基于二氧化鈦/石墨烯納米復(fù)合物的光電化學(xué)適體傳感器測定土霉素

馮 穎，解 芳，廖芳麗，封科軍，劉麗園

(惠州學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院, 廣東 惠州 516007)

土霉素(OTC)是一種四環(huán)素類抗生素，能有效抑制致病微生物感染以及細(xì)菌生長繁殖，因其抗菌性好、成本低，在醫(yī)療衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用。但長期使用抗生素會造成其殘留量增多和在環(huán)境中的累積，增強(qiáng)細(xì)菌、病毒的耐藥性，易引發(fā)公共安全等問題[1-3]。因此，發(fā)展簡單、快速、靈敏、低成本的抗生素檢測方法對環(huán)境監(jiān)測、疾病預(yù)防具有重要意義。

檢測抗生素的常用方法包括高效液相色譜法[4-6]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、酶聯(lián)免疫法[8]等。雖然這些方法精度好、靈敏度高，但儀器昂貴、操作復(fù)雜且耗時(shí)，往往需要專業(yè)的技術(shù)培訓(xùn)，限制了其在實(shí)際中的應(yīng)用。光電化學(xué)檢測是近年發(fā)展起來的基于光電活性材料在光照下產(chǎn)生光電流，因被測物質(zhì)的加入而產(chǎn)生直接或間接的相互作用，從而導(dǎo)致電流信號發(fā)生變化的檢測方法[9]。因其激發(fā)信號(光)與檢測信號(電)相互獨(dú)立，降低了背景，易獲得更高的靈敏度[10]，具有簡單快速、成本低的優(yōu)點(diǎn)，已成功用于蛋白質(zhì)[11]、DNA[12]、細(xì)胞[13]、生物小分子[14]、離子[15]等目標(biāo)物的分析。為了拓寬光電化學(xué)檢測法在實(shí)際中的應(yīng)用，進(jìn)一步提高方法的靈敏度與選擇性仍是光電化學(xué)傳感器亟需解決的問題。通過與其他材料復(fù)合是增加光電轉(zhuǎn)化效率，提高靈敏度的方法之一。鑒于石墨烯優(yōu)異的電子傳導(dǎo)性能、大的比表面積，將其與光電半導(dǎo)體材料復(fù)合有利于提高光電轉(zhuǎn)化效率[9]。適配體(Aptamer)是一種通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)[16]人工合成的單鏈DNA或RNA序列。與抗原、抗體間的相互作用類似，適配體能夠與小分子、細(xì)胞、蛋白質(zhì)等多種目標(biāo)物發(fā)生高親和力作用和特異性識別。同時(shí)較抗體相比，適配體具有易于制備和修飾、成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，因而在生物、環(huán)境分析等領(lǐng)域備受關(guān)注[17-19]。

目前，基于土霉素適配體的光電傳感檢測研究并不多，已有文獻(xiàn)存在材料制備復(fù)雜、成本高等問題[20]。本文一方面采用簡單的電化學(xué)方法構(gòu)建石墨烯復(fù)合的TiO2納米光電傳感界面，利用石墨烯優(yōu)異的電子傳輸性能，降低TiO2光生電子-空穴復(fù)合，以提高光電流響應(yīng);另一方面采用土霉素適配體進(jìn)行特異性識別，構(gòu)建用于土霉素特異性檢測的光電適配體傳感器。本方法成本低、操作簡單快速、靈敏度高、選擇性好，取得了令人滿意的結(jié)果，對于實(shí)現(xiàn)土霉素的快速靈敏檢測具有現(xiàn)實(shí)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

石墨粉(青島富潤達(dá)石墨有限公司)；土霉素(OTC)、金霉素、四環(huán)素(純度大于98%，上海泰坦科技股份有限公司)；鈦酸正丁酯(分析純)、90%(脫乙酰基)殼聚糖(Chitosan,CHIT)、25%戊二醛(GA)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷(純度大于99%)、牛血清白蛋白(純度大于96%，BSA)購自上海麥克林生化科技有限公司；氨基標(biāo)記的OTC適配體序列(5'-NH2-(CH2)6-GGA ATT CGC TAG CAG GTT GAC GTT GAC GCT GGTGCC CGG TTG TGG TGC GAG TGT TGT GTG GAT CCG AGC TCC ACG TG-3')由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其它試劑均為市售分析純，實(shí)驗(yàn)用水為18.2 MΩ·cm的超純水。

CHI600D電化學(xué)工作站(北京華科普天科技責(zé)任有限公司)；KQ5200V超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；TGL-20M臺式高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；GZX-9030MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠)；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器(上海梅香儀器有限公司)；SU8010日立高分辨場發(fā)射掃描電鏡(日本株式會社公司)；Nexus470傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet公司)；HSX-F/UV300氙燈光源(北京紐比特科技有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 土霉素溶液稱取適量OTC用PBS緩沖液(0.1 mol/L KH2PO4-0.1 mol/L Na2HPO4)溶解定容，配成0.01 mol/L OTC溶液作為母液，于-20 ℃避光保存。所需不同濃度的OTC以此逐級稀釋，于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 土霉素適配體(OTC-aptamer)溶液將所購OTC-aptamer(100 mmol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L KCl,1 mmol/L CaCl2,2 mmol/L MgCl2)的鏈序列1 OD，在12 000 r/m下離心，加入適當(dāng)體積緩沖液配成100 μmol/L的貯存液，于-20 ℃冰箱保存。用Tris-HCl緩沖液將貯存液稀釋至1.5 μmol/L，于4 ℃冰箱保存。使用前，在95 ℃加熱5 min后進(jìn)行淬火，自然冷卻至室溫。

1.3 傳感界面的構(gòu)建

1.3.2 FTO導(dǎo)電玻璃的清洗將FTO導(dǎo)電玻璃依次在丙酮、無水乙醇和水中各超聲清洗15 min后，在烘箱中烘干。

1.3.3 TiO2/FTO導(dǎo)電玻璃電極的制備(TiO2/FTO)先用水熱法制備納米TiO2，即在100 mL燒杯中加入30 mL 水，再加入30 mL濃鹽酸，攪拌條件下緩慢加入1 mL鈦酸正丁酯，攪拌30 min后得到混合液。量取適量混合液倒入反應(yīng)釜中，將烘干的FTO導(dǎo)電面朝下插入有混合液的反應(yīng)釜中，蓋緊，放入160 ℃干燥箱中，反應(yīng)6 h。樣品自然冷卻后，用水清洗玻璃，再放入450 ℃馬弗爐中恒溫3 h后，即得到TiO2/FTO導(dǎo)電玻璃電極。

1.3.4 TiO2-石墨烯/FTO納米復(fù)合電極(TiO2-rGO/FTO)的制備將100 mg氧化石墨分散于300 mL水中，超聲分散2 h，得到氧化石墨烯(GO)，并以此作為工作液；用玻璃刀將TiO2/FTO導(dǎo)電玻璃切成1 cm×1 cm，以其作為工作電極，鉑絲為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，采用循環(huán)伏安法( 掃描范圍為-2.5～2.5 V，掃描速率為50 mV·s-1)進(jìn)行電化學(xué)還原，經(jīng)適當(dāng)時(shí)間后，取出工作電極，用水沖洗并吹干，即得到TiO2-rGO/FTO納米復(fù)合電極。

1.3.5 土霉素適配體的固定化修飾在TiO2-rGO/FTO納米復(fù)合材料電極表面滴涂90 μL殼聚糖溶液，在空氣中干燥過夜成膜，用水清洗吹干后，將50 μL稀釋的戊二醛溶液(2.5%)滴涂至修飾電極表面，室溫下放置1 h。清洗并干燥后，滴涂50 μL 1 μmol/L的OTC適配體，在4 ℃冰箱中放置12 h后，用PBS緩沖液洗去未反應(yīng)的OTC適配體，滴加50 μL BSA在37 ℃反應(yīng)1 h，封閉殘留位點(diǎn)，經(jīng)PBS緩沖液沖洗后，即得到土霉素適配體修飾的TiO2/石墨烯復(fù)合材料電極(Aptamer/TiO2-rGO/FTO)。

1.4 OTC的檢測

將制備好的傳感界面(Aptamer/TiO2-rGO/FTO)與50 μL不同濃度 OTC溶液(0.1 mol/L PBS，pH 7.4)在60 ℃下反應(yīng)1 h后，用水清洗。采用150 W氙燈作為激發(fā)光源，在CHI600D電化學(xué)工作站(三電極體系，其中修飾電極為工作電極，鉑絲為對電極，飽和甘汞電極為參比電極)上，選用安培電流時(shí)間曲線法(初始電位-0.1 V，運(yùn)行時(shí)間100 s)記錄OTC反應(yīng)前后的光電流值，以光電流的變化值作為與目標(biāo)物濃度對應(yīng)的信號值。

2 結(jié)果與討論

2.1 光電化學(xué)適體傳感器檢測土霉素的原理

圖1 光電化學(xué)適體傳感器檢測土霉素的實(shí)驗(yàn)原理圖Fig.1 Experimental schematic diagram of photoelectrochemical aptamer sensor for detection of OTC

光電化學(xué)適體傳感器檢測土霉素的實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。實(shí)驗(yàn)采用FTO導(dǎo)電玻璃為基底，在其表面制備了TiO2/石墨烯復(fù)合材料，通過滴涂殼聚糖溶液，使電極表面帶上氨基，通過戊二醛交聯(lián)，使氨基標(biāo)記的土霉素適配體牢固地修飾至電極表面。采用電化學(xué)工作站檢測修飾了土霉素適配體的光電流，此時(shí)得到的光電流為I0。將修飾電極用于某一濃度的土霉素溶液測定時(shí)，土霉素與其適配體發(fā)生特異性結(jié)合形成復(fù)合物，測得光電流值為I。由于目標(biāo)物與適配體的特異性結(jié)合，阻礙了光電傳感界面對光的有效吸收及光生電子的轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致光電流減小，其信號值用ΔI表示，ΔI=I0-I?；陔娏鞯淖兓蹬c待測物土霉素的濃度成正比，從而實(shí)現(xiàn)土霉素的測定。

2.2 納米TiO2與TiO2-rGO復(fù)合材料的掃描電子顯微鏡圖

分別考察了納米TiO2及TiO2-rGO復(fù)合材料的掃描電子顯微鏡圖(SEM，見圖2)。結(jié)果顯示，納米TiO2納米管呈現(xiàn)棒狀，直徑在100 nm左右(圖2A); TiO2-rGO復(fù)合材料的SEM圖則顯示，納米TiO2表面均勻的覆蓋著石墨烯(圖2B)，說明石墨烯與納米TiO2很好的結(jié)合在一起。由于TiO2的帶隙較寬，其電子空穴分離效果較差，而當(dāng)石墨烯和TiO2復(fù)合時(shí)，石墨烯的較高電子傳輸速率特性，使得界面處的電子可及時(shí)從TiO2向石墨烯轉(zhuǎn)移，從而降低TiO2光生電子-空穴復(fù)合，有利于促進(jìn)電子的傳輸，增強(qiáng)光電流響應(yīng)，提高方法靈敏度。

圖3 不同修飾電極的阻抗圖Fig.3 Impedance diagrams of different modified electrodesa.TiO2/FTO，b.TiO2-rGO/FTO，c.FTO，d.Aptamer/TiO2-rGO/FTO，e.OTC/Aptamer/TiO2-rGO/FTO

圖4 不同修飾電極在PBS緩沖液中的光電流強(qiáng)度Fig.4 Photocurrent values of different modified electrodes in PBS buffera.TiO2-rGO/FTO，b.Aptamer/TiO2-rGO/FTO，c.TiO2/FTO，d.Aptamer/TiO2-rGO/FTO reacting with 100 nmol/L OTC

2.3 傳感器的性能表征

2.3.1 不同修飾電極的阻抗分析考察了不同修飾電極(TiO2/FTO、TiO2-rGO/FTO、FTO裸電極、Aptamer/TiO2-rGO/FTO、OTC/Aptamer/TiO2-rGO/FTO)在電解質(zhì)溶液 5 mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6-0.2 mol/L KCl中的交流阻抗圖(如圖3)。根據(jù)圖中的半圓直徑大小，可以比較不同修飾電極的電子傳遞阻力，半徑越大表示阻抗越大。從圖中可以看出，在裸電極上修飾TiO2后，其阻抗值比裸電極小(曲線a、c)，說明TiO2的修飾有利于電子的傳遞；在TiO2/FTO表面通過電化學(xué)法還原氧化石墨烯，得到TiO2-rGO/FTO后，其阻抗值進(jìn)一步減小(曲線b)，這是由于石墨烯優(yōu)異的電子傳輸性能，有利于電子的傳導(dǎo)。而當(dāng)TiO2-rGO/FTO電極結(jié)合適配體后，由于適配體帶負(fù)電荷，對氧化還原電對有排斥作用，阻礙了電子傳遞，因此阻抗增加(曲線d)。在其與目標(biāo)物反應(yīng)后，阻抗進(jìn)一步增加(曲線e)，說明適配體修飾電極通過適配體與目標(biāo)物間的特異性作用已成功捕獲OTC。

2.3.2 不同修飾電極的光電流響應(yīng)圖4為不同修飾電極在相同條件下的光電流響應(yīng)。從圖中可以觀察到，TiO2-rGO/FTO電極產(chǎn)生的光電流明顯大于TiO2/FTO電極產(chǎn)生的光電流(曲線a、c)，這是因?yàn)槭┛焖俚碾娮觽鬏斝阅?，因此可以接收TiO2產(chǎn)生的光生電子并迅速地傳遞到導(dǎo)電基底上，有利于光生電荷與空穴的分離，從而使光電流增大[22]。當(dāng)TiO2-rGO/FTO電極結(jié)合適配體后，所得Aptamer/TiO2-rGO/FTO電極產(chǎn)生的光電流(曲線b)明顯小于TiO2-rGO/FTO電極產(chǎn)生的光電流。這是因?yàn)樾揎椛系膲A基帶負(fù)電，阻礙了光電子的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致光電流變小。當(dāng)Aptamer/TiO2-rGO/FTO電極結(jié)合100 nmol/L OTC后，其光電流進(jìn)一步減小(曲線d)，這是因?yàn)镺TC與其適配體發(fā)生特異性結(jié)合，阻礙了光電子的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致光電流變小。這也進(jìn)一步驗(yàn)證了阻抗譜圖的結(jié)果。

2.4 殼聚糖濃度及GO電化學(xué)還原時(shí)間的優(yōu)化

圖5 殼聚糖濃度對Aptamer/TiO2-rGO/FTO電極光電流的影響Fig.5 Effect of chitosan content on photocurrent value of Aptamer/TiO2-rGO/FTO electrode

合適的殼聚糖濃度有利于提高殼聚糖成膜及穩(wěn)定性，且通過殼聚糖豐富的氨基，采用戊二醛作為交聯(lián)劑，可實(shí)現(xiàn)氨基修飾適配體的固定。因此，本實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度殼聚糖對修飾電極光電流強(qiáng)度的影響。保持其它實(shí)驗(yàn)條件不變，分別向TiO2-rGO/FTO電極表面滴涂0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%的殼聚糖溶液，通過戊二醛交聯(lián)固定1.0 μmol/L適配體，得到Aptamer/TiO2-rGO/FTO電極后，測其在0.1 mol/L PBS中的光電流值(圖5)。從圖可知：光電流值隨著殼聚糖濃度的增大而增大，當(dāng)濃度達(dá)到0.1%后，繼續(xù)增大殼聚糖濃度則其信號降低。這主要是因?yàn)闅ぞ厶沁_(dá)到一定濃度后，電極上修飾的適配體已飽和，繼續(xù)增大殼聚糖濃度，會導(dǎo)致膜厚度增加，不利于電子的傳遞。因此，實(shí)驗(yàn)選擇0.1%作為殼聚糖溶液的最佳濃度。

將TiO2/FTO電極浸入GO溶液中,用循環(huán)伏安法分別電化學(xué)還原不同時(shí)間(100、200、300、400、500 s)后，得到TiO2-rGO/FTO修飾電極，通過測定其在0.1 mol/L PBS溶液中的光電流值，以考察不同還原時(shí)間的影響。結(jié)果顯示，隨著電化學(xué)還原時(shí)間的增加，修飾電極表面還原的氧化石墨烯負(fù)載量增加，光電流響應(yīng)增強(qiáng)，當(dāng)還原時(shí)間為300 s時(shí)，光電流達(dá)到最大值，繼續(xù)增加電化學(xué)還原時(shí)間，光電流值減小。這可能是由于沉積的還原氧化石墨烯量過多，不利于TiO2表面對光的吸收，從而降低了光電流響應(yīng)。因此實(shí)驗(yàn)選擇300 s作為最佳的電化學(xué)還原時(shí)間。

圖6 Aptamer/TiO2-rGO/FTO對不同濃度土霉素的光電流值Fig.6 Photocurrent of different concentrations of oxytetracycline on Aptamer/TiO2-rGO/FTO oxytetracycline concentration(a-h):0，5.0，10 ，50，100,500,1 000,5 000(×10-9 mol/L);insert:linear relationship between photocurrent and concentration of oxytetracycline

2.5 傳感器的線性范圍及檢出限

在上述優(yōu)化條件下，于0.1 mol/L PBS(pH 7.4)緩沖溶液中，考察了適配體復(fù)合納米材料修飾電極(Aptamer/TiO2-rGO/FTO)在不同濃度土霉素溶液中的光電流值(見圖6)，插圖為不同濃度土霉素與光電流響應(yīng)的線性圖，誤差棒來源于3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。由圖可見，在5.0×10-9～5.0×10-6mol/L濃度范圍內(nèi)，傳感器的光電流響應(yīng)與目標(biāo)物濃度呈良好線性，線性方程為：ΔI=-1.020 1C+8.844 5，r=0.988 7，其中ΔI為加入土霉素前后峰電流的差值(μA)，C為土霉素濃度(mol/L)的負(fù)對數(shù)。依據(jù)3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(S/N=3)進(jìn)行計(jì)算，得到此條件下土霉素的檢出限為1.0×10-9mol/L。

將本方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的土霉素檢測方法進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示，該傳感器的線性范圍更寬，檢出限較低，具有更好的性能。

表1 本方法與文獻(xiàn)報(bào)道方法的比較Table 1 Comparison of the proposed detection method with the previously reported works

2.6 傳感器的選擇性

將構(gòu)建的光電傳感器用于與土霉素結(jié)構(gòu)類似的其他抗生素溶液的檢測。與同濃度的土霉素相比，金霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、道諾霉素幾乎均無光電流響應(yīng)。說明構(gòu)建的傳感器具有良好的選擇性。

2.7 傳感器的重現(xiàn)性、重復(fù)性與穩(wěn)定性

制備一支Aptamer/TiO2-rGO/FTO電極，在優(yōu)化條件下，與1.0×10-7mol/L的土霉素反應(yīng)60 min后，在0.1 mol/L PBS(pH 7.4)緩沖溶液中平行測定5次，測定其光電響應(yīng)結(jié)果，計(jì)算出其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%，表明該體系的重現(xiàn)性良好。

圖7 Aptamer/TiO2-rGO/FTO電極光電流的穩(wěn)定性Fig.7 Photocurrent stability of Aptamer/TiO2-rGO/FTO electrode

制備5支Aptamer/TiO2-rGO/FTO電極，使其與1.0×10-7mol/L土霉素反應(yīng)60 min后，在0.1 mol/L PBS(pH 7.4)緩沖溶液中測定其光電響應(yīng)結(jié)果，計(jì)算出其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%，表明該體系的重復(fù)性良好。

制備一支 Aptamer/TiO2-rGO/FTO電極，在0.1 mol/L PBS(pH 7.4)緩沖溶液中測定300 s。如圖7所示，可以看出其光電流基本穩(wěn)定。再制備Aptamer/TiO2-rGO/FTO電極，先測定其在0.1 mol/L PBS(pH 7.4)緩沖溶液中的光電流，放入冰箱中1個(gè)星期，再次測定其光電流，得到的光電流為初始值的82.7%，表明Aptamer/TiO2-rGO/FTO電極的穩(wěn)定性良好。

2.8 實(shí)驗(yàn)室制備樣品的檢測

由于采集的自來水及環(huán)境水樣中均未檢出土霉素，因此通過加標(biāo)回收法對方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行考察。分別向水樣中加入3種不同濃度(20、4.0、2.0×10-6mol/L)土霉素進(jìn)行測試(n=3)，得到樣品的回收率為93.0%～112%。該結(jié)果表明，本方法具有較高的準(zhǔn)確度，有望用于實(shí)際樣品的測定。

3 結(jié) 論

本文在FTO上先后用水熱法及電化學(xué)方法制備了納米TiO2/石墨烯光電傳感基底，比較了單一材料及復(fù)合體系的光電化學(xué)性能。結(jié)合土霉素適配體對土霉素檢測的專一性與光電化學(xué)法的快速、經(jīng)濟(jì)、簡單、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，成功構(gòu)建了一種性能優(yōu)良、穩(wěn)定性可靠、成本低、選擇性好的測定土霉素的光電化學(xué)傳感器，實(shí)現(xiàn)了對水樣中微量土霉素的檢測。在優(yōu)化條件下，該傳感器的線性范圍為5.0×10-9～5.0×10-6nmol/L，檢出限為1.0×10-9mol/L，有望用于實(shí)際樣品中微量土霉素殘留的測定。