轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲玉米對無脊椎動物多樣性影響研究

任夢云，陳彥君，關(guān) 瀟

（1.中國環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所，杭州 310021；3.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?570228）

利用生物工程手段，將某些外源基因轉(zhuǎn)移到其他生物物種中去，使其表現(xiàn)出原物種不具有的產(chǎn)物和性狀，這種新的生物體稱為遺傳修飾生物體（Genetically modified organisms，GMO）。為滿足人們的生產(chǎn)、生活所需，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因作物具有重大的社會和經(jīng)濟價值，如轉(zhuǎn)基因棉花的商業(yè)化推廣，有效地降低了棉鈴蟲等靶標(biāo)害蟲的數(shù)量，降低了對化學(xué)殺蟲劑的依賴，緩解了害蟲的抗藥性壓力，減緩了殺蟲劑對環(huán)境生態(tài)的影響[1]。

節(jié)肢動物群落作為自然生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，是維持農(nóng)田生態(tài)環(huán)境正常生態(tài)功能的重要因素[2-3]，被廣泛用作農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)功能研究的對象之一。此外，昆蟲群落的多樣性體現(xiàn)了一定范圍內(nèi)生物之間、生物與環(huán)境之間的關(guān)系，因此，昆蟲群落多樣性也是轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全評價的重要指標(biāo)之一。

近年來，針對轉(zhuǎn)基因作物對于田間昆蟲多樣性影響以及蟲害調(diào)查開展了的一系列研究。有研究表明，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米對田間節(jié)肢動物群落多樣性無顯著影響[4-6]；而Cry殺蟲蛋白基因?qū)喼抻衩酌憩F(xiàn)出一定毒力[7]，已被廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)生物農(nóng)藥和植物轉(zhuǎn)基因工程。近年來，由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米因可以有效降低玉米螟的危害而被廣泛應(yīng)用[8]。

線蟲是土壤生態(tài)系統(tǒng)中種類最多、數(shù)量最為豐富的主要功能種群之一，能夠充分反映土壤食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能的綜合性狀[9]，并參與土壤物質(zhì)分解、養(yǎng)分循環(huán)和土壤肥力保持等相關(guān)過程[10-11]。目前已被當(dāng)作農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)是否受到干擾的靈敏性指示生物，具有獨特的優(yōu)勢[12-14]?，F(xiàn)如今有關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物種植對土壤中線蟲影響的報道結(jié)果存在一定差異，有研究證明轉(zhuǎn)基因作物種植對土壤中線蟲的群落多樣性無顯著性差異[15-17]，同時也有研究表明轉(zhuǎn)基因作物的種植對線蟲的數(shù)量存在一定程度的影響[18]。

玉米是我國研究較多的轉(zhuǎn)基因作物，目前我國獲得生產(chǎn)應(yīng)用安全證書轉(zhuǎn)基因玉米是轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米（Cry1Ac-M、Cry1Ie、Cry1Ah等）現(xiàn)在已進入生物安全評價的生產(chǎn)性或環(huán)境釋放試驗階段，在轉(zhuǎn)基因作物種植帶來巨大社會經(jīng)濟效益的同時，其潛在的環(huán)境安全問題也需引起人類的高度重視，因此我們有必要對其可能造成的生態(tài)環(huán)境影響進行評估[19-20]。本研究于2018年玉米生育期期間系統(tǒng)地調(diào)查了轉(zhuǎn)Bt Cry1Ah基因玉米（HGK60）田間昆蟲的種類，主要分析了轉(zhuǎn)基因玉米對田間昆蟲群落多樣性、玉米主要蟲害以及對土壤線蟲群落多樣性的影響，以期為轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的生態(tài)安全性評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于海南省樂東黎族自治縣中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗基地，試驗采取隨機區(qū)組設(shè)計，試驗組為轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米HGK60（Cry1Ah），對照組為其對照常規(guī)玉米鄭58，每個處理4個重復(fù)，每個小區(qū)150 m2（10 m×15 m）。不同品種間設(shè)置1 m寬空白隔離帶（圖1）。種植方式為一穴一粒、一穴兩粒循環(huán)，行距60 cm，株距25 cm。本試驗全生育期所需水肥同常規(guī)種植，記錄施肥、除草劑的用量和周期。2018年3月播種。

圖1 樣地設(shè)置Figure 1 Sample plot

所用玉米材料為轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米HGK60（Cry1Ah）及其對照常規(guī)玉米鄭58，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1.2 樣品采集

1.2.1 田間昆蟲的采集

在玉米生長的苗期（4月18）、喇叭口期（5月11）、抽穗期（6月11）、完熟期（7月6號）進行昆蟲樣品采集，每次采樣時間為昆蟲活動頻繁的16：00—18：00，使用五點取樣法、直接觀察法、陷阱調(diào)查法進行調(diào)查。

直接觀察法：用于植株上節(jié)肢動物種類數(shù)量的調(diào)查。每小區(qū)調(diào)查10株玉米。記錄玉米植株上所有的節(jié)肢動物的種類及數(shù)量。

陷阱調(diào)查法：用于地表節(jié)肢動物的調(diào)查。每點埋設(shè)5個直徑7.5 cm的塑料杯，間隔0.5 m，杯中放有5%的洗滌劑水（防凍液），水量為杯容積的1/3，過夜后調(diào)查杯中的節(jié)肢動物種類和數(shù)量。

線蟲的采集：分別于苗期、喇叭口期、抽穗期、完熟期進行4次土壤樣本的采集。使用土鉆在玉米植株根際周圍5 cm處鉆取0～20 cm耕土層，每個小區(qū)采用五點取樣法，土樣帶回室內(nèi)剔除雜物后分離土壤線蟲。

1.2.2 蟲害玉米樣品的采集與鑒定

于玉米成熟后收獲前調(diào)查一次，采用五點取樣法，每小區(qū)3株玉米。采用縱剖莖稈的方法，調(diào)查莖稈內(nèi)部是否有鉆蛀類害蟲，記錄玉米秸稈的危害狀況（鉆蛀空道長度、受害穗尖長度等）。

1.2.3 土壤線蟲的分離與鑒定

（1）線蟲的分離：采用淺盤分離法[21]，具體步驟如下：將200 mL土樣倒在平鋪兩張紙巾的篩盤上，并將此篩盤緩慢套放于盛有1/3清水的淺盤上，須使水面淹沒材料。處理過的淺盤在室溫下保持24 h，24 h后收集淺盤中的線蟲濾液。每個淺盤共收集一次線蟲。除去過多的水和雜物，用600目篩過濾3次，收集過濾篩上的線蟲，置于桌上靜置待鏡檢。

（2）植物線蟲臨時玻片的制作[22]：先在洗凈的載玻片上用打孔器打一個蠟圈，再在打有蠟圈的載玻片中央用移液槍滴一滴水，在體視解剖鏡下用挑針挑取目標(biāo)線蟲于水滴中，加蓋玻片后轉(zhuǎn)移至控溫電熱板上，待蠟圈融化后便可拿下。冷卻后標(biāo)注信息置于玻片盒中，待鏡檢。

（3）線蟲鑒定及數(shù)量統(tǒng)計：根據(jù)形態(tài)學(xué)將線蟲鑒定到屬，再分屬在解剖鏡上計數(shù)線蟲數(shù)量。線蟲鑒定參考《植物線蟲分類學(xué)》[22]和《中國土壤動物檢索圖鑒》[23]。將線蟲分為4個營養(yǎng)類群：食細菌線蟲（Bacterivores）、食真菌線蟲（Fungivores）、植食性線蟲（Plant-parasites）和雜食/捕食性線蟲（Omnivorespredators）[24]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計分析各個調(diào)查時期節(jié)肢動物群落的結(jié)構(gòu)與組成，計算各時期各群落的多樣性指數(shù)、均勻性指數(shù)、優(yōu)勢集中性指數(shù)。

1.3.1 節(jié)肢動物生態(tài)指標(biāo)

香農(nóng)多樣性指數(shù)：H=-∑PilnPi

群落均勻度采用均勻度指數(shù)測度：J=H/lnS

Simpson優(yōu)勢集中性指數(shù)：C=∑P2i

式中：Pi為第i種物種的比例多度；S為群落中物種總數(shù)目。

1.3.2 線蟲生態(tài)指標(biāo)

香農(nóng)多樣性指數(shù)：H′=-ΣPilnPi

優(yōu)勢度指數(shù)：λ=ΣP2i

物種的豐富度Margalef指數(shù)：D=（S-1）/lnN

式中：S為群落中的物種總數(shù)目；N為觀察到的所有物種的個體總數(shù)。

均勻度指數(shù)：J=H′/Hmax（其中Hmax=lnS）

式中：H′為實際觀察的物種多樣性指數(shù)；Hmax為最大的物種多樣性指數(shù)。

線蟲通道指數(shù)（Nematode channel ratio，NCR）：

NCR=BF/（BF+FF）

式中：BF為食細菌線蟲數(shù)量；FF為食真菌線蟲數(shù)量。NCR為0，表明完全依靠真菌分解途徑；NCR為1，則表明完全依靠細菌分解途徑[25]。

瓦斯樂斯卡指數(shù)（Wasilewska index，WI）：

WI=（BF+FF）/PP

式中：PP為植食性線蟲數(shù)量。

植食性線蟲成熟指數(shù)（Plant-parasitic index，PPI）：

PPI=Σ（c-pi）pi（僅包括植食），評價外界影響土壤穩(wěn)定性。

式中：c-pi為賦予某一種類線蟲的c-p值；pi為某一種類的個體數(shù)占所調(diào)查的總個體數(shù)的比例。

自由生活線蟲成熟指數(shù)（Maturity index of freeliving nematodes，MI）：

MI=Σ（c-pi）pi（僅包括自由生活線蟲）

利用Excel 2003進行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。使用Duncan法進行多重分析。

2 結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因玉米對田間昆蟲的影響

對供試玉米材料在2018年全生育期內(nèi)田間昆蟲種類進行調(diào)查，結(jié)果顯示，玉米植株田地的昆蟲群落由7目19科、67種昆蟲組成（表1）。

香農(nóng)多樣性指數(shù)計算結(jié)果顯示，HGK60田間昆蟲的群落多樣性僅在苗期顯著低于鄭58（P＜0.05），其他生育期差異不顯著（P＞0.05）。均勻度指數(shù)計算結(jié)果顯示，HGK60僅在苗期顯著低于鄭58（P＜0.05），其他生育期差異不顯著（P＞0.05）。優(yōu)勢集中性指數(shù)計算結(jié)果顯示，HGK60與鄭58在各個生育期差異均不顯著（P＞0.05），但隨生育期的推進，優(yōu)勢集中性逐漸下降（圖2）。

2.2 轉(zhuǎn)基因作物種植對玉米主要蟲害的影響

HGK60的植株莖稈上蛀孔平均數(shù)量為0.5個·15株-1，最長隧道長度為7.1 cm，植株上活蟲數(shù)量為0.75頭·15株-1；而鄭58莖稈上蛀孔平均數(shù)量為7個·15株-1，最長隧道長度為18.3 cm，植株上活蟲數(shù)量為4.75頭·15株-1。HGK60在蛀孔數(shù)量、隧道長度、活蟲數(shù)量上低于鄭58，表現(xiàn)出對鉆蛀類害蟲具有明顯的抗性。

根據(jù)試驗方案，每個小區(qū)最終檢視15株植株，每個處理共60株。HGK60材料上共有6株的穗尖受到蟲害，而對照常規(guī)玉米鄭58則有26株的穗尖受害。這些數(shù)量上的差異表明HGK60對害蟲具有明顯的抗性（表2）。

2.3 轉(zhuǎn)基因玉米對線蟲的影響

2.3.1 線蟲總數(shù)的統(tǒng)計

從線蟲總數(shù)的動態(tài)分析，轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米根分泌物對根圍土壤線蟲的總數(shù)影響并不明顯，二者在玉米不同生長期對線蟲總數(shù)的影響差異不顯著（P＞0.05）（圖3）。

在整個玉米生長周期中，HGK60根圍共發(fā)現(xiàn)25個屬線蟲，鄭58共發(fā)現(xiàn)26個屬線蟲，總數(shù)差異不大；但值得關(guān)注的是，其中對玉米根圍存在潛在危險性的植食性線蟲，鄭58有9屬，HGK60僅有7屬，且HGK60的雜食捕食性線蟲比鄭58多2個屬（表3）。不同玉米的根圍分泌物是否對根圍土壤線蟲種群結(jié)構(gòu)造成影響有待進一步研究。

表1 玉米田間昆蟲群落的目、科、種分布Table 1 Patterns of insect from maize field in different orders，families and species

2.3.2線蟲生態(tài)指數(shù)分析

HGK60在栽培早期（苗期）干擾了根圍土壤線蟲的多樣性，與鄭58間呈顯著差異（P＜0.05）。該試驗田整體上以細菌分解途徑為主，僅在栽培早期HGK60處理NCR與鄭58差異顯著。在本研究中，HGK60 PPI持續(xù)上升，鄭58呈現(xiàn)先上升，生長后期下降的趨勢；但在栽培初期和末期兩者間差異不顯著（P＞0.05）（圖4）。

優(yōu)勢度指數(shù)λ隨著玉米生長逐漸減小，玉米栽培初期，HGK60顯著大于鄭58處理（P＜0.05），隨著玉米生長逐漸減小，且兩者間差異不顯著（P＞0.05）。隨著玉米根系生長，線蟲豐富度指數(shù)D逐漸增高，但HGK60、鄭58之間差異不顯著（P＞0.05）（圖4）。

均勻度指數(shù)J在玉米初期，HGK60顯著小于鄭58（P＜0.05），其他生育期差異不顯著（P＞0.05）（圖4）。

2.3.3 營養(yǎng)類群分析

在玉米栽種早期，HGK60的食細菌線蟲數(shù)明顯多于鄭58，但隨后兩者數(shù)量趨于相當(dāng)。在整個玉米生長期，根圍食真菌線蟲種群數(shù)量整體上變化不大，僅在玉米栽種早期，HGK60的食真菌線蟲數(shù)明顯比親本鄭58少，隨后兩者數(shù)量趨于相當(dāng)（圖5）。

圖2田間昆蟲群落各指數(shù)動態(tài)圖Figure 2 Dynamic of biodiversity index of insect community in the fields

表2 收獲前期2種玉米材料危害情況統(tǒng)計Table 2 Statistics on the hazardous situation of two kinds of maize materials in the early stage of harvesting

圖3 線蟲總數(shù)的統(tǒng)計Figure 3 Statistics of nematodes

在本研究中，HGK60植食性線蟲數(shù)量持續(xù)上升，鄭58呈先上升玉米生長后期下降的趨勢。栽培初期，HGK60顯著高于鄭58（P＜0.05），但在抽穗期調(diào)查發(fā)現(xiàn)兩者間差異不顯著（P＞0.05）。到完熟期，HGK60的植食性線蟲數(shù)量顯著多于鄭58（P＜0.05）（圖5）。

本試驗田中，雜食-捕食線蟲占線蟲總數(shù)比例最少，在玉米栽培后期數(shù)量略有上升，在栽培后期HGK60顯著少于鄭58（P＜0.05）（圖5）。

3 討論

近年來國內(nèi)外在轉(zhuǎn)基因作物安全性方面的研究已經(jīng)取得很大進展，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花、轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻以及轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆等對節(jié)肢動物群落結(jié)構(gòu)影響的研究均取得了一定的成果[26-28]。目前中國批準(zhǔn)的商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因作物只有棉花和番木瓜，國內(nèi)研究最多的是轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉對害蟲和天敵的影響，由于轉(zhuǎn)基因玉米在我國尚未被批準(zhǔn)商業(yè)化種植，所以有關(guān)轉(zhuǎn)基因玉米對無脊椎動物的多樣性影響研究相對較少。從目前已有的研究來看，絕大多數(shù)的試驗結(jié)果都支持轉(zhuǎn)基因玉米對節(jié)肢動物、土壤動物群落多樣性的影響較小的結(jié)論[4，29-31]。本研究以轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米為研究對象，對其全生育期田間節(jié)肢動物群落和線蟲群落多樣性進行調(diào)查分析，結(jié)果顯示HGK60與鄭58相比，在物種豐富度、群落多樣性、優(yōu)勢集中性和群落均勻性等幾個指數(shù)表示的群落性質(zhì)上不存在顯著差異。這與前人的研究結(jié)果基本一致，說明轉(zhuǎn)基因作物的種植對田間節(jié)肢動物群落多樣性、線蟲群落多樣性沒有顯著影響，為轉(zhuǎn)基因玉米的安全性評價提供了基本的數(shù)據(jù)支持[32]。對HGK60與鄭58田間昆蟲的多樣性指數(shù)、均勻度數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)進行分析比較，其在個別生理時期略有波動，苗期轉(zhuǎn)基因玉米HGK60的多樣性指數(shù)H和均勻性指數(shù)J顯著低于非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58，在其他3個時期，轉(zhuǎn)基因玉米也傾向于低于非轉(zhuǎn)基因玉米，隨著生育期的推進，總體趨勢趨于一致。這與其他學(xué)者的研究結(jié)果較為一致[33-35]，轉(zhuǎn)基因抗蟲作物與親本相比，具有抗蟲性，在作物的各個發(fā)育期，可有效防治害蟲的發(fā)生，降低田間昆蟲群落多樣性，但總體無顯著性差異。

表3 玉米田間土壤線蟲科屬的分布Table 3 Patterns of nematode in soil from maize field in different families and genuses

轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米HGK60在蛀孔數(shù)量、隧道長度、活蟲數(shù)量上顯著低于對照常規(guī)玉米鄭58，表現(xiàn)出對鉆蛀類害蟲具有明顯的抗性。穗尖被害情況亦表明HGK60對害蟲具有明顯的抗性。轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米體內(nèi)穩(wěn)定表達的Bt毒蛋白可能能夠通過對非靶標(biāo)昆蟲產(chǎn)生直接（如通過植食性昆蟲取食）或者間接（如通過食物鏈）的影響[36-37]，從而有效地控制玉米螟數(shù)量，進而降低作物的蟲害程度。

轉(zhuǎn)基因植物的非靶標(biāo)效應(yīng)是生態(tài)安全評估和環(huán)境監(jiān)測的重要組成部分[38-39]。土壤線蟲群落分析目前已成為指示土壤生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能變化的有力工具[9]。對線蟲的數(shù)量動態(tài)變化研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因玉米的種植對土壤線蟲的總數(shù)影響并不明顯，不同生長期轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)對照對線蟲總數(shù)的影響差異不顯著，轉(zhuǎn)基因玉米的種植未對線蟲的生態(tài)指標(biāo)和群落結(jié)構(gòu)造成顯著影響，這與前人的研究結(jié)果相似[40-44]。但也有部分學(xué)者認為，轉(zhuǎn)基因作物的種植會對生物群落的結(jié)構(gòu)及功能帶來一定的影響[45-46]。

圖4 線蟲生態(tài)指數(shù)分析Figure 4 Analysis of nematode ecological index

本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt基因（Cry1Ah）抗蟲玉米的田間種植降低了植食性線蟲的比例，也降低了植食線蟲和雜/捕食線蟲的比例，這與其他學(xué)者關(guān)于轉(zhuǎn)Bt油菜的田間種植研究結(jié)果類似[47]，整個生育期轉(zhuǎn)基因玉米田和對照親本玉米田土壤線蟲數(shù)量差異不顯著（P＞0.05）。對線蟲生態(tài)指數(shù)和營養(yǎng)類群分析中發(fā)現(xiàn)，在栽培初期和抽穗期，HGK60植食性線蟲數(shù)量、植食性線蟲成熟指數(shù)與親本鄭58相比差異不顯著（P＞0.05）。完熟期，HGK60的植食性線蟲數(shù)量又顯著多于鄭58（P＜0.05）。本文推測轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米HGK60可能會加快植食性線蟲生長繁殖，提高植食性線蟲的比例，但其是通過何種手段和途徑得以加快植食性線蟲生長繁殖，是否受土壤速效鉀、速效磷、堿解氮、有機碳和有機質(zhì)含量影響，還需要進一步的野外試驗驗證加以明確。

圖5 線蟲營養(yǎng)類群分析Figure 5 Analysis of nematode nutrition groups

綜上所述，與對照常規(guī)玉米鄭58相比，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米具有一定的抗蟲性，且并未對田間昆蟲動物群落多樣性產(chǎn)生顯著影響。該研究結(jié)果為轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的進一步研究提供一定基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。然而由于本實驗僅為單年單點實驗，試驗規(guī)模較小，存在著一定的欠缺，接下來需連續(xù)多年多點進行試驗，以獲得更加準(zhǔn)確、全面且可靠的研究結(jié)果，更好地為轉(zhuǎn)基因玉米的生態(tài)環(huán)境安全進行評估。

4 結(jié)論

（1）轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米HGK60對田間非靶標(biāo)昆蟲動物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。

（2）與對照常規(guī)玉米鄭58相比，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米HGK60對田間蟲害表現(xiàn)出明顯的抗性。

（3）轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米HGK60與對照常規(guī)玉米鄭58在玉米整個生長周期對土壤線蟲的總數(shù)沒有顯著影響。線蟲的生態(tài)指數(shù)及營養(yǎng)類群主要受玉米生育期的影響，本研究為轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境釋放提供理論參考依據(jù)。