尿血寧合劑中紅景天苷和木樨草苷的含量測定

趙躍榮

尿血寧合劑為我院的中藥制劑，由女貞子、墨旱蓮、小薊、生側(cè)柏、馬鞭草、石韋等藥物制成，本藥物具有滋陰補腎、涼血止血的功效，臨床用于腎炎血尿（含鏡下血尿）[1]。本方中女貞子為君藥，具有補肝腎、強腰膝的功效。紅景天苷是女貞子保護腎臟功能的重要活性成分[2]。墨旱蓮為臣藥，具有涼血止血、收斂止癢、補益肝腎的功效，其含有的木樨草苷是重要活性成分[3]。尿血寧合劑現(xiàn)行的質(zhì)量標準還停留在薄層掃描等定性鑒別水平，遠不能適應中藥質(zhì)量檢驗檢測的發(fā)展，所以，亟需建立尿血寧合劑主要活性成分定量測定的方法。研究人員以女貞子中紅景天苷和墨旱蓮中的木樨草苷為檢測的指標性成分[4-5]，建立了對尿血寧合劑中紅景天苷和木樨草苷同時進行含量測定的方法，研究如下。

1 儀器與材料

2695 型高效液相色譜儀，紫外檢測器（Waters公司），US-22D型超聲波清洗器（蘇州市炬虹超聲波設備有限公司）。

紅景天苷對照品（批號：120325-201706，南京森貝伽生物科技有限公司），木樨草苷對照品（批號：101124-201708，武漢天植生物技術有限公司），乙腈（色譜純，濟南創(chuàng)世化工有限公司），磷酸（分析純，濟南蕭試化工有限公司），甲醇（分析純，南京維之誠化學試劑有限公司），重蒸水（本院藥學實驗室自制），尿血寧合劑為南京中醫(yī)藥大學連云港附屬醫(yī)院自制（批號分別為170915、171013、171116）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Athena C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），采用混合流動相，流動相A為乙腈，流動相B為0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液，進行梯度洗脫，見表1；柱溫25℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長275 nm，進樣量10 μL。理論塔板數(shù)按照紅景天苷色譜峰計算和按照木樨草苷峰計算均不低于3 500。

2.2 對照品溶液制備

取紅景天苷對照品10.0 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，用體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為400 mg·L-1的對照品儲備液A。另取木樨草苷對照品8 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，用體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為320 mg·L-1的對照品儲備液B。分別精密量取對照品儲備液A和對照品儲備液B各10 mL，置于同一50 mL量瓶中，用體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液稀釋至刻度，搖勻，制得紅景天苷和木樨草苷的質(zhì)量濃度分別為80 mg·L-1和64 mg·L-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

精密量取尿血寧合劑5 mL，置50 mL量瓶中，加體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液30 mL，超聲處理10 min，取出，放冷，加體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液定容至刻度，搖勻，以2500 r·min-1的速度離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液制備

按尿血寧合劑的處方和制備方法，分別制備不含女貞子或墨旱蓮藥材的陰性樣品，按“2.3”項下所述的供試品溶液的制備方法制成相應的陰性樣品溶液，備用。

2.5 方法專屬性考察

取對照品溶液、供試品溶液、不含女貞子的陰性樣品溶液、不含墨旱蓮陰性樣品溶液，在“2.1”項下所述的色譜條件下各進樣10 μL，分別記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果顯示，紅景天苷的保留時間為7.6 min，木樨草苷的保留時間為20.4 min，不含女貞子陰性樣品溶液在紅景天苷出峰區(qū)間未出現(xiàn)相應色譜峰，不含墨旱蓮陰性樣品溶液在木樨草苷出峰區(qū)間未出現(xiàn)相應色譜峰，實驗結(jié)果表明，該方法專屬性較好。

2.6 線性關系考察

分別精密吸取上述對照品儲備液A、對照品儲備液B各0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00 mL置于同一25 mL量瓶中，用體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液稀釋至刻度，搖勻，制成紅景天苷、木樨草苷梯度濃度的混合標準溶液。精密吸取梯度濃度的混合標準溶液10μL，注入高效液相色譜儀測定。繪制標準曲線：以進樣量（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，得紅景天苷回歸方程為Y=3.268×104X+8.267×102，r=0.999 7，紅景天苷質(zhì)量濃度在9～150 mg·L-1的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系；木樨草苷回歸方程為Y=4.158×104X-5.546×102，r=0.999 8，木樨草苷質(zhì)量濃度在8～130 mg·L-1的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.7 精密度試驗

取同一對照品溶液，在“2.1”項下所述的色譜條件下連續(xù)進樣6次，經(jīng)計算，紅景天苷色譜峰面積的RSD為0.95%（n=6），木樨草苷色譜峰面積的RSD為1.06%（n=6）。

2.8 方法重復性試驗

取同一批號（170915）尿血寧合劑樣品5份，按“2.3” 項下所述的供試品溶液的制備方法平行制備5份供試品溶液，在“2.1”項下所述的色譜條件下進行測定，紅景天苷含量的相對標準偏差RSD為1.24%（n=5）；木樨草苷含量的相對標準偏差RSD為1.36%（n=5）。

圖1 HPLC 色譜圖

2.9 穩(wěn)定性試驗

吸取供試品溶液分別于0、1、2、4、8、16、24 h進樣，測定峰面積，經(jīng)計算，紅景天苷峰面積RSD為1.16%，木樨草苷峰面積RSD為1.33%，實驗結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 回收率試驗

稱取已知含量的尿血寧合劑樣品（批號：170915）1.0 mL，置10 mL量瓶中，精密加入紅景天苷、木樨草苷對照品溶液，按“2.3”項下所述的供試品溶液的制備方法制成低、中、高3個質(zhì)量濃度的供試品溶液，按“2.1”條色譜條件下進樣分析，結(jié)果見表2。

2.11 樣品測定

取3批樣品，每批取3份，按“2.3”項下所述的供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，在“2.1”項下所述的色譜條件下進行測定，記錄色譜峰面積，按外標一點法計算紅景天苷、木樨草苷的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

尿血寧合劑中女貞子為君藥，女貞子中含有的紅景天苷具有較強的藥理活性，研究表明，紅景天苷能抑制鏈尿佐菌素誘導的糖尿病腎病模型大鼠腎纖維化，對大鼠過度運動后腎損傷也具有預防保護作用。墨旱蓮對腎臟也具有較強保護作用，研究表明，墨旱蓮提取物能有效改善STZ誘導糖尿病大鼠的相關生化指標，并對腎臟具有保護作用，木樨草苷是墨旱蓮中含有的重要活性成分，所以，對尿血寧合劑中的木樨草苷和紅景天苷進行含量測定，能夠反映出制劑的質(zhì)量，對于提高制劑的質(zhì)量標準，具有重要的意義。

為同時測定木樨草苷和紅景天苷的含量，參考相關文獻[6-8]，試用體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液、體積比為20：80的甲醇-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液、體積比為50：50的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液等流動相系統(tǒng)，經(jīng)過試驗，以體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液為流動相，紅景天苷與木樨草苷與其他組分均能達到基線分離。

文獻報道，紅景天苷的最大吸收波長為224 nm、275 nm[9-10]，木樨草苷的最大吸收波長為330 nm、350 nm[11-12]；本研究分別對紅景天苷和木樨草苷進行紫外掃描，結(jié)果表明，紅景天苷在275 nm處有最大吸收，木樨草苷在275 nm、330 nm處有最大吸收，因紅景天苷在330 nm處紫外吸收極低，故選擇二者的共同最大吸收波長275 nm作為測定波長。

本研究還比較了0.5 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1三個流速，分別對20℃、25℃、30℃ 三個柱溫時，紅景天苷和木樨草苷的分離度進行比較，最后確定在流速為1.0 mL·min-1、柱溫為25℃，以乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液作為流動相進行梯度洗脫，能夠達到比較滿意的分離效果。

表1 高效液相色譜流動相梯度洗脫順序

表2 紅景天苷、木樨草苷的加樣回收率試驗（n=9）

表3 尿血寧合劑中紅景天苷、木樨草苷的含量（n=3）

本研究以尿血寧合劑中紅景天苷和木樨草苷的含量為指標，通過高效液相色譜法建立同時測定女貞子、墨旱蓮2種藥材的含量測定方法；經(jīng)系統(tǒng)適用性試驗和方法學驗證研究，樣品中上述2種成分能較好分離，該檢測方法準確、可行，可作為尿血寧合劑質(zhì)量標準的檢測方法之一，用于本制劑的質(zhì)量控制。

根據(jù)本研究測定女貞子、墨旱蓮2種藥材的含量均值，結(jié)合生產(chǎn)實際，參考回收率實驗取值范圍85.0%～115.0%，以測定均值的85%為限度，暫定每1 mL尿血寧合劑中紅景天苷和木樨草苷含量分別不得低于0.57 mg和0.46 mg。