CRM1選擇性抑制劑KPT-330對急性白血病細胞凋亡的誘導(dǎo)作用及分子機制

韋巖

【摘要】 目的：探討CRM1選擇性抑制劑KPT-330對急性白血病細胞凋亡的誘導(dǎo)作用及分子機制。方法：培養(yǎng)白血病K562細胞株，分為對照組（n=20）與KPT-330處理組（n=40）采用CCK-8實驗檢測KPT-330對K562細胞增殖的影響，流式細胞儀法測定K562細胞凋亡及細胞周期，Real-time PCR法檢測CRM1與Caspase-3 mRNA表達量。結(jié)果：在K562細胞中CRM 1呈高表達，KPT-330可呈劑量依賴性地抑制K562細胞增殖且促進細胞凋亡，使G2期細胞減少，subG1期細胞增多，造成細胞周期紊亂。KPT-330可呈劑量依賴性下調(diào)CRM1表達，同時上調(diào)Caspase-3表達。結(jié)論：CRM 1選擇性抑制劑KPT-330可以明顯促進白血病細胞凋亡，同時抑制其增殖，可能與活化Caspase-3相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 核轉(zhuǎn)運蛋白; KPT-330; 急性白血病; 細胞增殖; 細胞凋亡; 分子機制

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.22.028 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2019）22-00-03

急性白血?。╝cute leukemia，AL）是一種常見的血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，是由于造血干細胞異常分化造成患者血液內(nèi)或骨髓白血病細胞大量增生，影響正常造血功能，浸潤至其他組織器官，嚴重威脅患者的生命健康[1]。AL的具體發(fā)病機制尚未十分清楚，可能由多種因素、環(huán)節(jié)及調(diào)控分子參與造成，因此急性白血病的相關(guān)分子機制仍是亟待解決的問題[2]。核轉(zhuǎn)運信號蛋白1（chromosome region maintenance 1，CRM1），又稱為染色質(zhì)區(qū)域穩(wěn)定蛋白1，可以參與腫瘤抑制蛋白、生長調(diào)控蛋白的核輸出[3]。研究發(fā)現(xiàn)，CRM1在較多種實體腫瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中表達增高，如肺癌、腎癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、急性髓系白血病等，同時關(guān)系到腫瘤患者的預(yù)后，因此，CRM1可能成為腫瘤靶向治療的候選靶點之一[4-5]。KPT-330是CRM1選擇性抑制劑中的一種，具有較好的抗腫瘤活性，對于正常細胞的毒性極低，且口服生物利用度較高，但其在急性白血病中的作用機制鮮有研究[6-7]。本文旨在探討CRM1選擇性抑制劑KPT-330對急性白血病細胞凋亡的誘導(dǎo)作用及分子機制，為急性白血病的臨床治療提供更多依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

標本來源：選取2018年1-12月于筆者所在醫(yī)院初發(fā)未治療的AL患者40例作為KPT-330處理組，男23例，女17例;年齡16～62歲，平均（40.55±7.89）歲。選擇同期的正常造血干細胞提供者20例作為對照組，男12例，女8例;年齡18～64歲，平均（41.23±8.05）歲。

白血病細胞株：購自美國ATCC實驗室;RPMI 1640培養(yǎng)基：Gibco-BRL公司;胎牛血清：美國Gibco公司;TransStart First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Top Green qPCR SuperMix：全式金生物科技有限公司;DMSO（二甲基亞砜）與Trizol：美國Sigma公司;RIPA裂解液：碧云天生物技術(shù)有限公司;KPT-330：Selleck科技有限公司;CCK-8檢測試劑盒：同仁化學(xué)研究所。細胞周期檢測試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司;Annexin V染色試劑盒：美國BD公司;ABI 7500型real time PCR儀：美國Applied Biosystem公司;超凈工作臺：中國上海博訊實業(yè)有限公司;3366型二氧化碳培養(yǎng)箱：美國Forma Scientific公司;ST-16 R型高速離心機：美國Thermo公司;THERMO LABSYSTEM MK3酶標儀：美國Thermo公司;PCRYINWU流式細胞儀：美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人紅白血病細胞K562用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，鋪滿培養(yǎng)瓶約85%時，用胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)研究。

1.2.2 細胞增殖檢測 將K562細胞按每孔1×105的密度接種于96孔板中培養(yǎng)，24 h后分別給予0.2、1.0 μmol/L KPT-330（以DMSO溶解稀釋）處理細胞，培養(yǎng)24 h后設(shè)立DMSO為正常對照組，每孔中加入10 μl CCK-8試劑，培養(yǎng)于37 ℃繼續(xù)孵育2～4 h。用僅加入培養(yǎng)基和CCK-8試劑的空白孔調(diào)零。應(yīng)用全自動酶標儀于波長450 nm處測定吸光度值。每組設(shè)定6個平行孔，獨立重復(fù)3次。細胞存活率按公式計算：細胞存活率（%）=A實驗/A空白×100%。半抑制濃度（IC50）由對數(shù)增殖曲線計算得出。

1.2.3 細胞凋亡檢測 分別取對數(shù)生長期的三組K562細胞，加入KPT-330（0、0.2、1.0 μmol/L）處理細胞，分別收集培養(yǎng)24、48、72 h的細胞進行檢測。具體操作方法參照Annexin V染色試劑盒說明書，每組設(shè)定3個平行對照。

1.2.4 細胞周期檢測 取對數(shù)生長期的K562細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后收集細胞，用磷酸緩沖液洗滌細胞，以1 000 r/min離心5 min，乙醇固定后過夜，加入100 μl磷酸緩沖液混勻，在流式細胞儀上進行細胞周期分析。

1.2.5 Real-time PCR法檢測CRM 1與Caspase-3表達 用Trizol提取總RNA，取1 ?l提取的總RNA，加入3 ml RNase-free水稀釋，分別于260、280、320 nm波長處測定吸光度值。若OD260/OD280比值為1.8～2.2，則表明RNA純度較高。RNA濃度（?g/?l）=（OD260～OD320）×稀釋倍數(shù)×0.04。按照TransStart First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于Applied Biosystems儀上進行擴增與檢測，保存于-20 ℃。按照TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒說明書要求加入反應(yīng)體系，控制反應(yīng)條件，mRNA相對表達量用2-??ct法計算，每個樣品設(shè)三個平行復(fù)孔，引物序列見表1。

1.3 觀察指標

觀察KPT-330對K562細胞增殖的影響，KPT-330處理組與對照組對K562細胞凋亡率與細胞周期的影響及KPT-330處理組與對照組中CRM 1與Caspase-3 mRNA的表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（x±s）表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用F檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRM 1在白血病細胞與正常骨髓細胞中表達水平比較

CRM 1 mRNA在K562細胞中表達的相對定量值（relative quantification，RQ）為0.87±0.09，呈較高水平表達。在正常骨髓細胞中表達的相對定量值為0.06±0.02，幾乎不表達。K562細胞中CRM1表達水平顯著高于正常骨髓細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=39.290 8，P<0.05）。

2.2 KPT-330對K562細胞增殖的影響

KPT-330可呈劑量依賴性地抑制K562細胞增殖，IC50值為0.4 μmol/L，見圖1。

2.3 KPT-330處理組與對照組促進K562細胞凋亡比較

分別以0.2 μmol/L與1.0 μmol/L KPT-330處理K562細胞，24、48、72 h后重復(fù)測定細胞凋亡3次，與對照組比較，KPT-330可以明顯促進K562細胞凋亡，較高濃度的KPT-330細胞凋亡率越高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.4 KPT-330對K562細胞周期的影響

分別以0.2 μmol/L與1.0 μmol/L KPT-330處理K562細胞24 h后，與DMSO對照組對比，K 562細胞G2期細胞顯著減少，subG1期細胞增加，隨著KPT-330濃度的增高，K562細胞G2期細胞逐漸減少，細胞周期紊亂顯著，見圖2。

2.5 KPT-330處理組與對照組中CRM1與Caspase-3 mRNA表達水平比較

KPT-330處理組中CRM1 mRNA表達量較對照組顯著下降，Caspase-3 mRNA表達量較對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

3 討論

白血病是因造血干細胞惡性增殖的異質(zhì)性疾病，病因十分復(fù)雜，治療難度大，預(yù)后較差，多發(fā)于兒童，易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后生存率較低，嚴重威脅患者的生命安全[8]。目前，白血病的主要治療方法包括化放療、骨髓移植或靶向治療等，化放療給患者帶來較多不良反應(yīng)與并發(fā)癥，骨髓移植供體來源受限，靶向治療是將藥物與腫瘤細胞特異性結(jié)合，對正常細胞的損傷極低，近年來廣受青睞[9]。CRM1可以轉(zhuǎn)運含有核輸出信號的特異性蛋白出核，在多種腫瘤中均有高表達，選擇性CRM1抑制劑可以不可逆性地抑制CRM1與靶蛋白結(jié)合，使得腫瘤細胞中的特定蛋白恢復(fù)細胞核定位功能，阻止腫瘤抑制因子核輸出，從而抑制癌細胞生長[10-11]。在本研究中，CRM1抑制劑KPT-330可呈劑量依賴性地抑制K562細胞增殖，促進細胞凋亡，同時引發(fā)細胞周期紊亂，提示KPT-330可以顯著抑制白血病細胞增殖，且作用隨著藥物濃度增高而增強，可能與細胞周期紊亂有關(guān)。激活細胞凋亡信號通路是殺滅腫瘤細胞的關(guān)鍵，Caspase在細胞凋亡中起著重要作用，其中Caspase-3是眾多凋亡信號通路的關(guān)鍵會聚點，激活后可誘導(dǎo)細胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的凋亡[12]。在本研究中，KPT-330可呈劑量依賴性上調(diào)Caspase-3表達，下調(diào)CRM1表達，表明KPT-330可能通過激活Caspase-3從而誘導(dǎo)白血病細胞凋亡。

綜上所述，CRM1在急性白血病細胞中呈高表達，選擇性抑制劑KPT-330可通過下調(diào)CRM1表達，促進Caspase-3活化，從而抑制白血病細胞增殖，促進細胞凋亡，為急性白血病的靶向治療提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2019-03-08） （本文編輯：李盈）