磷摻雜碳量子點的制備及其在金絲桃苷檢測中的應用

劉荔貞，李海紅，馮 鋒，米 智*

(1.山西大同大學 化學與環(huán)境工程學院，山西 大同 037009；2.山西師范大學 化學與材料科學學院，山西 臨汾 041004)

碳量子點作為一種新型的納米材料，因具有優(yōu)異的光電性質、低毒性、好的生物相容性、環(huán)境友好性、制備簡單和成本低廉等優(yōu)點[1-2]，受到學術界和工業(yè)界的廣泛關注，在細胞成像[3]、催化[4]、光電器件[5]和傳感[6]等領域得到了廣泛應用。目前碳量子點的制備方法主要有自下而上和自上而下兩種方法。其中自下而上法主要包括電化學腐蝕法、激光消蝕法、溶劑熱解法和電弧煅燒法[7]。自上而下法主要包括水熱合成法、超聲波法、微波法、模板反應法和自催化法[8]。其中，自催化法是一種簡單、快速、高效的碳量子點制備方法，整個合成過程中不需要任何外界條件的輔助。

金絲桃苷(Hyperin，HP)是一種天然的黃酮醇苷類化合物，廣泛存在于金絲桃科、桔?？?、杜鵑花科、薔薇科和葵科等多種植物的果實和全草中。HP因具有消炎、抗氧化、抗腫瘤、抗抑郁和護肝等多種藥理活性[9]而受到廣泛的關注，是多種藥材質量的評價指標。臨床應用結果表明，HP對口腔潰瘍、咳嗽、高血壓和冠心病等疾病有顯著的療效[9]。因此，對HP進行檢測既有重要的理論意義也有臨床應用價值。目前，已報道的HP的檢測方法主要有高效液相色譜法[10]、毛細管電泳法[11]、化學發(fā)光法[12]和電化學法[13]。然而這些方法操作復雜、分析速度慢、成本高、需要昂貴的儀器設備。相比于其它幾種分析方法，熒光分析法不僅快速、成本低，而且具有操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點。本文以五氧化二磷和檸檬酸為原料，采用自催化法快速制備了磷摻雜的碳量子點(P-CDs)，并基于HP對該P-CDs的熒光猝滅作用，建立了一種P-CDs檢測HP的新方法，將其用于實際樣品的分析，結果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Lambda 35紫外-可見光譜儀(美國Perkin Elmer公司)；F-2500熒光光譜儀(日本日立公司)；Tensor-27傅立葉紅外光譜儀(德國布魯克公司)；X射線光電子能譜(美國賽默飛世爾科技公司)；JEOL-2000EX透射電子顯微鏡(日本電子公司)。

P2O5(Sigma試劑公司)；金絲桃苷、大豆苷元、阿魏酸、大黃酸、蘆丁(中國藥品生物制品檢驗所)；C6H8O7(檸檬酸)、HCl、NaOH、CH3OH、KBr、Na2HPO4·7H2O、NaH2PO4·2H2O(天津化學試劑公司)；NaCl、KCl、MgCl2、AlCl3、Zn(NO3)2、FeCl3、CaCl2(北京化學試劑公司)。復方木雞顆粒(丹東制藥有限公司)。所有試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 P-CDs的制備

將0.50 g檸檬酸溶于1 mL超純水中，超聲處理30 min后，快速加入盛有2.50 g P2O5的燒杯中，無需攪拌，整個反應過程在通風櫥中進行。反應結束后，燒杯冷卻至室溫，加入20 mL超純水稀釋，將稀釋后的液體倒入1 000 Da的透析袋中透析24 h，從透析袋中取出含有P-CDs的溶液，冷凍干燥，得到P-CDs固體產品。

1.3 熒光量子產率的測定

1.4 HP的測定

取0.2 mL P-CDs溶液(1.5 mg/mL)于比色皿中，用磷酸緩沖溶液(pH 8.0)稀釋至2 mL,測其熒光強度。然后將不同濃度的HP或樣品溶液加入到比色管中，混合均勻后于室溫下反應10 min，在280 nm激發(fā)波長和390 nm發(fā)射波長下測定熒光強度。計算HP對P-CDs的熒光猝滅率(IF0/IF)，IF0為不加HP時溶液的熒光強度，IF為加入HP后溶液的熒光強度。

2 結果與討論

2.1 P-CDs的表征

圖2 P-CDs的IR圖Fig.2 IR spectrum of P-CDs

圖4A為P-CDs的紫外吸收和熒光光譜圖，其紫外吸收在210、300 nm處有寬的特征吸收峰。在最佳激發(fā)波長280 nm下，P-CDs在310、390 nm處呈現明顯的熒光發(fā)射峰，并在紫外燈照射下發(fā)出明亮的藍色熒光(圖4A插圖)。圖4B為P-CDs在不同激發(fā)波長下的發(fā)射光譜圖，從圖中可以看出，隨著激發(fā)波長的增大，P-CDs的發(fā)射峰發(fā)生紅移。以硫酸奎寧為參比，P-CDs的熒光量子產率為5.78%。

2.2 測定條件的優(yōu)化

2.2.1 P-CDs質量濃度的選擇考察了P-CDs質量濃度(0.04～0.23 mg/mL)對熒光猝滅率(IF0/IF)的影響。如圖5A所示，隨著P-CDs質量濃度的增大，IF0/IF先增大后逐漸減小，當P-CDs為0.15 mg/mL時，HP對P-CDs的熒光猝滅效果最好，所以本實驗選擇P-CDs的質量濃度為0.15 mg/mL。

2.2.2 pH值的選擇考察了在不同磷酸緩沖溶液pH值(2.0～12.0)條件下，HP對P-CDs的熒光猝滅程度。如圖5B所示，隨著pH值的增加，IF0/IF先增大后逐漸減小，pH 8.0時，HP對P-CDs的熒光猝滅程度最大，因此選擇最佳pH值為8.0。

2.2.3 反應時間的選擇考察了不同的反應時間對體系熒光強度的影響。如圖5C所示，在體系中加入HP后，前1 min，體系熒光強度直線急劇下降，此后，隨著時間的增加，熒光強度逐漸減弱，10 min后體系熒光強度幾乎無明顯變化，故本實驗的反應時間選擇10 min。

圖5 P-CDs的質量濃度(A)和pH值(B)對IF0/IF的影響及反應時間對體系熒光強度的影響(C)Fig.5 Effect of P-CDs concentration(A)and pH value(B) on the IF0/IF and the influence of reaction time on the fluorescence intensity of P-CDs(C)

2.3 P-CDs對HP的選擇性

考察了藥物中可能存在的其他成分(大豆苷元、阿魏酸、大黃酸、蘆丁)和常見金屬離子(K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe3+、Zn2+、Al3+)對測定結果的影響，結果如表1所示。在HP濃度為30 μmol/L，相對誤差不超過±5%的條件下，干擾物的濃度10倍于HP時，只有HP能使P-CDs的熒光發(fā)生顯著的猝滅，其它干擾物對P-CDs的熒光有微弱或者可忽略的影響，對測定結果幾乎無干擾。表明P-CDs對HP有好的選擇性。

表1 不同物質對P-CDs熒光的影響Table 1 Effects of different substances on the fluorescence of P-CDs

2.4 P-CDs對HP的響應

在最佳實驗條件下，考察了HP濃度對P-CDs熒光強度的影響。圖6A為加入不同濃度HP后P-CDs的熒光光譜。從圖中可以看出，隨著HP濃度的增加，P-CDs的熒光發(fā)射峰強度逐漸減弱，發(fā)生不同程度的猝滅。圖6B為P-CDs的熒光猝滅率(IF0/IF)與HP濃度的關系圖，如圖所示，HP濃度(c)在0.22～55 μmol/L范圍內與IF0/IF呈良好的線性關系，線性方程為IF0/IF=0.036 1c+1，相關系數r為0.998 3，以LOD=3S/K(S為10個空白測量的標準偏差，K為標準曲線的斜率)計算檢出限(LOD)，該方法的LOD為78 nmol/L。與其它已報道的HP檢測方法比較[11,17-19]，本方法具有好的線性范圍和高的靈敏度。

2.5 熒光猝滅機理

從圖6A中可以看出，隨著HP濃度的增大，P-CDs的熒光強度逐漸減弱，同時最大發(fā)射波長逐漸紅移(從392 nm到440 nm)。從IR和XPS結果可知，合成的P-CDs表面含有大量的羥基和羧基，而HP含有的酚羥基可與P-CDs表面的羥基和羧基以氫鍵的形式結合，使HP和P-CDs通過氫鍵作用形成復合結構，從而使P-CDs的表面發(fā)生改變，進而導致最大發(fā)射波長發(fā)生紅移[20]。同時，由于碳量子點既是好的電子接受體也是好的電子給予體[21]，電子會從受激發(fā)的P-CDs轉移到HP的芳香結構上，發(fā)生有效的非輻射能量轉移，導致P-CDs熒光猝滅[22]。

2.6 實際樣品測定

準確稱取1.00 g的復方木雞顆粒，用甲醇溶解并定至10 mL，超聲30 min，離心(6 000 r/min)15 min，取上清液測定，同時在未被超聲離心處理的樣品溶液中加入標準溶液，進行回收率試驗，結果如表2所示。由表2可知，其加標回收率為93.3%～107%，相對標準偏差(RSD)為1.5%～1.7%。結果表明該方法具有較高的準確度，可以用于實際樣品中HP的測定。

3 結 論

本文合成的P-CDs分散性好，粒徑為5.0～10.2 nm，表面含有大量的羥基、羧基和含磷官能團，具有良好的水溶性。以P-CDs為熒光探針測定HP的方法簡單、快速、選擇性好、靈敏度高，并成功用于實際樣品復方木雞顆粒中HP的測定，結果令人滿意，為含HP類藥物的質控和臨床藥物檢測提供了參考，具有好的應用前景。

表2 樣品測定及回收率實驗(n=5)Table 2 Determination results of HP in samples and recovery of the method(n=5)

*Found=mean±SD