基于揮發(fā)性組分結(jié)合化學計量學方法的鐵觀音烏龍茶和軟枝烏龍茶模式識別分析

晏祥文，鐘一平，呂世懂，孟慶雄

（1.曲靖市糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，云南曲靖655000；2.昆明市糧油飼料產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心，云南昆明 650118；3.昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，云南昆明650500）

烏龍茶，是我國六大茶類中獨具鮮明特色的茶葉品類。烏龍茶是經(jīng)過殺青、萎凋、搖青、烘焙等工序后制出的品質(zhì)優(yōu)異的茶類[1]。烏龍茶綜合了綠茶和紅茶的制法，其品質(zhì)介于綠茶和紅茶之間，既有紅茶濃鮮味，又有綠茶清芬香并有“綠葉紅鑲邊”的美譽[2]。

我國烏龍茶因其不同產(chǎn)區(qū)、加工工藝及風味特征，一般分為福建的閩南烏龍和閩北烏龍、廣東烏龍和臺灣烏龍，其中閩南烏龍和臺灣烏龍的產(chǎn)量相對較大。福建閩南烏龍茶的典型代表是鐵觀音烏龍茶，而臺灣烏龍茶的典型代表是軟枝烏龍茶，這兩種烏龍茶具有一些相似的感官特征，比如色澤、滋味和氣味等。鐵觀音是采用鐵觀音茶樹品種為原料制成，其獨具“觀音韻”，清香雅韻，沖泡后有天然的蘭花香，滋味純濃，香氣馥郁持久，有“七泡有余香之譽”[3]。臺灣軟枝烏龍茶具有典型的花果香味，軟枝茶園均在海拔1 000 多米以上[4]。蔡烈偉等[5]對不同產(chǎn)區(qū)烏龍茶感官品質(zhì)與茶湯化學成分進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)的烏龍茶感官審評得分非常相近，其中特別是閩南烏龍和臺灣烏龍的品質(zhì)最接近，閩南烏龍以滋味品質(zhì)以醇厚甘爽為主，香氣品質(zhì)以清高有花香為主，臺灣烏龍滋味以甘醇鮮爽為主，香氣馥郁有花香。綜上，通過一些儀器分析手段對兩種茶葉進行識別區(qū)分是十分有必要的。

香氣是影響茶葉品質(zhì)的重要因素之一，對茶葉品質(zhì)的貢獻率較高[6]。頂空固相微萃?。╤eadspace solidphase microextraction，HS-SPME）是一種集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體的無任何溶劑的樣品微萃取技術(shù)，比起溶劑萃取法，它能較真實的反映樣品的香氣成分信息，目前被廣泛應(yīng)用于各種食品香氣成分的萃取[7-9]。另外，化學計量學方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種不同產(chǎn)地和類別食品的模式識別分析，它基于數(shù)學、統(tǒng)計學、化學及計算機科學的方法和原理，設(shè)計優(yōu)化試驗，挖掘與處理、分辨與解析試驗量測數(shù)據(jù)的信息，從而獲取復雜分析體系中隱含的有用信息。其中的多類聚類和判別分析方法主要包括主成分分析（principle component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares- discriminant analysis，PLS-DA）、聚類分析（cluster analysis，CA）、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network，ANN）和支持向量機（support vector machine，SVM）等[10-14]。

目前，關(guān)于烏龍茶揮發(fā)性成分的相關(guān)研究已有一些報道，但大多數(shù)停留在單一茶樣、不同工藝或香氣之間的比較研究上[15-17]，對不同品種和不同省份的烏龍茶香氣成分的綜合比較及其模式識別分析方面的研究較少，特別是基于化學計量學來區(qū)分不同省份烏龍茶的研究也鮮有報道。另外，消費者對不同產(chǎn)地烏龍茶的風味品質(zhì)特征雖有一定的了解，但是對其之間的具體品質(zhì)化學成分差異卻不清楚，同時來自于不同產(chǎn)區(qū)但具有相似的品質(zhì)特征的茶葉之間可能還會出現(xiàn)以假亂真、擾亂市場的情況。因此，本研究以這兩種不同產(chǎn)地的烏龍茶為研究對象，采用全自動HS-SPME和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對他們的香氣成分進行研究，并結(jié)合化學計量學方法中的PCA 和PLS-DA 來進行模式識別，以期為烏龍茶的生產(chǎn)加工以及質(zhì)量控制提供一些理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4 種福建鐵觀音茶（編號為FO1-FO4）、3 種臺灣軟枝烏龍茶（編號為TO1-TO3）：云南省茶葉批發(fā)市場，等級為一級，均生產(chǎn)于2017年。

7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配全自動頂空進樣裝置）：美國Agilent 公司；固相微萃取裝置（萃取纖維頭為 65 μm PDMS/DVB）：美國 Supelco 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶葉香氣成分的萃取

茶葉樣品事先粉粹好，過40 目篩。稱取每種茶葉樣品各2.00 g 裝入20 mL 頂空瓶中，然后加入5 mL 燒沸的蒸餾水沖泡，立即密閉瓶口。全自動頂空進樣裝置條件：首先80 ℃保持10 min，然后80 ℃吸附60 min，最后解吸附3.5 min[18]，每個樣品重復測定兩次。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜方法

GC 條件：HP-5MS 彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度為 250 ℃；載氣為高純氦氣，載氣流速為 1.0 mL/min；柱溫條件：50 ℃（5 min），以 3 ℃/min 升至 210 ℃（3 min），再以 15 ℃/min 升至230 ℃（0 min）；不分流進樣模式。

MS 條件：離子源為 EI，離子源溫度 280 ℃，傳輸線溫度290 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500，溶劑延遲時間為2.8 min。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

將GC-MS 分析得到的MS 信息在NIST 08.L 譜庫中進行檢索，以質(zhì)譜匹配度為鑒定結(jié)果，所鑒定出的化合物質(zhì)譜匹配度需高于80%。同時采用峰面積歸一化法進行定量，得到各組分的相對含量。多元統(tǒng)計學方法采用SIMCA-P15 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種烏龍茶香氣成分分析

按照上述的GC-MS 分析條件，分別對4 種福建鐵觀音茶和3 種臺灣軟枝烏龍茶的香氣成分進行分析，它們的總離子流色譜圖如圖1、圖2 所示，香氣成分及其相對含量分析結(jié)果如表1 所示。

圖1 福建鐵觀音烏龍茶（編號FO3）揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in the Fujian Tieguanyin oolong tea（No.FO3）

圖2 臺灣軟枝烏龍茶（編號TO3）揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in the Taiwan Ruanzhi oolong tea（No.TO3）

表1 福建鐵觀音烏龍茶和臺灣軟枝烏龍茶香氣成分分析結(jié)果Table 1 GC-MS analysis results of volatile components in Fujian Tieguanyin oolong tea and Taiwan Ruanzhi oolong tea

續(xù)表1 福建鐵觀音烏龍茶和臺灣軟枝烏龍茶香氣成分分析結(jié)果Continue table 1 GC-MS analysis results of volatile components in Fujian Tieguanyin oolong tea and Taiwan Ruanzhi oolong tea

由表1 可知，在所有的7 個烏龍茶中共鑒定出香氣成分71 種，主要包括醇類、碳氫化合物、酯類、含氮化合物、酮類、內(nèi)酯類等。發(fā)現(xiàn)兩種不同產(chǎn)地的烏龍茶在香氣組成上較為接近，但部分化合物之間還是體現(xiàn)出了一些差異性。當然，即便是產(chǎn)自于同一個省份的烏龍茶，它們之間在原料具體產(chǎn)地、環(huán)境條件、原料選擇上不可能完全一致，所以也體現(xiàn)出了一些差異性。福建鐵觀音烏龍茶中含量最高的有橙花叔醇、吲哚、2-甲基丁酸-2-苯乙酯、α-法呢烯、丁酸苯乙酯、己酸-2-苯乙酯、己酸-3-己烯酯、茉莉內(nèi)酯、植醇、苯乙醇、芳樟醇、依蘭烯、茉莉酮等。臺灣軟枝烏龍茶中含量較高的主要是香葉醇、吲哚、芳樟醇、橙花叔醇、脫氫芳樟醇、α-法呢烯、茉莉內(nèi)酯、咖啡因、茉莉酮、水楊酸甲酯、茉莉酮酸甲酯、苯乙腈、植醇、己酸-3-己烯酯等。

2.2 福建鐵觀音烏龍茶和臺灣軟枝烏龍茶香氣組分對比分析

通過表1 可以發(fā)現(xiàn)，盡管兩種不同產(chǎn)地的烏龍茶在香氣組成上較接近，但他們在香氣成分上還有一定的差異性。福建鐵觀音烏龍茶中橙花叔醇、苯乙醇、（E）-β-法呢烯、（Z，E）-α-法呢烯明顯高于臺灣軟枝烏龍茶，而臺灣軟枝烏龍茶中香葉醇、水楊酸甲酯、順-3-己烯醇苯甲酸酯、茉莉酮酸甲酯明顯高于福建鐵觀音烏龍茶。另外異丁酸苯乙酯、2-甲基丁酸-2-苯乙酯、己酸異戊酯、2-庚醇僅在福建鐵觀音茶中檢出，而δ-杜松烯僅在臺灣軟枝烏龍茶中檢出。兩種不同產(chǎn)地的烏龍茶香氣成分的一致性和他們加工工藝有很大的關(guān)系，而不同的產(chǎn)地、茶樹品種等因素還是導致了他們之間有一定的差異性。僅僅通過對表1 的分析，還是不能較直觀的對兩種不同省份的烏龍茶進行一個識別和區(qū)分，因此還需要借助多元統(tǒng)計學方法進一步分析。

2.3 基于兩種不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性成分的多元統(tǒng)計學分析

2.3.1 主成分分析

主成分分析是將多個變量通過線性變換以選出較少個數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計分析方法。在用統(tǒng)計分析方法研究多變量的茶葉揮發(fā)性組分時，變量個數(shù)太多就會增加分析的復雜性，尤其是針對于這種類別分析。主成分分析就是研究如何通過少數(shù)幾個主成分來揭示多個變量間的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，即從原始變量中導出少數(shù)幾個主成分，使它們盡可能多地保留原始變量的信息，且彼此間互不相關(guān)。通常數(shù)學上的處理就是將原來P 個指標作線性組合，作為新的綜合指標[19]。將所分析茶葉樣品的香氣成分含量表輸入多元統(tǒng)計學軟件SIMCA-P15 中進行分析，得到主成分得分圖如圖3 所示，各變量載荷圖如圖4 所示。

圖3 福建鐵觀音烏龍茶和臺灣軟枝烏龍茶的主成分得分圖Fig.3 PCA score scatter plot from PC1 and PC2 in the Fujian Tieguanyin oolong teas and Taiwan Ruanzhi oolong teas

圖4 基于主成分分析的福建鐵觀音烏龍茶和臺灣軟枝烏龍茶的變量載荷圖Fig.4 PCA loading plot of 71 variables utilized from PC1 and PC2 in the Fujian Tieguanyin oolong teas and Taiwan Ruanzhi oolong teas

從圖3 可以看出，兩種不同省份的烏龍茶之間還是有一個明顯的區(qū)分，臺灣軟枝烏龍茶聚在了左邊，而福建鐵觀音烏龍茶聚在了右邊，這說明通過主成分分析可以實現(xiàn)這兩種不同省份烏龍茶的區(qū)分。但通過圖4 的載荷圖還是不太能看得出來具體決定他們實現(xiàn)區(qū)分的關(guān)鍵變量，因為所有變量都比較分散，難以發(fā)現(xiàn)有價值的信息。因此，需進一步的進行正交偏最小二乘判別分析來挖掘有用的信息。

2.3.2 正交偏最小二乘判別分析

偏最小二乘法判別分析是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計分析方法，是一種有監(jiān)督的判別分析方法。其原理是對不同處理樣本（如觀測樣本、對照樣本）的特性分別進行訓練，產(chǎn)生訓練集，并檢驗訓練集的可信度[20]。同主成分分析一樣，將表1 導入SIMCA-P15中進行OPLS-DA 分析，其中TO1～TO3 為一組，F(xiàn)O1～FO4 為另外一組，得到這種判別分析的得分圖和SPlot 圖，如圖 5、圖6 所示。

圖5 基于偏最小二乘法判別分析的福建鐵觀音烏龍茶和臺灣軟枝烏龍茶的得分圖Fig.5 The partial least squares discriminant analysis of score scatter plot in the Fujian Tieguanyin oolong teas and Taiwan Ruanzhi oolong teas

圖6 基于偏最小二乘法判別分析變量的S-plot 圖Fig.6 The partial least squares discriminant analysis of S-plot of 71 variables

從圖5 可以看出，兩種不同產(chǎn)地的烏龍茶之間實現(xiàn)了很好的區(qū)分。在圖6 的S 形的兩個角的變量，可能就是所尋找的兩種不同類型茶葉的典型香氣成分差異物。其中變量56（橙花叔醇）、變量31（香葉醇）、變量17（芳樟醇）、變量49（2-甲基丁酸-2-苯乙酯）等可能對他們的分類貢獻較大。為了具體的看出每一種揮發(fā)性成分的這種貢獻，在放大試驗次數(shù)為200 的情況下，接著進行兩組變量的可變信息處理（variable information processing，VIP）預(yù)測值分析，得到 VIP 圖如圖7 所示，同時導出了VIP 數(shù)值表，加在了表1 上。

在代謝組學中，一般認為VIP 值大于1 的變量可能為兩組化合物的差異代謝物。通過圖7 和表1 的VIP 值，發(fā)現(xiàn)香葉醇、橙花叔醇、芳樟醇、2-甲基丁酸-2-苯乙酯、水楊酸甲酯、α-法呢烯、苯乙醇、茉莉酮酸甲酯的值均大于1，這幾種揮發(fā)性化合物可能是兩組茶葉中差異較大的化合物，對它們的區(qū)分起到了關(guān)鍵的作用。

圖7 福建鐵觀音烏龍茶和臺灣軟枝烏龍茶中的71 中揮發(fā)性組分VIP 預(yù)測值圖Fig.7 The VIP predicted values plot of 71 variables in the Fujian Tieguanyin oolong teas and Taiwan Ruanzhi oolong teas

茶葉的揮發(fā)性組分主要受到制茶品種、制茶工藝和茶葉產(chǎn)地的影響[21]。兩種不同產(chǎn)地的烏龍茶香氣成分一致性和它們的制作工藝密不可分，但它們茶葉成分上的差異性可能與茶葉產(chǎn)地、茶樹品種等因素有關(guān)。鐵觀音茶是采用鐵觀音茶樹品種制作而成，而臺灣茶樹烏龍茶主要是采用金萱茶樹品種制作而成。另外，不同產(chǎn)地的氣候和地理環(huán)境因素也導致了他們香氣成分上的差異。本研究僅僅是一個比較兩種不同產(chǎn)地烏龍茶香氣成分的一個基礎(chǔ)性研究，下一步，將進一步增加樣品的采集量，對兩種不同烏龍茶的差異進行一個大樣本的大數(shù)據(jù)研究，同時結(jié)合化學計量學方法，進一步對他們的關(guān)鍵差異信息進行挖掘。

3 結(jié)論

本研究通過HS-SPME 來提取兩種烏龍茶的揮發(fā)性成分，并利用GC-MS 進行定量分析，并進一步利用多元統(tǒng)計學方法來對這兩種茶葉進行區(qū)分，同時進一步挖掘他們的差異性揮發(fā)性成分。結(jié)果顯示，在所有的7 種烏龍茶中共鑒定出揮發(fā)性成分71 種，主要包括醇類、碳氫化合物和酯類化合物，其余化合物含量均較低。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，兩種不同產(chǎn)地的烏龍茶在揮發(fā)性組成上具有一定的相似性，但也體現(xiàn)出了一些差異性，利用PCA 和OPLS-DA 分析，兩種茶葉能實現(xiàn)較好的區(qū)分，并通過進一步的分析發(fā)現(xiàn)香葉醇、橙花叔醇、芳樟醇、2-甲基丁酸-2-苯乙酯、水楊酸甲酯、α-法呢烯、苯乙醇、茉莉酮酸甲酯可能是導致兩種茶葉差異的關(guān)鍵性化合物?？傊瑑煞N烏龍茶香氣成分的相似和差異性，與它們相同的生產(chǎn)工藝和不同的茶樹品種和產(chǎn)地因素密切相關(guān)。下一步還將進一步增加樣品的采集量，對兩種不同烏龍茶的差異進行一個大樣本的大數(shù)據(jù)研究，同時結(jié)合化學計量學方法，對他們的關(guān)鍵差異信息進行挖掘，以期為我國烏龍茶的質(zhì)量控制和品牌建設(shè)提供一定的理論參考。