• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    2株鄰苯二甲酸酯高效降解菌的篩選鑒定及其降解性能

    2019-10-23 06:01:04周震峰
    關(guān)鍵詞:無(wú)機(jī)鹽懸液生長(zhǎng)量

    潘 琪,孫 淑,周震峰,2*

    (1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,青島 266109;2.青島市農(nóng)村環(huán)境工程研究中心,青島 266109)

    鄰苯二甲酸酯(簡(jiǎn)稱PAEs)是一類人工合成的有機(jī)化合物,主要被用作增塑劑和軟化劑,是塑料生產(chǎn)過(guò)程的重要化工原料。全球塑料制品的廣泛使用導(dǎo)致PAEs成為環(huán)境介質(zhì)中最普遍存在的有機(jī)污染物之一[1]。國(guó)內(nèi)外大量研究表明,PAEs具有內(nèi)分泌干擾性[2-3],可通過(guò)呼吸、食物攝入和皮膚接觸進(jìn)入人體和動(dòng)物體,干擾人類及其他動(dòng)物正常的內(nèi)分泌活動(dòng),進(jìn)而影響生殖健康,威脅到人類及其他生物的生存[4-5]。

    已有研究證實(shí),PAEs屬于難降解有機(jī)污染物,在環(huán)境中水解、光解速度較慢,微生物降解是PAEs衰減的主要途徑[6],馴化分離高效降解菌成為PAEs污染環(huán)境生物修復(fù)的重要基礎(chǔ)性工作[7-8]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者選擇不同的PAEs化合物作為目標(biāo)污染物,從污泥、土壤、河道底泥等環(huán)境介質(zhì)中已經(jīng)成功分離出部分PAEs高效降解菌,包括Gordonia sp.[9]、Sphingobium sp.[10]、Enterobacter sp.[11]、Arthrobacter sp.[12-13]、Achromobacter insolitus[14]、Bacillus sp.[15]、Paenibacillus sp.[16]、Pseudomonas sp.[17-18]、Enterobacter sp.[17]、Rhodococcus sp.[17]、Ensifer sp.[19]、Pseudomonas putida[20]、Chryseobacterium sp.[21]、Mycobacterium sp.[22]、Xanthobacter sp.[23]。由于國(guó)內(nèi)外不同地域土壤和水體中PAEs濃度水平和單體組成存在顯著差異[24-25],而已經(jīng)報(bào)道的PAEs降解菌適用環(huán)境條件有限,因此,仍有必要進(jìn)一步篩選高效廣譜的PAEs降解菌,為PAEs污染環(huán)境修復(fù)提供更為豐富的菌種資源。

    鑒于鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)是目前我國(guó)土壤和水體中最主要的2種PAEs化合物[24],故本文選擇DBP和DEHP作為目標(biāo)污染物,從土壤中篩選得到2株P(guān)AEs高效降解菌RXX-2和RXX-3,通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化及16S rDNA序列分析等手段對(duì)菌株進(jìn)行了鑒定,并采用搖瓶振蕩培養(yǎng)考察了菌株在不同的環(huán)境條件下對(duì)PAEs的降解性能,旨在為菌株用于PAEs污染環(huán)境修復(fù)提供一定的參考依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    DBP和DEHP購(gòu)自北京百靈威科技有限公司;高效液相色譜分析所用試劑均為色譜純,其余試劑均為分析純。

    牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g、NaCl 5.0 g、蛋白胨 10.0 g,H2O 1000 mL。

    無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基:K2HPO4·3H2O 1.0 g、NaCl 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.4 g、NH4NO30.5 g、CaCl20.1 g、FeCl3·6H2O 0.01 g,H2O 1000 mL。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 PAEs降解菌的馴化與分離

    從青島市設(shè)施菜地和白沙河沿岸采集土樣,稱10 g土樣分別加入盛有100 mL滅菌蒸餾水的三角瓶中,在30℃、175 r·min-1條件下振蕩混勻。按1%的接種量取上述樣品菌懸液的上清液,加入到DBP/DEHP分別為50 mg·L-1的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中,避光振蕩培養(yǎng)7 d后進(jìn)行下一次傳代,每次傳代逐漸提高DBP和DEHP濃度,濃度系列遞增為50~1000 mg·L-1。每7 d作為一個(gè)馴化周期傳代一次,持續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。取100 μL終期馴化液,涂布于DBP/DEHP濃度相同的無(wú)機(jī)鹽固體平板上,置于30℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)菌落后,觀察其生長(zhǎng)特征,篩選出長(zhǎng)勢(shì)最好的菌株,挑取單菌落將其反復(fù)劃線接種于新的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上,直至鏡檢純化為止。

    1.2.2 菌株的鑒定

    利用微生物生化鑒定試劑對(duì)菌株進(jìn)行生理生化特性的測(cè)定,委托生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)定菌株的16S rRNA序列,并用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。綜合菌株的形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析結(jié)果,對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

    1.2.3 菌懸液的制備

    挑取新鮮單菌落接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,在搖床中28℃、170 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取出液體培養(yǎng)基,將培養(yǎng)液分裝于50 mL已滅菌的離心管中,在室溫條件下于4000 r·min-1離心分離10 min。棄去上清液后,使用滅菌的生理鹽水(0.9%的NaCl溶液)重懸后再次離心,重復(fù)該過(guò)程3次后,用生理鹽水將菌體調(diào)配成菌懸液(OD600=1.0)。

    1.2.4環(huán)境條件對(duì)菌株降解PAEs的影響

    (1)pH。將上述菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L-1DBP/DEHP 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,用 0.1 mol·L-1HCl和0.1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH分別為5、6、7、8、9,在接種量1.0%(體積比)、溫度25℃、轉(zhuǎn)速150 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)5 d,測(cè)定剩余PAEs含量,并測(cè)定其OD600值。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù),下同。

    (2)溫度。將上述菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L-1DBP/DEHP無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,設(shè)置培養(yǎng)溫度為15、20、25、30、35 ℃,在接種量1.0%(體積比)、pH 7、轉(zhuǎn)速150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)5 d,測(cè)定剩余PAEs含量,并測(cè)定其OD600值。

    (3)轉(zhuǎn)速。將上述菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L-1DBP/DEHP無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,設(shè)置轉(zhuǎn)速0、100、150、175、200 r·min-1,在接種量為1.0%(體積比)、pH 7、溫度25℃的條件下振蕩培養(yǎng)5 d,測(cè)定剩余PAEs含量,并測(cè)定其OD600值。

    (4)接種量。將上述菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L-1DBP/DEHP無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,接種量分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(體積比),在pH 7、溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速150 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)5 d,測(cè)定剩余PAEs含量,并測(cè)定其OD600值。

    (5)最佳條件下菌株對(duì)PAEs的降解性能。依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳降解條件,將菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L-1DBP/DEHP無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)5 d,分別在第1、2、3、4、5 d測(cè)定剩余PAEs含量。

    1.2.5 PAEs含量的測(cè)定

    采取液液萃取法對(duì)樣品中剩余PAEs進(jìn)行提取。向100 mL的DBP/DEHP無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入乙酸乙酯后振蕩30 min,全部移至分液漏斗充分振蕩后靜置分層,收集上層萃取液。用乙酸乙酯洗脫,收集全部洗脫液至雞心瓶中,加入適量無(wú)水硫酸鈉去除水分。在玻璃砂芯漏斗中鋪一定量弗羅里硅土,用乙酸乙酯過(guò)濾并洗脫,收集全部洗脫液至雞心瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干,加入色譜級(jí)甲醇定容至1.5 mL,過(guò)有機(jī)系0.22 μm濾膜后采用高效液相色譜儀進(jìn)行分析。

    色譜條件為:色譜柱:inertsil ODS-SP(250 mm×4.6 mm i.d.,5.0 μm);流動(dòng)相A:甲醇,流動(dòng)相B:水。采用梯度洗脫:設(shè)定B起始為30%,在20 min內(nèi)勻速下降至5%,而后瞬間降至0%并保持5 min,再回到30%平衡10 min等待下一次進(jìn)樣;總流速:0.8 mL·min-1;柱溫箱溫度:32 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):228 nm。

    1.2.6 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)

    利用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)以確定不同處理組之間的差異,顯著性水平為P<0.05,利用軟件Origin 9.0作圖。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 菌株的分離及生理生化鑒定

    經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng),分離得到2株P(guān)AEs降解菌,分別命名為RXX-2、RXX-3。2株降解菌于30℃恒溫培養(yǎng)3~5 d后,對(duì)其菌落形態(tài)進(jìn)行觀察,詳見(jiàn)圖1。RXX-2菌落呈圓形,淡黃色,黏質(zhì)不透明,邊緣整齊,表面隆起,濕潤(rùn)光滑,直徑一般在0.5~0.8 mm;RXX-3菌落呈圓形,白色,黏質(zhì)不透明,邊緣整齊,表面隆起,濕潤(rùn)光滑,直徑一般在0.1~0.3 mm。

    圖1 菌落形態(tài)Figure 1 Colony morphology

    利用微生物生化鑒定試劑對(duì)2株降解菌的生理生化特性進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。由表可以看出,菌株RXX-2和菌株RXX-3的生理生化特性相似,葡萄糖發(fā)酵、阿拉糖發(fā)酵、檸檬酸鹽試驗(yàn)呈陽(yáng)性,半乳糖發(fā)酵、甘露醇發(fā)酵、肌醇發(fā)酵、山梨醇發(fā)酵、鼠李糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、密二糖發(fā)酵、色氨酸酶、丙酮酸酶、脲酶、精氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、吲哚、硫化氫、硝酸鹽試驗(yàn)呈陰性,不同之處為菌株RXX-2的氧化酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性,菌株RXX-3的氧化酶試驗(yàn)呈陰性。

    2.2 菌株的16S rDNA分子鑒定

    經(jīng)16S rDNA菌種鑒定,并繪制菌株RXX-2和RXX-3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。結(jié)果表明,RXX-2與食異源物鞘氨醇菌(Sphingobium xenophagum)的相似性達(dá)到100%,RXX-3與鰻敗血假單胞菌(Pseudomonas anguilliseptica)的相似性達(dá)到98%,綜合菌株的形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析結(jié)果,初步鑒定菌株RXX-2、RXX-3分別為食異源物鞘氨醇菌(Sphingobium xenophagum)和鰻敗血假單胞菌(Pseudomonas anguilliseptica)。

    表1 2株降解菌的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of two degrading strains

    2.3 環(huán)境條件對(duì)菌株降解PAEs的影響

    2.3.1 pH對(duì)菌株降解PAEs的影響

    pH對(duì)菌株降解PAEs的影響見(jiàn)圖3。由圖可知,在pH=5~9的范圍內(nèi),隨初始pH升高,菌株RXX-2、RXX-3的生長(zhǎng)量及PAEs降解率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),但2株降解菌的最適pH條件略有不同。在初始pH=8條件下菌株RXX-2的生長(zhǎng)和降解能力最強(qiáng),DBP和DEHP降解率分別達(dá)到32.5%和27.7%,而菌株RXX-3在初始pH=7條件下生長(zhǎng)和降解能力最強(qiáng),DBP和DEHP降解率分別達(dá)到98.8%和25.3%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),菌株RXX-2在中性偏堿性(pH=7、8、9)條件下對(duì)PAEs的降解率顯著高于酸性條件,這與文獻(xiàn)[26]報(bào)道的紅球菌(Rhodococcus sp.)相似,該菌株在中性偏堿性(pH=7、8)條件下生長(zhǎng)降解狀況最佳,其原因可能是PAEs在降解過(guò)程中會(huì)代謝成鄰苯二甲酸、原兒茶酸等酸性物質(zhì)所致[27],而菌株RXX-3在中性偏酸性(pH=5、6、7)條件下對(duì)PAEs的降解率顯著高于堿性條件,表明2株降解菌分別適于不同酸堿環(huán)境的PAEs污染修復(fù)。

    2.3.2溫度對(duì)菌株降解PAEs的影響

    溫度對(duì)菌株降解PAEs的影響見(jiàn)圖4。由圖可知,在培養(yǎng)溫度為15~35℃范圍內(nèi),菌株RXX-2、RXX-3的生長(zhǎng)量及PAEs的降解率隨溫度的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。菌株RXX-2和RXX-3的最適生長(zhǎng)溫度分別為25℃和30℃,溫度過(guò)低(15℃)會(huì)明顯影響菌株的生長(zhǎng),降解活性較低,當(dāng)溫度升至30℃時(shí),PAEs降解率達(dá)到最高值,此時(shí)菌株RXX-2對(duì)DBP和DEHP降解率分別達(dá)到46.6%和31.2%,菌株RXX-3對(duì)DBP和DEHP降解率分別達(dá)到97.7%和43.7%,當(dāng)溫度繼續(xù)升至35℃時(shí),DBP和DEHP的降解率均顯著低于30℃條件。該現(xiàn)象與其他學(xué)者[28-31]研究菌株在不同溫度條件下降解PAEs的結(jié)論一致,其原因可能是溫度會(huì)影響菌體的酶、核酸、蛋白質(zhì)等組分,繼而影響其細(xì)胞生長(zhǎng)速率和生物化學(xué)反應(yīng)速率[32]。

    圖2 菌株RXX-2和RXX-3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree of strain RXX-2 and RXX-3

    圖3 pH對(duì)菌株降解PAEs的影響Figure 3 Effect of pH on degradation of PAEs by strains

    2.3.3轉(zhuǎn)速對(duì)菌株降解PAEs的影響

    轉(zhuǎn)速對(duì)菌株降解PAEs的影響見(jiàn)圖5。由圖可知,在轉(zhuǎn)速為0~200 r·min-1的范圍內(nèi),菌株 RXX-2、RXX-3的生長(zhǎng)量及PAEs降解率隨轉(zhuǎn)速的升高均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。菌株RXX-2和RXX-3分別在轉(zhuǎn)速 150 r·min-1和 175 r·min-1條件下生長(zhǎng)量最高,但在轉(zhuǎn)速為175 r·min-1時(shí)2株降解菌均表現(xiàn)出最強(qiáng)的降解能力,菌株RXX-2對(duì)DBP和DEHP降解率分別達(dá)到50.2%和34.7%,菌株RXX-3對(duì)DBP和DEHP降解率分別達(dá)到87.5%和37.9%。由此表明,轉(zhuǎn)速過(guò)快或過(guò)慢都影響2菌株的生長(zhǎng),導(dǎo)致降解活性降低,這與周長(zhǎng)健[33]分離的節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)JQ-1相似,當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速在150~175 r·min-1之間時(shí),菌株的生長(zhǎng)降解狀況最佳,其原因可能是由于搖床轉(zhuǎn)速間接地反映了培養(yǎng)液中溶解氧(DO)含量,提高轉(zhuǎn)速有利于空氣中的氧氣向培養(yǎng)基擴(kuò)散,從而更好地滿足菌株生長(zhǎng)代謝的需求,但當(dāng)轉(zhuǎn)速過(guò)高時(shí),菌株生長(zhǎng)趨勢(shì)開(kāi)始變得緩慢,可能是由于搖床振蕩過(guò)快造成菌株細(xì)胞破裂或培養(yǎng)液中DO已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)[34]。

    2.3.4接種量對(duì)菌株降解PAEs的影響

    接種量對(duì)菌株降解PAEs的影響見(jiàn)圖6。由圖可知,在未接種降解菌的條件下,DBP和DEHP降解率很低,隨著菌液接種量的提高,2菌株的生長(zhǎng)量及PAEs降解率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。菌株RXX-2、RXX-3均在接種量1.0%的條件下生長(zhǎng)量最高,菌株RXX-2在接種量為1.5%時(shí)對(duì)PAEs的降解能力顯著高于其他接種量條件,DBP和DEHP降解率分別達(dá)到43.9%和39.1%,而菌株RXX-3在接種量為1.0%時(shí)對(duì)PAEs的降解能力最強(qiáng),DBP和DEHP降解率分別達(dá)到91.0%和42.4%,尤其是對(duì)DEHP的降解能力顯著高于其他的接種量條件。在正常情況下,菌液的接種量越高越有利于污染物的降解,但隨著接種量的不斷提高,較高的細(xì)菌數(shù)會(huì)形成對(duì)底物的競(jìng)爭(zhēng)性利用,導(dǎo)致供單位微生物支配的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少,從而部分細(xì)菌會(huì)死亡,菌株降解活性下降,故表現(xiàn)為菌株在較高接種量時(shí)對(duì)底物的降解率反而降低[35]。

    圖4 溫度對(duì)菌株降解PAEs的影響Figure 4 Effect of temperature on degradation of PAEs by strains

    圖6 接種量對(duì)菌株降解PAEs的影響Figure 6 Effect of inoculation amount on degradation of PAEs by strains

    2.4 最佳條件下菌株對(duì)PAEs的降解性能

    最佳條件下菌株對(duì)PAEs的降解性能見(jiàn)圖7。由圖可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),菌株RXX-2、RXX-3對(duì)DBP和DEHP的降解率持續(xù)升高,第3 d時(shí),菌株RXX-3對(duì)DBP的降解率已超過(guò)90%,到培養(yǎng)末期,菌株RXX-2和RXX-3對(duì)DBP的降解率分別達(dá)到71.43%和98.98%,對(duì)DEHP的降解率分別達(dá)到52.85%和62.96%。在整個(gè)培養(yǎng)期,菌株RXX-3對(duì)DBP和DEHP的降解能力始終高于菌株RXX-2,且DBP的降解率始終高于DEHP,這主要是由于DBP的分子摩爾質(zhì)量(278.4 g·mol-1)和lgKow(4.45,Kow為辛醇-水分配系數(shù))均小于DEHP(分別為390.6 g·mol-1、7.50),而水溶解度(11.2 mg·L-1)高于 DEHP(0.003 mg·L-1)[2],導(dǎo)致其微生物利用率相對(duì)較高,降解速率較快。

    圖7 最佳條件下菌株對(duì)PAEs的降解性能Figure 7 Degradation rates of strains to PAEs under the optimal conditions

    3 結(jié)論

    (1)從土壤中分離得到2株P(guān)AEs降解菌RXX-2、RXX-3,初步鑒定2菌株分別為食異源物鞘氨醇菌(Sphingobium xenophagum)和鰻敗血假單胞菌(Pseudomonas anguilliseptica)。

    (2)菌株RXX-2降解PAEs的最佳條件為pH 8、溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速175 r·min-1、接種量1.5%,而菌株RXX-3的最佳條件為pH 7、溫度30℃、轉(zhuǎn)速175 r·min-1、接種量1.0%。

    (3)在最佳降解條件下,經(jīng)過(guò)5 d的培養(yǎng),菌株RXX-2對(duì)DBP和DEHP的降解率分別達(dá)到71.43%和52.85%,RXX-3對(duì)DBP和DEHP的降解率分別達(dá)到98.98%和62.96%,表明篩選得到的2株降解菌在PAEs污染環(huán)境的生物修復(fù)方面具有良好的應(yīng)用前景。

    猜你喜歡
    無(wú)機(jī)鹽懸液生長(zhǎng)量
    2021年《無(wú)機(jī)鹽工業(yè)》總索引
    日本落葉松人工林生長(zhǎng)規(guī)律分析
    綠色科技(2021年21期)2021-11-26 09:12:06
    北大河林業(yè)局森林生長(zhǎng)量、枯損量調(diào)查與分析
    磺胺嘧啶銀混懸液在二度燒傷創(chuàng)面治療中的應(yīng)用
    宜春區(qū)域南方紅豆杉生境及其生長(zhǎng)量分析
    薯蕷皂苷元納米混懸液的制備
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:28
    無(wú)機(jī)鹽對(duì)氣藏砂巖表面動(dòng)態(tài)潤(rùn)濕性的影響研究
    霧化吸入布地奈德混懸液治療COPD急性加重期的效果觀察
    華山松中幼林撫育和未撫育對(duì)生長(zhǎng)量的影響
    河南科技(2014年24期)2014-02-27 14:19:48
    生產(chǎn)無(wú)機(jī)鹽的原料
    ——化工原料、農(nóng)副產(chǎn)品
    亚洲国产精品999在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产淫片久久久久久久久 | 99热只有精品国产| 国产不卡一卡二| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品一区二区免费欧美| 伊人久久精品亚洲午夜| 婷婷亚洲欧美| 亚洲经典国产精华液单 | 色综合站精品国产| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 午夜亚洲福利在线播放| 日韩欧美免费精品| 18禁在线播放成人免费| 色哟哟·www| a级毛片免费高清观看在线播放| av在线天堂中文字幕| 日日干狠狠操夜夜爽| 男插女下体视频免费在线播放| 性色av乱码一区二区三区2| 97超视频在线观看视频| 男女之事视频高清在线观看| 69av精品久久久久久| 99国产综合亚洲精品| 一二三四社区在线视频社区8| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲国产精品sss在线观看| 午夜福利欧美成人| 亚洲综合色惰| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 精品午夜福利在线看| 床上黄色一级片| 俄罗斯特黄特色一大片| 一级毛片久久久久久久久女| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 岛国在线免费视频观看| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 观看免费一级毛片| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久久国产成人免费| 国产色婷婷99| 国产免费一级a男人的天堂| 美女黄网站色视频| 性色avwww在线观看| www.熟女人妻精品国产| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 日本一二三区视频观看| 又爽又黄a免费视频| 亚洲av五月六月丁香网| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产单亲对白刺激| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久精品91蜜桃| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 色哟哟·www| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久亚洲真实| 国产美女午夜福利| 免费黄网站久久成人精品 | 草草在线视频免费看| 久久这里只有精品中国| 亚洲国产欧美人成| 日韩av在线大香蕉| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产v大片淫在线免费观看| 久久精品国产亚洲av天美| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 观看免费一级毛片| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国语自产精品视频在线第100页| 九九在线视频观看精品| av中文乱码字幕在线| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久精品国产清高在天天线| 性色avwww在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 久久6这里有精品| 最新在线观看一区二区三区| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久久久久久久大av| 久久久久国内视频| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 丰满乱子伦码专区| bbb黄色大片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 少妇人妻一区二区三区视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 91麻豆av在线| 欧美最新免费一区二区三区 | 亚洲人成伊人成综合网2020| 黄色配什么色好看| 一a级毛片在线观看| 69av精品久久久久久| 亚洲不卡免费看| 婷婷精品国产亚洲av| www.色视频.com| 一区二区三区免费毛片| 99精品在免费线老司机午夜| 深夜a级毛片| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 女人被狂操c到高潮| 伊人久久精品亚洲午夜| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产成人影院久久av| 国产色爽女视频免费观看| 日本黄大片高清| 精品久久久久久久久av| 欧美丝袜亚洲另类 | 中文字幕av成人在线电影| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品久久久久久久久亚洲 | 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲熟妇熟女久久| 性欧美人与动物交配| 亚洲最大成人中文| 香蕉av资源在线| 午夜老司机福利剧场| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 90打野战视频偷拍视频| 免费黄网站久久成人精品 | 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 午夜日韩欧美国产| 美女大奶头视频| 久久久久久久精品吃奶| 淫妇啪啪啪对白视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 嫩草影院精品99| 久久久国产成人精品二区| 亚洲最大成人中文| 免费高清视频大片| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久久久久久久久成人| 国产91精品成人一区二区三区| 青草久久国产| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲国产精品sss在线观看| 男女视频在线观看网站免费| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产主播在线观看一区二区| 免费观看的影片在线观看| 免费在线观看日本一区| 美女大奶头视频| 最近最新免费中文字幕在线| 看片在线看免费视频| 亚洲精品一区av在线观看| 日本a在线网址| 国产av一区在线观看免费| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品伦人一区二区| 国产午夜福利久久久久久| 麻豆国产97在线/欧美| 色视频www国产| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 美女大奶头视频| 少妇丰满av| 亚洲在线观看片| 91九色精品人成在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 国产免费一级a男人的天堂| 美女免费视频网站| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 最后的刺客免费高清国语| 久久草成人影院| 免费一级毛片在线播放高清视频| 成人特级黄色片久久久久久久| av国产免费在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 国产人妻一区二区三区在| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日韩精品中文字幕看吧| 无遮挡黄片免费观看| a级毛片a级免费在线| 亚洲最大成人手机在线| 99国产精品一区二区三区| 久久久久久久久大av| 一进一出抽搐动态| 久久香蕉精品热| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲精品456在线播放app | 日韩免费av在线播放| 免费看美女性在线毛片视频| 国产高清三级在线| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲av熟女| av在线老鸭窝| 日韩中字成人| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 宅男免费午夜| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美最新免费一区二区三区 | 日韩欧美国产在线观看| 97碰自拍视频| 久久久久九九精品影院| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va | 97碰自拍视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 又爽又黄无遮挡网站| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国产精品美女特级片免费视频播放器| www.熟女人妻精品国产| 一级黄色大片毛片| 精品人妻熟女av久视频| 国产v大片淫在线免费观看| 丁香六月欧美| 午夜福利欧美成人| 亚洲人成伊人成综合网2020| 不卡一级毛片| 国产精品久久视频播放| 内射极品少妇av片p| 97超视频在线观看视频| 亚洲人成网站在线播| 成人av一区二区三区在线看| 一区二区三区免费毛片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 99热只有精品国产| 蜜桃久久精品国产亚洲av| ponron亚洲| 欧美zozozo另类| 成人一区二区视频在线观看| 免费av毛片视频| 国产中年淑女户外野战色| 精品福利观看| 制服丝袜大香蕉在线| av在线老鸭窝| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 男女那种视频在线观看| 午夜影院日韩av| 美女cb高潮喷水在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产成人欧美在线观看| 好男人电影高清在线观看| 一区二区三区免费毛片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 色av中文字幕| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产成人aa在线观看| 免费在线观看日本一区| 欧美又色又爽又黄视频| 一个人免费在线观看电影| 精品人妻熟女av久视频| 高清毛片免费观看视频网站| 99热这里只有是精品在线观看 | 久久久久久国产a免费观看| 午夜免费激情av| 黄色丝袜av网址大全| av天堂中文字幕网| 长腿黑丝高跟| 国产精品一区二区免费欧美| 草草在线视频免费看| 桃色一区二区三区在线观看| 国内精品美女久久久久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 看片在线看免费视频| 色吧在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 美女cb高潮喷水在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲人成网站在线播| av天堂在线播放| 国产亚洲精品久久久com| 婷婷亚洲欧美| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久久久久久午夜电影| 中文字幕久久专区| 亚洲,欧美精品.| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 长腿黑丝高跟| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产高清激情床上av| 久久久久性生活片| 国产乱人视频| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲成人免费电影在线观看| 成人无遮挡网站| 欧美+日韩+精品| 国产黄a三级三级三级人| 免费黄网站久久成人精品 | 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 亚洲最大成人手机在线| 在线观看免费视频日本深夜| 天天躁日日操中文字幕| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 十八禁国产超污无遮挡网站| 一进一出好大好爽视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 欧美又色又爽又黄视频| 很黄的视频免费| 精品一区二区三区人妻视频| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产午夜福利久久久久久| 天天躁日日操中文字幕| 黄色一级大片看看| 久久久久久久精品吃奶| 婷婷亚洲欧美| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产精品乱码一区二三区的特点| 制服丝袜大香蕉在线| 9191精品国产免费久久| 国产黄a三级三级三级人| 男女那种视频在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 精品久久久久久成人av| 少妇丰满av| 一级av片app| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久久久九九精品影院| 91九色精品人成在线观看| 最新中文字幕久久久久| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲,欧美,日韩| 国产免费av片在线观看野外av| 成年人黄色毛片网站| 在线播放无遮挡| 国产不卡一卡二| 亚洲最大成人手机在线| 国产探花极品一区二区| 亚洲自偷自拍三级| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品1区2区在线观看.| 深夜精品福利| 国产成人欧美在线观看| 国内精品美女久久久久久| 淫秽高清视频在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产三级中文精品| 午夜老司机福利剧场| 欧美潮喷喷水| avwww免费| 国产亚洲精品久久久com| 免费av观看视频| 久久精品国产自在天天线| 青草久久国产| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲在线观看片| 亚洲真实伦在线观看| 久久午夜福利片| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 午夜福利免费观看在线| 欧美日本视频| 舔av片在线| 人人妻人人看人人澡| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲三级黄色毛片| 久久热精品热| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美日韩黄片免| 男插女下体视频免费在线播放| 99视频精品全部免费 在线| 嫩草影院入口| 在线天堂最新版资源| 97热精品久久久久久| h日本视频在线播放| 欧美zozozo另类| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 色在线成人网| 色视频www国产| 午夜福利18| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲精品在线观看二区| 日本黄色片子视频| 欧美在线黄色| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 2021天堂中文幕一二区在线观| 99热6这里只有精品| 亚洲专区中文字幕在线| 一级黄片播放器| av中文乱码字幕在线| 免费在线观看成人毛片| 美女大奶头视频| 免费看日本二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲av不卡在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 内地一区二区视频在线| 久久久久久久久大av| 级片在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲国产欧美人成| 9191精品国产免费久久| 最近中文字幕高清免费大全6 | 在线天堂最新版资源| 高清毛片免费观看视频网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 精品熟女少妇八av免费久了| 最好的美女福利视频网| 成人鲁丝片一二三区免费| 精华霜和精华液先用哪个| 人妻久久中文字幕网| 国产高清激情床上av| 色尼玛亚洲综合影院| 宅男免费午夜| 脱女人内裤的视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产精品乱码一区二三区的特点| 一个人观看的视频www高清免费观看| 精品福利观看| 桃红色精品国产亚洲av| 免费在线观看影片大全网站| 热99re8久久精品国产| 午夜免费成人在线视频| 国产v大片淫在线免费观看| avwww免费| 亚洲第一电影网av| 国产高清视频在线观看网站| 国产精品电影一区二区三区| 欧美一区二区亚洲| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 俺也久久电影网| 1000部很黄的大片| 热99re8久久精品国产| 亚洲美女黄片视频| 精品久久久久久成人av| 久久久久久久久久黄片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲性夜色夜夜综合| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 三级国产精品欧美在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 国产成人影院久久av| 全区人妻精品视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 日韩免费av在线播放| 亚洲人成伊人成综合网2020| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲人成网站在线播| 免费电影在线观看免费观看| 成人美女网站在线观看视频| 久久久久久大精品| 国产精品亚洲美女久久久| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲成人免费电影在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 久久人人精品亚洲av| 中出人妻视频一区二区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 变态另类丝袜制服| 中文字幕高清在线视频| av在线天堂中文字幕| 色综合婷婷激情| 久久久久久国产a免费观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 男女那种视频在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 一进一出好大好爽视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲国产精品sss在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 久久欧美精品欧美久久欧美| 青草久久国产| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 我要搜黄色片| 久久久久久久久中文| 我要看日韩黄色一级片| 欧美潮喷喷水| 十八禁网站免费在线| 内地一区二区视频在线| 日本与韩国留学比较| 精品日产1卡2卡| 在线免费观看的www视频| 可以在线观看毛片的网站| 欧美日韩乱码在线| av天堂中文字幕网| 欧美日韩福利视频一区二区| 一级a爱片免费观看的视频| 高清在线国产一区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产午夜精品论理片| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲色图av天堂| 欧美乱妇无乱码| 2021天堂中文幕一二区在线观| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 制服丝袜大香蕉在线| 免费av不卡在线播放| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久人人精品亚洲av| 在线播放国产精品三级| 床上黄色一级片| 99国产精品一区二区三区| 午夜免费激情av| 国产精品影院久久| 日本三级黄在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲欧美日韩东京热| 十八禁人妻一区二区| 国产精品影院久久| 日韩欧美在线二视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 91狼人影院| 性色avwww在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 国产欧美日韩一区二区三| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲av熟女| 亚洲成人久久性| 最新在线观看一区二区三区| 精品乱码久久久久久99久播| 人人妻人人看人人澡| 亚洲精华国产精华精| 欧美+亚洲+日韩+国产| 如何舔出高潮| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美激情国产日韩精品一区| 毛片女人毛片| av中文乱码字幕在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 免费大片18禁| .国产精品久久| 在线免费观看不下载黄p国产 | 久久午夜福利片| 在线观看av片永久免费下载| 国产成人啪精品午夜网站| 免费高清视频大片| 欧美激情久久久久久爽电影| 日韩有码中文字幕| avwww免费| 麻豆一二三区av精品| 欧美zozozo另类| ponron亚洲| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲av成人av| 国产精品99久久久久久久久| 久久久色成人| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 男女那种视频在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 久久精品91蜜桃| 亚洲精品456在线播放app | 1024手机看黄色片| 无遮挡黄片免费观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美性感艳星| 精品国产亚洲在线| 免费看日本二区| 亚洲熟妇熟女久久| 国产黄片美女视频| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产 一区 欧美 日韩| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 88av欧美| 欧美精品啪啪一区二区三区| 熟女人妻精品中文字幕| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 亚洲国产色片| 午夜福利欧美成人| 真人做人爱边吃奶动态| 日本免费a在线| 亚洲经典国产精华液单 | 精品久久久久久久久久久久久| www.熟女人妻精品国产| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 观看免费一级毛片| 久久国产乱子伦精品免费另类| 麻豆成人午夜福利视频| 国产精品1区2区在线观看.| 午夜亚洲福利在线播放| 国产欧美日韩精品一区二区| 高清日韩中文字幕在线| 国产成人欧美在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲国产精品合色在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲自偷自拍三级| 直男gayav资源| 国产一区二区在线观看日韩| 99久久精品国产亚洲精品| 日韩人妻高清精品专区| 久久午夜亚洲精品久久| 日本黄色视频三级网站网址| 色精品久久人妻99蜜桃| 白带黄色成豆腐渣| 51午夜福利影视在线观看|