酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料抗氧化活性及穩(wěn)定性研究

戴梓茹，梁冬萍，秦海瓊，張晨曉，王培

（1.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州535011；2.廣西高校北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州535011；3.欽州學(xué)院食品工程學(xué)院，廣西欽州535011）

酸楊桃是中國(guó)南方特色水果，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有促進(jìn)消化、保肝護(hù)臟、預(yù)防“三高”、抗氧化等多種生理活性作用，但其口感偏酸，帶刺激性，不宜鮮食[1-4]。羅漢果是藥、食兩用的材料，甜度高，具有抗氧化、清肺潤(rùn)腸、護(hù)膚、降血糖、降血脂等功效[5-6]。酸楊桃飲料中加入甜度較高的羅漢果調(diào)配，對(duì)飲料口感和功能性均有提升作用。研究采用DPPH 自由基清除能力（DPPH法）和氧自由基吸收能力（oxgen radical absorbance capacity，ORAC 法）研究酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料的抗氧化活性，探討溫度、pH 值、紫外線和NaCl 等因素對(duì)復(fù)合飲料的抗氧化穩(wěn)定性影響，并通過(guò)模擬胃腸道消化，初步探討其在體內(nèi)的抗氧化活性變化規(guī)律，為飲料加工及推廣應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料：廣西高校北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；磷酸鹽緩沖液：Solar science 公司；自由基產(chǎn)生劑 2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽[2，2′-Azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH]、熒 光 物 質(zhì)（Fluorescein sodium salt，F(xiàn)L）、抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)水溶性維生素 E（Trolox）、DPPH 自由基、胰蛋白酶[BR，1 ∶250（g/g）]、胃蛋白酶（456 000 U/g）：Sigma 公司；95%乙醇：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 主要儀器

H-4 恒溫水浴鍋：金壇市天瑞儀器有限公司；TGL20 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；1510 酶標(biāo)儀：Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 方法

1.3.1 酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料制備

根據(jù)北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院海洋資源開發(fā)與利用課題組的配方優(yōu)化結(jié)果，酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料以9.0%酸楊桃原汁、4.0%羅漢果浸提液、0.03%阿斯巴甜、0.05%食鹽調(diào)配而成。

1.3.2 酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料體外抗氧化活性

1.3.2.1 氧自由基吸收能力（ORAC 試驗(yàn)）

ORAC 法測(cè)定氧化自由基吸收能力參考Huang 等方法[7]稍作修改。

將酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料原液用磷酸鹽緩沖液稀釋制成10 倍作為樣品待測(cè)液。在黑色96 孔板內(nèi)加入 20 μL 磷酸鹽緩沖液作為空白，20 μL Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.125 μmol/L～50 μmol/L），20 μL 樣品待測(cè)液，再加入 200 μL AAPH 溶液，振板 1 min，并將板置于 37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，最后加入0.1 mmol/L 的20 μL APPH 溶液，在485 nm 激發(fā)波長(zhǎng)，535 nm 發(fā)射波長(zhǎng)下進(jìn)行連續(xù)測(cè)定熒光強(qiáng)度，整個(gè)體系保持37 ℃，每2 min測(cè)定一次熒光強(qiáng)度，測(cè)定時(shí)間設(shè)定在熒光衰退呈基線后為止，約2.5 h。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的總抗氧化能力，結(jié)果用微摩爾水溶性維生素E（Trolox）當(dāng)量/每升樣品原液來(lái)表示（μmol TE/L）。

1.3.2.2 DPPH 自由基清除能力

DPPH 法采用Bao 等的方法[8]并稍作修改。

將酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料原液用磷酸鹽緩沖液稀釋制成10 倍作為樣品待測(cè)液。在白色96 孔板內(nèi)加入Trolox 標(biāo)準(zhǔn)液（3.125 μmol/L～50 μmol/L）和 20 μL 樣品，在加入 200 μL 乙醇和 200 μL DPPH 溶液（0.1 mmol/L），輕輕搖勻，25 ℃，避光反應(yīng)30 min，在 517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的總抗氧化能力，結(jié)果用微摩爾水溶性維生素E[Trolox 當(dāng)量/每升樣品原液來(lái)表示（μmol TE/L）]。

1.3.3 酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性分析

根據(jù)氧自由基吸收能力（ORAC 試驗(yàn)）和DPPH 自由基清除能力試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，用磷酸鹽緩沖液稀釋酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料為10 倍的樣品待測(cè)液250 mL，用于穩(wěn)定性試驗(yàn)。

1.3.3.1 溫度對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響

各取樣品液 4 mL，分別在 20、40、60、80、100 ℃下處理1 h，取出放冰上冷卻，分別進(jìn)行ORAC 和DPPH試驗(yàn)。

1.3.3.2 pH 值對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響

各取樣品液4 mL，用1 mol/L HCl 或1 mol/L NaOH將 pH 值分別調(diào)整至 2、4、6、8、10，在 25 ℃ 靜置保持1 h，分別進(jìn)行 ORAC 和 DPPH 試驗(yàn)。

1.3.3.3 紫外線對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響

各取樣品液4 mL，在紫外燈下分別照射時(shí)長(zhǎng)為15、30、45、60、75、90、105、120 min，分別進(jìn)行 ORAC 和DPPH 試驗(yàn)。

1.3.3.4 NaCl 對(duì)酸楊桃復(fù)合飲羅漢果料穩(wěn)定性的影響

各取樣品液 4 mL，分別加入 2 mL 濃度為 1、2、3、4、5 mmol/L 的NaCl 溶液，充分混勻放置15 min，分別進(jìn)行 ORAC 和 DPPH 試驗(yàn)。

1.3.4.5 體外模擬胃腸道消化

用磷酸鹽緩沖液配制稀釋度為10 倍的酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料樣品液100 mL，取10 mL，記為未處理液A。然后用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 值至2.0，加入胃蛋白酶 1 mg（20 mg/g），37 ℃恒溫水浴 90 min。用 1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至7.5，收集一半反應(yīng)液，記為消化液B，冷卻至25 ℃，備用。向另一半反應(yīng)液中加入胰蛋白酶 2 mg（40 mg/g），37 ℃恒溫水浴 120 min，90 ℃水浴15 min，滅酶，此反應(yīng)液記為消化液C，冷卻至25 ℃，備用。

分別將未處理液A、消化液B 和消化液C，進(jìn)行ORAC 和 DPPH 試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料體外抗氧化活性研究

2.1.1 氧自由基吸收能力

以維生素E 濃度為橫坐標(biāo)，熒光曲線為縱坐標(biāo)，繪制出維生素E（Trolox）系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1 所示。

圖1 維生素E 系列濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard solution of concentration of Trolox series

該標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.522 4x+3.563 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 1。通過(guò)Trolox 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得知復(fù)合飲料的 ORAC 值為 335.61 μmol TE/L。

2.1.2 DPPH 自由基清除能力

以Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，清除自由基能力為縱坐標(biāo)，繪制出Trolox 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的DPPH 自由基清除率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2。

該標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.013 7x+0.175 7，R2=0.990 3。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算得出復(fù)合飲料的DPPH 值為113.96 μmol TE/L。

圖2 Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液DPPH 自由基清除率曲線Fig.2 Curve of DPPH free radical scavenging rate of Trolox standard solution

2.2 酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性分析

2.2.1 溫度對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響

溫度對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響見圖3。

圖3 溫度對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of temperature on the stability of compound beverage with carambola and momordica fruit

如圖3 所示，復(fù)合飲料分別在 20、40、60、80、100 ℃條件下加熱處理后，與未處理組相比（DPPH 113.96 mol TE/L，ORAC 335.61 mol TE/L），酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料ORAC 值和DPPH 值無(wú)顯著差異。酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料中的抗氧化成分有酸楊桃黃酮、多酚[3-4]及羅漢果黃酮、皂甙、多糖[9-10]等物質(zhì)。喬建衛(wèi)等的研究表明黃芩黃酮類物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性[11]，胡迎芬等研究發(fā)現(xiàn)在40 ℃～100 ℃的溫度范圍內(nèi)對(duì)紫葉李提取物加熱處理，對(duì)其抗氧化活性無(wú)顯著影響[12]，這與試驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明不同溫度加熱處理的條件下，復(fù)合飲料抗氧化活性較為穩(wěn)定。

2.2.2 pH 值對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響

pH 值對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響見圖4。

pH 值對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響如圖4 所示（未調(diào)復(fù)合飲料pH 值為5.6），隨著pH 值的增大，酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料抗氧化活性呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)，pH 值為 8.0 時(shí)，ORAC 值最大，pH 值為6.0 時(shí)，DPPH 值最大。陳建中等研究發(fā)現(xiàn)堿性條件下茼蒿總黃酮的抗氧化活性顯著降低[13]，何莉萍等研究表明荷葉總黃酮在pH 6.0 左右較穩(wěn)定[14]。酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料抗氧化活性在中性條件下較穩(wěn)定，可能是飲料中起抗氧化活性的酚羥基在酸性或堿性條件下遭到破壞而導(dǎo)致抗氧化能力減弱。

圖4 pH 值對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on the stability of compound beverage with carambola and momordica fruit

2.2.3 紫外線對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響

紫外線照射時(shí)間對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響見圖5。

圖5 紫外線照射時(shí)間對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of ultraviolet irradiation time on the stability of compound beverage with carambola and momordica fruit

紫外線對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響如圖5 所示，與未處理組相比（DPPH 113.96 mol TE/L，ORAC 335.61mol TE/L），紫外線照射時(shí)間小于45 min時(shí)，酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料抗氧化能力較穩(wěn)定，隨著照射時(shí)間延長(zhǎng)，ORAC 和DPPH 值均有下降趨勢(shì)。研究表明，光照條件下多糖、黃酮類物質(zhì)抗氧化能力均有不同程度的減弱[11，15]，這與試驗(yàn)結(jié)果相似，因此在飲料的加工及貯藏過(guò)程中應(yīng)盡量避免強(qiáng)烈而長(zhǎng)時(shí)間的光照，以保證其抗氧化活性。

2.2.4 NaCl 對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響

氯化鈉對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響見圖6。

氯化鈉對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響如圖6 所示，經(jīng)不同濃度NaCl 溶液處理后，酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料ORAC 和DPPH 值沒(méi)有顯著變化，這與孟良玉、何莉萍等的研究結(jié)果相似[14-15]，說(shuō)明Na+處理后復(fù)合飲料抗氧化活性比較穩(wěn)定。

圖6 氯化鈉對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of NaCl on the stability of compound beverage with carambola and momordica fruit

2.2.5 體外模擬胃腸道消化

體外模擬胃腸道消化對(duì)對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響見圖7。

圖7 體外模擬胃腸道消化對(duì)對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of gastrointestinal digestion in vitro on the stability of compound beverage with carambola and momordica fruit

體外模擬胃腸道消化對(duì)穩(wěn)定性的影響如圖7 所示，在外模擬胃腸道消化對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料抗氧化活性有顯著影響。ORAC 值呈現(xiàn)略微下降的趨勢(shì)，DPPH 自由基清除能力表現(xiàn)為先下降后上升，總體而言，隨著模擬消化的進(jìn)行，酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料的總體抗氧化活性具有較強(qiáng)的抗胃腸道消化能力，其抗氧化能力相對(duì)穩(wěn)定。

3 結(jié)論

對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料總抗氧化能力及穩(wěn)定性研究表明，酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料具有較強(qiáng)的抗氧化能力，ORAC 值和 DPPH 值分別為 335.61 μmol TE/L和113.96 μmol TE/L；溫度和NaCl 值的變化，對(duì)酸楊桃羅漢果復(fù)合飲料穩(wěn)定性沒(méi)有顯著性影響；pH 值和紫外線照射時(shí)間改變，對(duì)復(fù)合飲料抗氧化活性有顯著影響，在 pH 值為 6～8、紫外照射時(shí)間<45 min 時(shí)，ORAC值和DPPH 值沒(méi)有明顯變化，復(fù)合飲料抗氧化活性較高；胃腸道消化導(dǎo)致ORAC 值和DPPH 值顯著下降，但仍具有較強(qiáng)的抗氧化能力。