COPD不同時(shí)期誘導(dǎo)痰中IL-8、IL-17、PMN表達(dá)水平的差異及臨床意義

全 斌，段 純，秦立龍，喻艷林，王 妮，魯 俊

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 a.感染性疾病科;b.呼吸內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 全科醫(yī)學(xué)科，安徽 蕪湖 241000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD) 是呼吸系統(tǒng)最常見(jiàn)的慢性疾病之一，全球每年有275萬(wàn)人因COPD而死亡，病死率位居所有死亡原因的第3位，且發(fā)病率及病死率仍逐年升高[1]。COPD按病程可分為兩期:①急性期，在短期內(nèi)出現(xiàn)咳嗽、咳痰、喘悶加重、痰量增多，膿性或黏液膿性痰，可伴有發(fā)熱等炎癥明顯加重癥狀;②穩(wěn)定期，是指咳嗽、咳痰、氣短等癥狀穩(wěn)定或癥狀輕微[2]。 COPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前研究多側(cè)重于監(jiān)測(cè)炎性因子在患者血液中的變化，不能直接反映氣道炎癥水平。而誘導(dǎo)痰術(shù)是一種安全、有效、簡(jiǎn)便、可重復(fù)性強(qiáng)的檢測(cè)方法，其為自然狀態(tài)下的氣道分泌物，具有更集中的細(xì)胞和生化物質(zhì)成分，近些年來(lái)誘導(dǎo)痰術(shù)在慢性氣道炎癥機(jī)制研究中越來(lái)越受重視[3]。本研究檢測(cè)COPD患者誘導(dǎo)痰中白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)、中性粒細(xì)胞(PMN)表達(dá)情況，以闡明氣道炎性因子在COPD不同時(shí)期的免疫機(jī)制，并探討炎性因子在評(píng)估患者病情和預(yù)后中的應(yīng)用價(jià)值，為COPD 防治感染尋找新的治療靶點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 2016年9月～2018年9月在弋磯山醫(yī)院和皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院接受診療的80例COPD患者作為研究對(duì)象(急性期、穩(wěn)定期的COPD各40例);其中COPD急性期患者中男22例，女18例，年齡56.1～75.7歲，平均(65.93±10.85) 歲，26例患者有吸煙史；COPD穩(wěn)定期男23例，女17 例，年齡56.3～75.3歲，平均(65.71±10.01) 歲，27例有吸煙史；并以同期40例體檢者作為對(duì)照組，男21例，女19 例，年齡55.1～74.5歲，平均(64.74±9.75) 歲，24例有吸煙史。3組間的性別、年齡、吸煙史等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。COPD的診斷以及分期判斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制訂的“慢性阻塞性肺疾病診治指南”[2]。肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張、支氣管哮喘、肺癌等其他慢性呼吸系統(tǒng)疾病以及全身炎性疾病等除外。研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均獲得知情同意。

1.2 誘導(dǎo)痰的采集和處理

1.2.1 采集操作過(guò)程 ①霧化前清水漱口、擤鼻;②誘導(dǎo)前10 min讓患者吸入沙丁胺醇200～400 μg;③3%高滲鹽水超聲霧化吸7 min，用力咳痰至無(wú)菌培養(yǎng)皿；若患者無(wú)痰或痰量不足則梯度增加鹽水濃度，直到患者能咳出深部的痰液。痰誘導(dǎo)以7 min為間隔，總時(shí)間≤21 min。

1.2.2 誘導(dǎo)痰的處理 將合格痰液標(biāo)本加入4倍體積的0.1%二硫蘇糖醇充分混合，37℃恒溫培養(yǎng)30 min、震蕩、稀釋、離心后取上清，置于-80℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.3 血清的采集和處理 清晨采集研究對(duì)象空腹靜脈血4 mL，迅速離心分離血清，置于-80℃冰箱保存。

1.4 IL-8、IL-17水平的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)集中測(cè)定誘導(dǎo)痰IL-8、IL-l7濃度，IL-8試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司，IL-17試劑盒購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技公司，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下依序測(cè)定吸光度，計(jì)算IL-8、IL-17的濃度值。所有操作均嚴(yán)格執(zhí)行各自產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1.5 痰液PMN計(jì)數(shù)檢測(cè) 在光學(xué)顯微鏡下直接計(jì)數(shù)500 個(gè)誘導(dǎo)痰液沉淀細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi),包括PMN、嗜酸粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞等。

1.6 BODE評(píng)分 按照Celli設(shè)計(jì)的BODE 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)40例穩(wěn)定期COPD患者進(jìn)行評(píng)分[4]。B為體質(zhì)量指數(shù)，O是氣流阻塞，D是呼吸困難，E是運(yùn)動(dòng)能力。BODE評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：總分為0～10分;0～2分為1級(jí),3～4分為2級(jí),5～6分為3級(jí),7～10分為4級(jí)，見(jiàn)表1。

表1 BODE 指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

項(xiàng)目0分1分2分3分BMI/(kg/m2)>21≤21--FEV1%pred≥6550～6436～49≤35MMRC/級(jí)0～12346MWD/m≥350250～349150～249≤149

注：-表示此項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(q檢驗(yàn))；兩變量間采用直線(xiàn)相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組研究對(duì)象誘導(dǎo)痰中IL-8、IL-17和PMN的表達(dá)水平的對(duì)比 見(jiàn)表2。COPD在急性期的誘導(dǎo)痰中IL-8、IL-17和PMN與穩(wěn)定期組相比均升高(P<0.05)；另外COPD穩(wěn)定期的患者誘導(dǎo)痰中IL-8、IL-17和PMN水平高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 3組研究對(duì)象誘導(dǎo)痰中IL-8、IL-17和PMN的表達(dá)

組別nIL-8/(ng/L)IL-17/(ng/L)PMN/%急性期40121.18±17.9873.80±8.0159.43±8.63穩(wěn)定期4092.20±7.09?41.61±6.32?52.43±6.59?健康對(duì)照組4060.69±6.56?#22.86±8.21?# 37.74±9.61?#F263.658464.43070.087P<0.001<0.001<0.001

注：*與急性期COPD患者比較，P<0.05；#與穩(wěn)定期COPD患者比較，P<0.05。

2.2 3組研究對(duì)象血清和誘導(dǎo)痰中IL-8、IL-17的對(duì)比 見(jiàn)表3。對(duì)于COPD患者除穩(wěn)定期的IL-17外，誘導(dǎo)痰中炎性因子水平均高于血清檢測(cè)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 3組研究對(duì)象誘導(dǎo)痰、血清中IL-8、IL-17水平的比較

IL-8/(ng/L)誘導(dǎo)痰血清tPIL-17/(ng/L)誘導(dǎo)痰血清tP急性期121.18±17.98110.10±19.007.273<0.00173.80±8.0166.46±12.204.910<0.001穩(wěn)定期92.20±7.0977.98±13.486.762<0.00141.61±6.3238.91±10.291.9840.054健康對(duì)照組60.69±6.5657.65±11.901.7960.08022.86±8.2124.48±8.891.7650.085

2.3 穩(wěn)定期COPD 患者誘導(dǎo)痰中IL-8、IL-17、PMN的表達(dá)水平與 BODE指數(shù)的相關(guān)性 COPD 穩(wěn)定期患者誘導(dǎo)痰 IL-8、 IL-17、PMN與 BODE指數(shù)均呈正相關(guān)(r=0.804、0.742和0.637，P<0.001)。見(jiàn)圖1～3。

圖1 穩(wěn)定期COPD誘導(dǎo)痰中IL-8與BODE 指數(shù)的關(guān)系

圖2 穩(wěn)定期COPD誘導(dǎo)痰中IL-17與BODE 指數(shù)的關(guān)系

圖3 穩(wěn)定期COPD誘導(dǎo)痰中PMN百分比與BODE指數(shù)的關(guān)系

2.4 誘導(dǎo)痰中IL-8與IL-17的相關(guān)性分析 COPD急性期、穩(wěn)定期和健康對(duì)照誘導(dǎo)痰中IL-8與IL-17的水平均呈正相關(guān)(r=0.795、0.826 和0.361，P<0.05)。

3 討論

COPD的病理特征是多種炎性因子參與的慢性氣道炎癥，PMN的活化和聚集是 COPD 炎癥過(guò)程中一個(gè)重要環(huán)節(jié)[5]。通過(guò)表1我們可知PMN為COPD患者痰液中的主要炎癥細(xì)胞，當(dāng)COPD處于急性期時(shí)誘導(dǎo)痰中PMN(59.43±8.639)%不僅高于健康對(duì)照組，也要高于穩(wěn)定期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PMN是炎癥部位的“第一反應(yīng)者”，在人類(lèi)先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。趨化作用是指白細(xì)胞(主要為PMN)沿某些化學(xué)刺激物濃度梯度作定向移動(dòng)，這些化學(xué)刺激物稱(chēng)為趨化因子，這也是機(jī)體調(diào)節(jié)PMN的募集主要機(jī)制[6]。 本課題組比較了COPD不同時(shí)期誘導(dǎo)痰中IL-8和IL-17表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示急性期患者誘導(dǎo)痰液中IL-8、IL-17的含量均高于穩(wěn)定期組(P<0.05)，說(shuō)明IL-8、IL-17參與了COPD急性發(fā)病的炎性損傷過(guò)程。 IL-17是由活化的CD4+T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞產(chǎn)生的一種前炎癥細(xì)胞因子，與慢性氣道炎癥性疾病的關(guān)系密切[5]。 IL-17能誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生抗菌肽和大量趨化因子如IL-8、TNF-α、粒細(xì)胞集落刺激因子與黏附因子等，從而促進(jìn)炎癥狀態(tài)下的PMN在氣道的募集[7]。IL-17促使PMN分泌彈性蛋白酶，誘發(fā)支氣管痙攣；增加CD8+T細(xì)胞在氣道壁表達(dá)，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟，造成氣道損傷重構(gòu)；另外IL-17還能與多種細(xì)胞因子產(chǎn)生協(xié)同作用以放大氣道炎癥效應(yīng)[8]。1986年Kownatyki首先發(fā)現(xiàn)IL-8，最初稱(chēng)為單核細(xì)胞衍生PMN趨化因子。IL-8未受到刺激時(shí)可無(wú)表達(dá)或少量表達(dá),但在細(xì)菌、病毒、低氧、過(guò)氧化物等刺激后可大量產(chǎn)生。單核細(xì)胞是IL-8的主要來(lái)源,另外內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等都有IL-8信使轉(zhuǎn)錄RNA(mRNA)的表達(dá)。 IL-8對(duì)PMN 的趨化作用顯著，可促進(jìn)激活后的PMN 和內(nèi)皮細(xì)胞黏附，并誘導(dǎo)PMN脫顆粒，釋放彈性蛋白酶、膠原酶、組織蛋白酶等引起肺毛細(xì)血管、肺泡等損傷，此外其還可通過(guò)抑制凋亡增加粒細(xì)胞的數(shù)量而加重肺損傷[9]。

與Garcia-Rio的研究結(jié)果[10]相似，通過(guò)表2我們也發(fā)現(xiàn) COPD 即使處于穩(wěn)定期其誘導(dǎo)痰中IL-8、IL-17和PMN也未降至正常水平,這種高水平的IL-8、IL-17和PMN提示COPD在穩(wěn)定期仍存在持續(xù)高表達(dá)狀態(tài)的氣道炎癥，持續(xù)的氣道炎癥可能會(huì)導(dǎo)致患者肺功能、生活質(zhì)量的下降及病程的不斷進(jìn)展與加重，這也是COPD遷延不愈的重要原因。BODE指數(shù)作為一種新的評(píng)估 COPD 患者病情及預(yù)后的多維分級(jí)系統(tǒng)，涵蓋了功能性指標(biāo)與生理學(xué)指標(biāo)。 BODE指數(shù)得分越高，代表病情越嚴(yán)重，預(yù)后越差。COPD不僅是一種以不完全可逆性氣流受限為特征的氣道疾病，更是一種伴隨全身不良效應(yīng)的系統(tǒng)性疾病，全身效應(yīng)的出現(xiàn)已被證實(shí)與血液中炎性因子濃度增高、活化等有關(guān)。而在我們的研究中發(fā)現(xiàn)了COPD 穩(wěn)定期誘導(dǎo)痰中IL-8、IL-17和PMN水平越高BODE指數(shù)評(píng)分也越高，且呈中等以上程度的正相關(guān)性(P<0.05)。因此痰液中炎性因子水平也可作為評(píng)估COPD全身效應(yīng)嚴(yán)重程度和預(yù)后的有效指標(biāo)[8]。

最后本研究還發(fā)現(xiàn)COPD兩個(gè)時(shí)期內(nèi)誘導(dǎo)痰中IL-8 與 IL-17均呈正相關(guān)性(急性期r=0.795，P<0.05，穩(wěn)定期r=0.826，P<0.05)，說(shuō)明兩者存在一定相關(guān)性，這可能與IL-17 誘導(dǎo) IL-8有關(guān)。IL-17可觸發(fā)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，產(chǎn)生一氧化氮等，這些自由基可增加IL-8 mRNA，導(dǎo)致IL-8蛋白的表達(dá)[7]，因此IL-17對(duì)PMN的趨化、活化作用是間接的，是通過(guò)介導(dǎo)IL-8來(lái)完成的。未來(lái)進(jìn)一步研究氣道炎性因子的產(chǎn)生及其生物活性，通過(guò)抑制1L-8、IL-17的產(chǎn)生或者切斷IL-17對(duì) IL-8的誘導(dǎo)作用，可為COPD 的治療提供一個(gè)新的方向。例如近期Anzalone等[7,11]研究表明由抗膽堿能藥物如噻托溴銨處理后的人支氣管上皮細(xì)胞，催化組蛋白H3的Lys14發(fā)生乙?；?，支氣管細(xì)胞染色質(zhì)重塑，導(dǎo)致IL-17活性下降，其誘導(dǎo)的IL-8也相應(yīng)減少，因此具有降低氣道炎癥，延緩肺功能惡化的作用。

綜上所述，COPD 是以PMN浸潤(rùn)為主的氣道非特異性炎癥。PMN在內(nèi)源性趨化因子IL-8 等作用下，通過(guò)促炎因子IL-17 等調(diào)控，聚集于氣道，導(dǎo)致急性期的肺組織損傷，另外它們還參與了穩(wěn)定期的氣道重塑、慢性炎癥，貫穿COPD 病程始終。因此監(jiān)測(cè)COPD誘導(dǎo)痰中IL-8、IL-17、PMN的變化，不僅對(duì)病情評(píng)估、療效評(píng)價(jià)有重要的臨床價(jià)值，還可為“靶向”藥物的研究提供理論基礎(chǔ)，為未來(lái)COPD的治療提供新的選擇。