藜麥麩皮皂苷超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化

楊端

（鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，河南鄭州451100）

藜麥（Chenopodium quinoa willd.）是藜科藜屬雙子葉的植物，原產(chǎn)地是南美地區(qū)，又被稱為南美藜等。是被發(fā)現(xiàn)種植距今已經(jīng)5000 多年，在我國分布也比較廣泛，在青海、甘肅、內(nèi)蒙古等地種植面積非常大[1]。藜麥含有大量的蛋白以及營養(yǎng)素，如鐵、鈣、維生素等，還含有必需氨基酸以及多種生物活性物質(zhì)[2]，藜麥營養(yǎng)價(jià)值非常高，在國際上有記載，被列為全球范圍內(nèi)十大營養(yǎng)食品之一[3-4]。專家研究得出，經(jīng)常以藜麥為食物對(duì)高血壓、心臟病、高血糖以及高血脂等病癥均有較好的防治功效。藜麥麩皮是藜麥生產(chǎn)加工中的一種產(chǎn)量較高的副產(chǎn)物，目前來看，藜麥麩皮附加值很低，較少的被利用，甚至作為飼料以及被棄掉，藜麥麩皮中同樣含有重要的功能活性物質(zhì)，如含有藜麥皂苷，其對(duì)增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗疲勞、抗癌等有都有明顯功效[5-6]。超臨界CO2萃取技術(shù)是一種新興的高新提取技術(shù)，該技術(shù)可以用于植物活性成分的提取等方面[7]。具有污染小、廢棄物排放少、低毒、高效率等優(yōu)點(diǎn)[8]。目前乙醇回流法提取藜麥皂苷、超聲波提取法提取藜麥皂苷和閃式提取法提取藜麥皂苷研究較多[9]，超臨界萃取法提取藜麥皂苷還尚未有所報(bào)道，因此，本研究采用藜麥麩皮為主要原料，采用超臨界萃取技術(shù)提取皂苷，對(duì)藜麥皂苷高質(zhì)量高效率提取具有重要意義，超臨界技術(shù)提取可大大提高藜麥麩皮的附加值，為藜麥麩皮皂苷進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥麩皮：陜西藤邁生物科技有限公司；無水乙醇、甲醇、石油醚、冰乙酸、高氯酸、香草醛等均為分析純：北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SFE420-40-200 型超臨界CO2萃取儀：江蘇溫奧機(jī)械設(shè)備有限公司；FA2104B 型電子天平：上海康路儀器設(shè)備有限公司；HH-11-1 型水浴鍋：上海奧旗儀器設(shè)備有限公司；VIS-721 型可見分光光度計(jì)：上海平軒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藜麥麩皮皂苷提取工藝流程

藜麥麩皮→淋洗→瀝水→烘干（80 ℃）→粉碎（過120 目篩）→超臨界萃取→皂苷→測定

1.3.2 藜麥麩皮皂苷提取單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 超臨界壓力對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響

在超臨界溫度60 ℃，萃取時(shí)間90 min，乙醇濃度70%的條件下，超臨界壓力分別為 25、30、35、40、45 MPa時(shí)，以藜麥麩皮皂苷提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究超臨界壓力對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響。

1.3.2.2 超臨界溫度對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響

在超臨界壓力35 MPa，萃取時(shí)間90 min，乙醇濃度 70%時(shí)，超臨界溫度分別為 50、55、60、65、70 ℃的條件下，以藜麥麩皮皂苷提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究超臨界溫度對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響。

1.3.2.3 萃取時(shí)間對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響

在超臨界壓力35 MPa，超臨界溫度60 ℃，乙醇濃度 70%時(shí)，萃取時(shí)間分別為 70、80、90、100、110 min 的條件下，以藜麥麩皮皂苷提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究萃取時(shí)間對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響。

1.3.2.4 乙醇濃度對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響

在超臨界壓力35 MPa，超臨界溫度60 ℃，萃取時(shí)間90 min 時(shí)，乙醇濃度分別為60%、65%、70%、75%、80%的條件下，以藜麥麩皮皂苷提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究乙醇濃度對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響。

1.3.3 藜麥麩皮皂苷提取工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素結(jié)果，以超臨界壓力（A）、超臨界溫度（B）、萃取時(shí)間（C）、乙醇濃度（D）做因素，以藜麥麩皮皂苷提取率（Y）為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，確定藜麥麩皮皂苷提取最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.3.4 藜麥麩皮皂苷含量的測定

采用香草醛一高氯酸法，吸取200 μL 皂苷粗提液加入試管中，80 ℃水浴揮發(fā)除去甲醇，加入5%的香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL、加入高氯酸0.8 mL，于80 ℃水浴震蕩20 min 后立即用冷水冷卻5 min；再向其中加4 mL 冰乙酸進(jìn)行稀釋處理，常溫條件下靜止25 min，以沒有加入皂苷的空白管作為對(duì)照試驗(yàn)，546 nm 測定吸光度，并且進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)。以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y= 63.285X-0.006（0～0.03 mg/mL，R2=0.999 8）。皂苷含量以每100 g 藜麥粉中所含相當(dāng)于齊墩果酸的量毫克數(shù)表示[10-11]。

式中：Y 為皂苷濃度，mg/mL；V 為皂苷粗提液的總體積，mL；M 為藜麥粉干重，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥麩皮皂苷提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超臨界壓力對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響

超臨界壓力對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響見圖1。

圖1 超臨界壓力對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響Fig.1 Effect of supercritical pressure on the extraction rate of quinoa bran saponins

根據(jù)圖1，當(dāng)超臨界壓力為25 MPa 時(shí)，藜麥麩皮皂苷提取率最低，當(dāng)超臨界壓力升高后，藜麥麩皮皂苷提取率逐漸升高，當(dāng)超臨界壓力達(dá)到35 MPa 時(shí)，藜麥麩皮皂苷提取率達(dá)到0.94%，上升變得緩慢，幾乎不再變化，綜合考慮生產(chǎn)效率，選擇超臨界壓力為30、35、40 MPa 為響應(yīng)面研究水平。

2.1.2 超臨界溫度對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響

超臨界溫度對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響見圖2。

圖2 超臨界溫度對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響Fig.2 Effect of supercritical temperature on the extraction rate of quinoa bran saponins

由圖2 可知，當(dāng)超臨界溫度為50 ℃時(shí)，藜麥麩皮皂苷提取率最低，隨著超臨界溫度的上升，藜麥麩皮皂苷提取率先升高后降低，當(dāng)超臨界溫度為60 ℃時(shí)，藜麥麩皮皂苷提取率最高，為0.94%。原因可能是，超臨界溫度較低時(shí)，不能夠使得藜麥麩皮皂苷完全被提出，而當(dāng)超臨界溫度高于60 ℃后，溫度過高后，導(dǎo)致藜麥麩皮皂苷有損失，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而提取率下降，皂苷從燕麥麩皮植物細(xì)胞釋放出來需要最適的溫度[12-13]，綜合考慮生產(chǎn)效率，選擇超臨界溫度為55、60、65 ℃為響應(yīng)面研究水平。

2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響

萃取時(shí)間對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響見圖3。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of quinoa bran saponins

由圖3 可知，當(dāng)萃取時(shí)間為70 min 時(shí)，藜麥麩皮皂苷提取率最低，隨著萃取時(shí)間的延長，藜麥麩皮皂苷提取率迅速升高，當(dāng)萃取時(shí)間達(dá)到90 min 時(shí)，藜麥麩皮皂苷提取率達(dá)到0.94%，超過90 min 后，幾乎不再變化，因此，選擇萃取時(shí)間為80、90、100 min 為響應(yīng)面研究水平。

2.1.4 乙醇濃度對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響

乙醇濃度對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響見圖4。

圖4 乙醇濃度對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of quinoa bran saponins

由圖4 可知，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，藜麥麩皮皂苷提取率最低，隨著乙醇濃度的變大，藜麥麩皮皂苷提取率先升高后降低，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，藜麥麩皮皂苷提取率最高，為0.94%。原因可能是，乙醇濃度較小時(shí)，不能夠使得藜麥麩皮皂苷完全被提出，皂苷提取需要最適合的乙醇濃度作為夾帶劑[14]，綜合考慮生產(chǎn)效率，選擇乙醇濃度為65%、70%、75%為響應(yīng)面研究水平。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

由單因素結(jié)果，利用軟件進(jìn)一步優(yōu)化工藝參數(shù)。考察超臨界壓力（A）、超臨界溫度（B）、萃取時(shí)間（C）、乙醇濃度（D）對(duì)藜麥麩皮皂苷提取率（Y）的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The central composite experimental design and results of Box-Benhnken

續(xù)表2 Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2 The central composite experimental design and results of Box-Benhnken

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、方差分析及顯著性檢驗(yàn)，得到以藜麥麩皮皂苷提取率為目標(biāo)函數(shù)，關(guān)于各因素編碼值的二次回歸方程為：Y=0.95+0.036A+0.014B+0.018C+0.009D+0.020AB+0.035AC+0.012AD+0.005BC-0.028BD-0.008CD-0.065A2－0.055B2－0.037C2－0.005D2。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，方差結(jié)果見表3，可信度結(jié)果見表4。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance table for regression model

續(xù)表3 回歸方程方差分析表Continue table 3 Analysis of variance table for regression model

表4 回歸模型的可信度分析Table 4 Reliability analysis of the established regression model

由表3、表4 可知，此模型P 值小于0.000 1，遠(yuǎn)小于0.01，能夠得出此模型極顯著，失擬項(xiàng)P 值為0.132 9，不顯著，誤差很小，故能夠用此模型代替真實(shí)值對(duì)燕麥麩皮皂苷做出分析，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=96.77%，修正相關(guān)系數(shù)R2Adj=93.53%，Y 的變異系數(shù)=1.54%，試驗(yàn)值與理論值相關(guān)性高，此模型可靠性高。在回歸模型中，一次項(xiàng)A 超臨界壓力、B 超臨界溫度、C 萃取時(shí)間，交互項(xiàng)A 超臨界壓力C 萃取時(shí)間、B 超臨界溫度D 乙醇濃度，二次項(xiàng)A2超臨界壓力、B2超臨界溫度、C2萃取時(shí)間、D2乙醇濃度，對(duì)超臨界CO2萃取技術(shù)提取藜麥麩皮皂苷工藝參數(shù)影響均極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)D 乙醇濃度、交互項(xiàng)A 超臨界壓力B 超臨界溫度，對(duì)超臨界CO2萃取技術(shù)提取藜麥麩皮皂苷工藝參數(shù)影響顯著（P＜0.05）。方差分析結(jié)果表明，影響超臨界CO2萃取技術(shù)提取藜麥麩皮皂苷工藝參數(shù)因素大小依次為A超臨界壓力＞C 萃取時(shí)間＞B 超臨界溫度＞D 乙醇濃度。

2.2.2 響應(yīng)曲面和等高線圖分析

響應(yīng)曲面和等高線圖見圖5。

響應(yīng)面圖能夠反映出各個(gè)因素之間的相互關(guān)系以及相互作用程度[15-16]。通過圖5 分析可知，等高線能夠更清晰直觀反映兩因素之間關(guān)系。橢圓形表示兩因素之間影響極顯著，圓形表示因素間影響不顯著。超臨界壓力（A）與超臨界溫度（B）之間、超臨界壓力（A）與萃取時(shí)間（C）之間、超臨界溫度（B）與乙醇濃度（D）之間均為橢圓形，對(duì)超臨界CO2萃取技術(shù)提取藜麥麩皮皂苷工藝參數(shù)影響極顯著。

圖5 響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surfaces and contour plots

2.2.3 最優(yōu)條件的優(yōu)化與驗(yàn)證

為確定最佳參數(shù)，對(duì)擬合的回歸方程分別求一階偏導(dǎo)數(shù)，并設(shè)其為0，得到四元一次方程如下：

求解得：A＝0.364、B＝0.084、C＝0.569、D＝0.739，即最佳參數(shù)為超臨界壓力36.82 MPa，超臨界溫度60.42℃，萃取時(shí)間95.69 min，乙醇濃度73.70%，在此條件下，藜麥麩皮皂苷提取率為0.96%?？紤]到實(shí)際方便及易操作性，將工藝參數(shù)優(yōu)化為：超臨界壓力37 MPa，超臨界溫度60 ℃，萃取時(shí)間96 min，乙醇濃度74%，在此工藝參數(shù)下做3 次平行試驗(yàn)，3 次試驗(yàn)的藜麥麩皮皂苷提取率0.96%。

3 結(jié)論

藜麥麩皮是藜麥生產(chǎn)加工過程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，為了提高藜麥麩附加值，研究采用藜麥麩皮為主要原料，利用超臨界CO2萃取技術(shù)對(duì)藜麥麩皮皂苷進(jìn)行提取，并采用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)為超臨界壓力37 MPa，超臨界溫度60 ℃，萃取時(shí)間96 min，乙醇濃度74%，在此條件下，藜麥麩皮皂苷提取率為0.96%。影響藜麥麩皮皂苷提取率因素由大到小依次為超臨界壓力＞萃取時(shí)間＞超臨界溫度＞乙醇濃度。