2株鄰苯二甲酸酯高效降解菌的篩選鑒定及其降解性能

潘 琪，孫 淑，周震峰，2*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，青島 266109；2.青島市農(nóng)村環(huán)境工程研究中心，青島 266109）

鄰苯二甲酸酯（簡(jiǎn)稱PAEs）是一類人工合成的有機(jī)化合物，主要被用作增塑劑和軟化劑，是塑料生產(chǎn)過(guò)程的重要化工原料。全球塑料制品的廣泛使用導(dǎo)致PAEs成為環(huán)境介質(zhì)中最普遍存在的有機(jī)污染物之一[1]。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，PAEs具有內(nèi)分泌干擾性[2-3]，可通過(guò)呼吸、食物攝入和皮膚接觸進(jìn)入人體和動(dòng)物體，干擾人類及其他動(dòng)物正常的內(nèi)分泌活動(dòng)，進(jìn)而影響生殖健康，威脅到人類及其他生物的生存[4-5]。

已有研究證實(shí)，PAEs屬于難降解有機(jī)污染物，在環(huán)境中水解、光解速度較慢，微生物降解是PAEs衰減的主要途徑[6]，馴化分離高效降解菌成為PAEs污染環(huán)境生物修復(fù)的重要基礎(chǔ)性工作[7-8]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者選擇不同的PAEs化合物作為目標(biāo)污染物，從污泥、土壤、河道底泥等環(huán)境介質(zhì)中已經(jīng)成功分離出部分PAEs高效降解菌，包括Gordonia sp.[9]、Sphingobium sp.[10]、Enterobacter sp.[11]、Arthrobacter sp.[12-13]、Achromobacter insolitus[14]、Bacillus sp.[15]、Paenibacillus sp.[16]、Pseudomonas sp.[17-18]、Enterobacter sp.[17]、Rhodococcus sp.[17]、Ensifer sp.[19]、Pseudomonas putida[20]、Chryseobacterium sp.[21]、Mycobacterium sp.[22]、Xanthobacter sp.[23]。由于國(guó)內(nèi)外不同地域土壤和水體中PAEs濃度水平和單體組成存在顯著差異[24-25]，而已經(jīng)報(bào)道的PAEs降解菌適用環(huán)境條件有限，因此，仍有必要進(jìn)一步篩選高效廣譜的PAEs降解菌，為PAEs污染環(huán)境修復(fù)提供更為豐富的菌種資源。

鑒于鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）是目前我國(guó)土壤和水體中最主要的2種PAEs化合物[24]，故本文選擇DBP和DEHP作為目標(biāo)污染物，從土壤中篩選得到2株P(guān)AEs高效降解菌RXX-2和RXX-3，通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化及16S rDNA序列分析等手段對(duì)菌株進(jìn)行了鑒定，并采用搖瓶振蕩培養(yǎng)考察了菌株在不同的環(huán)境條件下對(duì)PAEs的降解性能，旨在為菌株用于PAEs污染環(huán)境修復(fù)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DBP和DEHP購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；高效液相色譜分析所用試劑均為色譜純，其余試劑均為分析純。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g、NaCl 5.0 g、蛋白胨 10.0 g，H2O 1000 mL。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 1.0 g、NaCl 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.4 g、NH4NO30.5 g、CaCl20.1 g、FeCl3·6H2O 0.01 g，H2O 1000 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PAEs降解菌的馴化與分離

從青島市設(shè)施菜地和白沙河沿岸采集土樣，稱10 g土樣分別加入盛有100 mL滅菌蒸餾水的三角瓶中，在30℃、175 r·min-1條件下振蕩混勻。按1%的接種量取上述樣品菌懸液的上清液，加入到DBP/DEHP分別為50 mg·L-1的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中，避光振蕩培養(yǎng)7 d后進(jìn)行下一次傳代，每次傳代逐漸提高DBP和DEHP濃度，濃度系列遞增為50～1000 mg·L-1。每7 d作為一個(gè)馴化周期傳代一次，持續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。取100 μL終期馴化液，涂布于DBP/DEHP濃度相同的無(wú)機(jī)鹽固體平板上，置于30℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)菌落后，觀察其生長(zhǎng)特征，篩選出長(zhǎng)勢(shì)最好的菌株，挑取單菌落將其反復(fù)劃線接種于新的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，直至鏡檢純化為止。

1.2.2 菌株的鑒定

利用微生物生化鑒定試劑對(duì)菌株進(jìn)行生理生化特性的測(cè)定，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)定菌株的16S rRNA序列，并用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。綜合菌株的形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析結(jié)果，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.3 菌懸液的制備

挑取新鮮單菌落接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在搖床中28℃、170 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取出液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)液分裝于50 mL已滅菌的離心管中，在室溫條件下于4000 r·min-1離心分離10 min。棄去上清液后，使用滅菌的生理鹽水（0.9%的NaCl溶液）重懸后再次離心，重復(fù)該過(guò)程3次后，用生理鹽水將菌體調(diào)配成菌懸液（OD600=1.0）。

1.2.4環(huán)境條件對(duì)菌株降解PAEs的影響

（1）pH。將上述菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L-1DBP/DEHP 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，用 0.1 mol·L-1HCl和0.1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH分別為5、6、7、8、9，在接種量1.0%（體積比）、溫度25℃、轉(zhuǎn)速150 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)5 d，測(cè)定剩余PAEs含量，并測(cè)定其OD600值。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，下同。

（2）溫度。將上述菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L-1DBP/DEHP無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，設(shè)置培養(yǎng)溫度為15、20、25、30、35 ℃，在接種量1.0%（體積比）、pH 7、轉(zhuǎn)速150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)5 d，測(cè)定剩余PAEs含量，并測(cè)定其OD600值。

（3）轉(zhuǎn)速。將上述菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L-1DBP/DEHP無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，設(shè)置轉(zhuǎn)速0、100、150、175、200 r·min-1，在接種量為1.0%（體積比）、pH 7、溫度25℃的條件下振蕩培養(yǎng)5 d，測(cè)定剩余PAEs含量，并測(cè)定其OD600值。

（4）接種量。將上述菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L-1DBP/DEHP無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，接種量分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%（體積比），在pH 7、溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速150 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)5 d，測(cè)定剩余PAEs含量，并測(cè)定其OD600值。

（5）最佳條件下菌株對(duì)PAEs的降解性能。依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳降解條件，將菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L-1DBP/DEHP無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5 d，分別在第1、2、3、4、5 d測(cè)定剩余PAEs含量。

1.2.5 PAEs含量的測(cè)定

采取液液萃取法對(duì)樣品中剩余PAEs進(jìn)行提取。向100 mL的DBP/DEHP無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入乙酸乙酯后振蕩30 min，全部移至分液漏斗充分振蕩后靜置分層，收集上層萃取液。用乙酸乙酯洗脫，收集全部洗脫液至雞心瓶中，加入適量無(wú)水硫酸鈉去除水分。在玻璃砂芯漏斗中鋪一定量弗羅里硅土，用乙酸乙酯過(guò)濾并洗脫，收集全部洗脫液至雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，加入色譜級(jí)甲醇定容至1.5 mL，過(guò)有機(jī)系0.22 μm濾膜后采用高效液相色譜儀進(jìn)行分析。

色譜條件為：色譜柱：inertsil ODS-SP（250 mm×4.6 mm i.d.，5.0 μm）；流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：水。采用梯度洗脫：設(shè)定B起始為30%，在20 min內(nèi)勻速下降至5%，而后瞬間降至0%并保持5 min，再回到30%平衡10 min等待下一次進(jìn)樣；總流速：0.8 mL·min-1；柱溫箱溫度：32 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：228 nm。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)

利用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）以確定不同處理組之間的差異，顯著性水平為P＜0.05，利用軟件Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離及生理生化鑒定

經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)，分離得到2株P(guān)AEs降解菌，分別命名為RXX-2、RXX-3。2株降解菌于30℃恒溫培養(yǎng)3～5 d后，對(duì)其菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，詳見(jiàn)圖1。RXX-2菌落呈圓形，淡黃色，黏質(zhì)不透明，邊緣整齊，表面隆起，濕潤(rùn)光滑，直徑一般在0.5～0.8 mm；RXX-3菌落呈圓形，白色，黏質(zhì)不透明，邊緣整齊，表面隆起，濕潤(rùn)光滑，直徑一般在0.1～0.3 mm。

圖1 菌落形態(tài)Figure 1 Colony morphology

利用微生物生化鑒定試劑對(duì)2株降解菌的生理生化特性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。由表可以看出，菌株RXX-2和菌株RXX-3的生理生化特性相似，葡萄糖發(fā)酵、阿拉糖發(fā)酵、檸檬酸鹽試驗(yàn)呈陽(yáng)性，半乳糖發(fā)酵、甘露醇發(fā)酵、肌醇發(fā)酵、山梨醇發(fā)酵、鼠李糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、密二糖發(fā)酵、色氨酸酶、丙酮酸酶、脲酶、精氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、吲哚、硫化氫、硝酸鹽試驗(yàn)呈陰性，不同之處為菌株RXX-2的氧化酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，菌株RXX-3的氧化酶試驗(yàn)呈陰性。

2.2 菌株的16S rDNA分子鑒定

經(jīng)16S rDNA菌種鑒定，并繪制菌株RXX-2和RXX-3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。結(jié)果表明，RXX-2與食異源物鞘氨醇菌（Sphingobium xenophagum）的相似性達(dá)到100%，RXX-3與鰻敗血假單胞菌（Pseudomonas anguilliseptica）的相似性達(dá)到98%，綜合菌株的形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析結(jié)果，初步鑒定菌株RXX-2、RXX-3分別為食異源物鞘氨醇菌（Sphingobium xenophagum）和鰻敗血假單胞菌（Pseudomonas anguilliseptica）。

表1 2株降解菌的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of two degrading strains

2.3 環(huán)境條件對(duì)菌株降解PAEs的影響

2.3.1 pH對(duì)菌株降解PAEs的影響

pH對(duì)菌株降解PAEs的影響見(jiàn)圖3。由圖可知，在pH=5～9的范圍內(nèi)，隨初始pH升高，菌株RXX-2、RXX-3的生長(zhǎng)量及PAEs降解率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，但2株降解菌的最適pH條件略有不同。在初始pH=8條件下菌株RXX-2的生長(zhǎng)和降解能力最強(qiáng)，DBP和DEHP降解率分別達(dá)到32.5%和27.7%，而菌株RXX-3在初始pH=7條件下生長(zhǎng)和降解能力最強(qiáng)，DBP和DEHP降解率分別達(dá)到98.8%和25.3%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，菌株RXX-2在中性偏堿性（pH=7、8、9）條件下對(duì)PAEs的降解率顯著高于酸性條件，這與文獻(xiàn)[26]報(bào)道的紅球菌（Rhodococcus sp.）相似，該菌株在中性偏堿性（pH=7、8）條件下生長(zhǎng)降解狀況最佳，其原因可能是PAEs在降解過(guò)程中會(huì)代謝成鄰苯二甲酸、原兒茶酸等酸性物質(zhì)所致[27]，而菌株RXX-3在中性偏酸性（pH=5、6、7）條件下對(duì)PAEs的降解率顯著高于堿性條件，表明2株降解菌分別適于不同酸堿環(huán)境的PAEs污染修復(fù)。

2.3.2溫度對(duì)菌株降解PAEs的影響

溫度對(duì)菌株降解PAEs的影響見(jiàn)圖4。由圖可知，在培養(yǎng)溫度為15～35℃范圍內(nèi)，菌株RXX-2、RXX-3的生長(zhǎng)量及PAEs的降解率隨溫度的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。菌株RXX-2和RXX-3的最適生長(zhǎng)溫度分別為25℃和30℃，溫度過(guò)低（15℃）會(huì)明顯影響菌株的生長(zhǎng)，降解活性較低，當(dāng)溫度升至30℃時(shí)，PAEs降解率達(dá)到最高值，此時(shí)菌株RXX-2對(duì)DBP和DEHP降解率分別達(dá)到46.6%和31.2%，菌株RXX-3對(duì)DBP和DEHP降解率分別達(dá)到97.7%和43.7%，當(dāng)溫度繼續(xù)升至35℃時(shí)，DBP和DEHP的降解率均顯著低于30℃條件。該現(xiàn)象與其他學(xué)者[28-31]研究菌株在不同溫度條件下降解PAEs的結(jié)論一致，其原因可能是溫度會(huì)影響菌體的酶、核酸、蛋白質(zhì)等組分，繼而影響其細(xì)胞生長(zhǎng)速率和生物化學(xué)反應(yīng)速率[32]。

圖2 菌株RXX-2和RXX-3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree of strain RXX-2 and RXX-3

圖3 pH對(duì)菌株降解PAEs的影響Figure 3 Effect of pH on degradation of PAEs by strains

2.3.3轉(zhuǎn)速對(duì)菌株降解PAEs的影響

轉(zhuǎn)速對(duì)菌株降解PAEs的影響見(jiàn)圖5。由圖可知，在轉(zhuǎn)速為0～200 r·min-1的范圍內(nèi)，菌株 RXX-2、RXX-3的生長(zhǎng)量及PAEs降解率隨轉(zhuǎn)速的升高均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。菌株RXX-2和RXX-3分別在轉(zhuǎn)速 150 r·min-1和 175 r·min-1條件下生長(zhǎng)量最高，但在轉(zhuǎn)速為175 r·min-1時(shí)2株降解菌均表現(xiàn)出最強(qiáng)的降解能力，菌株RXX-2對(duì)DBP和DEHP降解率分別達(dá)到50.2%和34.7%，菌株RXX-3對(duì)DBP和DEHP降解率分別達(dá)到87.5%和37.9%。由此表明，轉(zhuǎn)速過(guò)快或過(guò)慢都影響2菌株的生長(zhǎng)，導(dǎo)致降解活性降低，這與周長(zhǎng)健[33]分離的節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）JQ-1相似，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速在150～175 r·min-1之間時(shí)，菌株的生長(zhǎng)降解狀況最佳，其原因可能是由于搖床轉(zhuǎn)速間接地反映了培養(yǎng)液中溶解氧（DO）含量，提高轉(zhuǎn)速有利于空氣中的氧氣向培養(yǎng)基擴(kuò)散，從而更好地滿足菌株生長(zhǎng)代謝的需求，但當(dāng)轉(zhuǎn)速過(guò)高時(shí)，菌株生長(zhǎng)趨勢(shì)開(kāi)始變得緩慢，可能是由于搖床振蕩過(guò)快造成菌株細(xì)胞破裂或培養(yǎng)液中DO已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)[34]。

2.3.4接種量對(duì)菌株降解PAEs的影響

接種量對(duì)菌株降解PAEs的影響見(jiàn)圖6。由圖可知，在未接種降解菌的條件下，DBP和DEHP降解率很低，隨著菌液接種量的提高，2菌株的生長(zhǎng)量及PAEs降解率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。菌株RXX-2、RXX-3均在接種量1.0%的條件下生長(zhǎng)量最高，菌株RXX-2在接種量為1.5%時(shí)對(duì)PAEs的降解能力顯著高于其他接種量條件，DBP和DEHP降解率分別達(dá)到43.9%和39.1%，而菌株RXX-3在接種量為1.0%時(shí)對(duì)PAEs的降解能力最強(qiáng)，DBP和DEHP降解率分別達(dá)到91.0%和42.4%，尤其是對(duì)DEHP的降解能力顯著高于其他的接種量條件。在正常情況下，菌液的接種量越高越有利于污染物的降解，但隨著接種量的不斷提高，較高的細(xì)菌數(shù)會(huì)形成對(duì)底物的競(jìng)爭(zhēng)性利用，導(dǎo)致供單位微生物支配的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，從而部分細(xì)菌會(huì)死亡，菌株降解活性下降，故表現(xiàn)為菌株在較高接種量時(shí)對(duì)底物的降解率反而降低[35]。

圖4 溫度對(duì)菌株降解PAEs的影響Figure 4 Effect of temperature on degradation of PAEs by strains

圖6 接種量對(duì)菌株降解PAEs的影響Figure 6 Effect of inoculation amount on degradation of PAEs by strains

2.4 最佳條件下菌株對(duì)PAEs的降解性能

最佳條件下菌株對(duì)PAEs的降解性能見(jiàn)圖7。由圖可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株RXX-2、RXX-3對(duì)DBP和DEHP的降解率持續(xù)升高，第3 d時(shí)，菌株RXX-3對(duì)DBP的降解率已超過(guò)90%，到培養(yǎng)末期，菌株RXX-2和RXX-3對(duì)DBP的降解率分別達(dá)到71.43%和98.98%，對(duì)DEHP的降解率分別達(dá)到52.85%和62.96%。在整個(gè)培養(yǎng)期，菌株RXX-3對(duì)DBP和DEHP的降解能力始終高于菌株RXX-2，且DBP的降解率始終高于DEHP，這主要是由于DBP的分子摩爾質(zhì)量（278.4 g·mol-1）和lgKow（4.45，Kow為辛醇-水分配系數(shù)）均小于DEHP（分別為390.6 g·mol-1、7.50），而水溶解度（11.2 mg·L-1）高于 DEHP（0.003 mg·L-1）[2]，導(dǎo)致其微生物利用率相對(duì)較高，降解速率較快。

圖7 最佳條件下菌株對(duì)PAEs的降解性能Figure 7 Degradation rates of strains to PAEs under the optimal conditions

3 結(jié)論

（1）從土壤中分離得到2株P(guān)AEs降解菌RXX-2、RXX-3，初步鑒定2菌株分別為食異源物鞘氨醇菌（Sphingobium xenophagum）和鰻敗血假單胞菌（Pseudomonas anguilliseptica）。

（2）菌株RXX-2降解PAEs的最佳條件為pH 8、溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速175 r·min-1、接種量1.5%，而菌株RXX-3的最佳條件為pH 7、溫度30℃、轉(zhuǎn)速175 r·min-1、接種量1.0%。

（3）在最佳降解條件下，經(jīng)過(guò)5 d的培養(yǎng)，菌株RXX-2對(duì)DBP和DEHP的降解率分別達(dá)到71.43%和52.85%，RXX-3對(duì)DBP和DEHP的降解率分別達(dá)到98.98%和62.96%，表明篩選得到的2株降解菌在PAEs污染環(huán)境的生物修復(fù)方面具有良好的應(yīng)用前景。