBS洗滌2次。用1×膜聯(lián)蛋白結(jié)合劑將細胞沉淀重懸浮。將5 μL膜聯(lián)蛋白V和1 μL碘化丙啶加入100 μL細胞懸浮液中，在室溫下溫育15 min后，將400 μL 1×膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液加入細胞懸液中，用流式細胞儀分析LSCC細胞的凋亡情況。實驗重復3次取平均值。每個樣品隨機計數(shù)4個視野，按公式計算凋亡指數(shù)（AI）。AI=凋亡細胞數(shù)/（凋亡細胞數(shù)+正常細胞數(shù)）。

1.2.7 Western blot檢測LSCC細胞HK2蛋白的表達水平 采用NP-40緩沖液裂解細胞，獲得miR-125b-5p轉(zhuǎn)染組和對照組LSCC細胞的總細胞裂解物。采用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。通過15%SDS PAGE分離每個樣品的20 μg蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h后，將膜與抗HK2 抗體（1∶1 000）一起孵育，保持 2 h。然后用 Tris Bu鹽水和TBST洗滌膜2次。用LI-COR Odyssey成像系統(tǒng)顯現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶。目的蛋白表達水平=目標蛋白的分光管密度/Mark蛋白的密度。

1.2.83H-2DG法測定葡萄糖攝取量 根據(jù)FISCHER等［12］報道，以細胞對3H-2DG攝取量反映葡萄糖的攝取情況。兩組細胞無血清條件下培養(yǎng)24 h后換為低糖DMEM培養(yǎng)液，以1 mol/L異丙腎上腺素、10 mol/L去甲腎上腺素分別刺激細胞48 h，然后加入去甲腎上腺素，在加入藥物同時加入37 kBq/mL3H-2DG，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，20 mol/L細胞松弛素終止反應(yīng)。0.5 mol/L氫氧化鈉裂解細胞15 min后，加入同體積0.5 mol/L鹽酸中和。用BCA法測定蛋白含量，用液閃儀測定加入閃爍液中細胞裂解液的dpm值。不加任何激動劑只加入20 mol/L細胞松弛素培養(yǎng)48 h測得的dpm值為細胞非特異性結(jié)合的放射活性。細胞3H-2DG攝取量=（細胞總放射活性-非特異性結(jié)合的放射活性）/蛋白含量。

1.2.9 乳酸鹽比色測定試劑盒檢測乳酸產(chǎn)量 采用乳酸鹽比色測定試劑盒，通過分光光度計檢測乳酸鹽吸光度，以蒸餾水調(diào)零，比色杯光徑1.0 cm，讀取空白管、對照管、標準管、測定管的340 nm吸光度（OD），2 h內(nèi)檢測完畢。乳酸產(chǎn)量（mmol/g）=［（OD測定-OD對照）/（OD標準-OD空白）］×5/待測樣品蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件（美國IBM公司）進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（χ±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；LSCC細胞系和正常細胞系中的miR-125b-5p表達水平的比較采用配對樣本t檢驗。本研究以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-125b-5p在LSCC細胞系中表達下調(diào)

RT-qPCR實驗結(jié)果顯示，與人正常支氣管上皮細胞相比，miR-125b-5p在LSCC細胞系中的表達降低（0.68±0.03vs0.22±0.05，t=7.025，P=0.001），見圖 1。

圖1 miR-125b-5p的表達水平Fig.1 Expression of miR-125b-5p

2.2 miR-125b-5p的過表達抑制LSCC細胞的增殖能力

CCK-8實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染0 h、24 h和48 h后，miR-125b-5p轉(zhuǎn)染組與對照組細胞增殖能力比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染72 h和96 h后，miR-125b-5p轉(zhuǎn)染組LSCC細胞的增殖能力低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 轉(zhuǎn)染后不同時間LSCC細胞的增殖能力Tab.1 Proliferative ability of LSCC cells at different time after transfection

2.3 miR-125b-5p過表達誘導LSCC細胞凋亡和降低集落形成能力

流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示，miR-125b-5p轉(zhuǎn)染組LSCC 細胞凋亡率高于對照組［（37.52±2.34）%vs（12.46±3.52）%，t=7.025，P＜0.001）］。miR-125b-5p 轉(zhuǎn)染組LSCC細胞的集落形成能力低于對照組（0.29±0.02vs1.02±0.03，t=5.689，P=0.005）。

2.4 miR-125b-5p與HK2的3'-UTR直接結(jié)合

熒光素酶報告基因測定實驗結(jié)果顯示，miR-125b-5p轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性低于對照組（0.32±0.03vs1.01±0.02，t=7.543，P=0.001）。表明 miR-125b-5p與HK2的3'-UTR之間的直接結(jié)合。

2.5 miR-125b-5p過表達抑制LSCC細胞HK2蛋白表達

Western blot實驗結(jié)果顯示，miR-125b-5p轉(zhuǎn)染組miR-125b-5p過表達的LSCC細胞中HK2的蛋白表達水平低于對照組（0.12±0.02vs0.75±0.03，t=5.875，P=0.023），見圖2。表明miR-125b-5p可負調(diào)節(jié)LSCC細胞中HK2的表達。

圖2LSCC細胞HK2蛋白表達Fig.2 Expression of HK2 protein in LSCC cells

2.6 miR-125b-5p過表達抑制LSCC細胞的糖酵解能力

3H-2DG攝取測定法實驗結(jié)果顯示，miR-125b-5p轉(zhuǎn)染組LSCC細胞葡萄糖消耗低于對照組［（3.85±0.86）dpm/mgvs（10.52±1.34）dpm/mg，t=6.118，P=0.005］。miR-125b-5p轉(zhuǎn)染組LSCC細胞的乳酸產(chǎn)生量亦低于對照組［（4.23±1.36）dpm/mgvs（10.96±2.45）dpm/mg，t=5.907，P=0.002］。

3 討論

能量代謝通路紊亂與細胞線粒體功能異常有關(guān)，而乳酸和丙酮酸異常則可能與糖酵解途徑有關(guān)［12-14］。糖酵解的一些代謝中間體也為脂類、氨基酸及其他生物合成提供前體和原料。從氧化磷酸化到癌細胞的有氧糖酵解重新編程，這一獨特的代謝為探索癌癥進展的分子機制提供了新的方向，而參與糖酵解酶的下調(diào)可能是抑制腫瘤發(fā)生的途徑［15］。miRNAs是一類由發(fā)卡結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄物形成的短單鏈非編碼RNA，通過與編碼蛋白mRNA的3'-UTR區(qū)域進行互補結(jié)合，抑制mRNA翻譯或直接導致mRNA降解，負向調(diào)控基因表達。有研究發(fā)現(xiàn)在食管鱗狀細胞癌中miR-125b-5p通過靶向高遷移率族蛋白A2，發(fā)揮腫瘤抑制作用［16］。在膽囊癌中亦發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p的腫瘤抑制作用，且miR-125b-5p表達上調(diào)被認為是該病早期HBV陽性肝細胞癌的新型生物標志物［17］。miRNA參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于人正常支氣管上皮細胞，LSCC細胞中miR-125b-5p的表達下調(diào)，且過表達miR-125b-5p可抑制LSCC細胞活力和細胞集落形成能力，并誘導細胞凋亡，進一步分析發(fā)現(xiàn)，過表達miR-125b-5p亦可降低 LSCC細胞葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生量，說明miR-125b-5p在喉鱗狀細胞癌中可抑制有氧糖酵解，可能作為抑癌因子發(fā)揮作用。

miRNA在mRNA上的結(jié)合位置主要認為在3'-UTR上，但研究表明，miRNA也能結(jié)合到5'-UTR甚至CDS 區(qū)行使功能［19］。SHIVRAM 等［20］報道，結(jié)合到5'-UTR的miRNA常常起到轉(zhuǎn)錄激活的作用，這有可能是RISC復合物“撐”開了折疊的mRNA，方便轉(zhuǎn)錄起始因子或核糖體進入。因此，miRNA發(fā)揮作用是通過調(diào)控靶蛋白表達和功能進行。研究者已經(jīng)在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)了HK2的過度表達，這與癌細胞的葡萄糖代謝增加有關(guān)［21］。因此，HK2有可能是miRNA調(diào)節(jié)癌癥中糖酵解過程的靶基因，也即HK2是miR-125b-5p靶蛋白。miR-125b-5p抑制糖酵解、抑制增殖能力、促進凋亡和抑制集落的作用很可能是通過下調(diào)HK2而實施。據(jù)報道，在肝癌中miR-199a負調(diào)節(jié)HK2的表達，從而抑制葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生。此外，miR-98通過靶向HK2抑制結(jié)腸癌中的Warburg效應(yīng)。在本研究中，過表達miR-125b-5p亦抑制了LSCC細胞中HK2蛋白的表達，與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p可能通過靶向HK2并負調(diào)節(jié)HK2表達，從而降低LSCC細胞糖酵解，抑制細胞生長，誘導細胞凋亡，miR-125b-5p有望成為治療LSCC的潛在治療靶點。