石斛的氨基酸組成及分析

陳玉芹 胡永亮 白燕冰 周侯光 李澤生

摘 ?要??利用全自動氨基酸分析儀測定22種主要石斛栽培品種的氨基酸組成和含量，并應(yīng)用多元統(tǒng)計分析方法對其品質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，石斛中以天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、精氨酸4種氨基酸含量最豐富;蛋氨酸和胱氨酸分別為石斛的第1和第2限制性氨基酸。不同品種石斛的氨基酸含量和組成比例存在一定差異，其中，10種石斛含有17種氨基酸和7種必需氨基酸，11種石斛未檢出蛋氨酸或胱氨酸。參照FAO/WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)，氨基酸營養(yǎng)價值較高的是線葉石斛、紫瓣石斛、杓唇石斛、玫瑰石斛、紫菀石斛和疊鞘石斛6個品種;采用主成分分析方法和聚類分析，可將22種石斛氨基酸分為4類品質(zhì)，以石斛氨基酸指標(biāo)聚類可將22種石斛聚為3類。

關(guān)鍵詞 ?石斛屬; 氨基酸; 色譜法; 主成分分析; 聚類分析中圖分類號??S567?????文獻(xiàn)標(biāo)識碼??A

Amino Acids in Dendrobium?SW.

CHEN Yuqin， HU Yongliang， BAI Yanbing， ZHOU Houguang， LI Zesheng^*

Dehong Tropical Agriculture Institute of Yunnan， Ruili， Yunnan 678600， China

Abstract ?The composition and content of amino acids in 22 speciesDendrobiumwere determined by an automatic amino acid analyzer， and multivariate statistics analysis were performed to provide a reference for the quality. The most abundant?amino acids?were aspartic acid， glutamic acid， leucine and arginine; methionine and cystine were the first and second restricted amino acids inDendrobium. There was a significant difference in the content of amino acid and the composition. Ten in the 22 species ofDendrobiumcontained 17 amino acids and 7 essential amino acids. No methionine or cystine was detected in 11 species.D. aurantiacum，?D. parishii，?D. moschatum，?D. crepidatum，D. transparens，D. aurantiacumvar. were classified as the richest in amino acids based on the recommendation of FAO/WHO. The amino acids could be divided into four groups by quality with principal component analysis and cluster analysis， andDendrobiumwere classified into three categories.

Keywords ?DendrobiumSW.; amino acid;?chromatography; principal component analysis; clustering analysis

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.022

石斛是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendro biumSW.）植物，Dendrobium是由希臘文dendro（樹）及bios（生命）組合而來，有附生于樹上之意^[1]。全球約有1700種石斛，廣泛分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)及大洋洲。《中國植物志》收錄我國石斛74種和2變種，其中云南產(chǎn)58種2變種，該屬植物又細(xì)分為禾葉組、頂葉組、石斛組、心葉組、瘦軸組、叉唇組、距囊組、黑毛組、草葉組、基腫組、劍葉組、圓柱葉組等12組^[2];Flora of China（《中國植物志》英文修訂版）訂正及增加新種收錄共為78種，分為14個組。石斛中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和諸多特有的天然活性成分^[2-5]，具有潤肺生津、活血化瘀、治療心血管疾病等功效^[6]，已成為制藥和保健品的重要原料。近年來，一些研究學(xué)者在對天然藥物藥理活性物質(zhì)的探索研究中，發(fā)現(xiàn)氨基酸與藥效存在著密切關(guān)系，劉振鵬、張愛蓮等學(xué)者認(rèn)為，鐵皮石斛呈現(xiàn)味甘淡、微咸與氨基酸組成特性有關(guān)，其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸是發(fā)揮臨床與保健功效、調(diào)節(jié)口感的重要成分^[7-8]，對人體也有良好的保健作用。

石斛屬植物中氨基酸水平不盡相同，含量也存在差異，而石斛氨基酸是石斛發(fā)揮藥效、調(diào)節(jié)口感的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。研究報道主要集中在鐵皮石斛、金釵石斛、鼓槌石斛等幾種常見種^[7-10]，但也僅限于針對一種石斛不同組織或至多僅幾種石斛屬植物間比較。本研究采用方差分析、主成分分析法和聚類分析法等對石斛屬22種石斛的氨基酸含量進(jìn)行分析，從不同角度對石斛進(jìn)行研究，為石斛的開發(fā)提供新思路。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1??植物材料??22種石斛采摘于云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所石斛種質(zhì)資源圃，采摘其鮮條，55?℃烘干至恒重，粉碎備用。樣品詳細(xì)信息見表1。

1.1.2??儀器??組織磨樣器（濟(jì)南泰和盈科商貿(mào)有限公司，型號RETSCH MM400）、電子分析天平（上海恒勤儀器設(shè)備有限公司，型號ME204）、臺式冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司，型號TGL20MW），全自動氨基酸分析儀（大昌華嘉商業(yè)（中國）有限公司，型號Biochrom30+）。

1.1.3??試劑??17種氨基酸混標(biāo)（胱氨酸摩爾濃度0.125 ?mol/mL，其余16種氨基酸摩爾濃度0.25 ?mol/mL） （大昌華嘉商業(yè)（中國）有限公司），濃鹽酸（分析純），異丙醇（分析純），95%乙醇，茚三酮（大昌華嘉商業(yè)（中國）有限公司），高純氮氣（99.999%），不同pH緩沖液^[11]。

1.2方法

1.2.1??樣品前處理??參照GB/T?5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》，準(zhǔn)確稱取石斛粉末樣品0.2 g（精確到0.0001 g）于10 mL安剖瓶中，制備水解液，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，3500 r/min離心5 min，取1 mL上清液置于10 mL燒杯中，（60±5）℃水浴干燥，待液體快蒸干再加入1 mL去離子水，重復(fù)操作3次，蒸干。加入1 mL pH 2.2稀釋液，混勻后過0.45 μm微孔濾膜過濾后備用。

1.2.2??氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 ?取200 μL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，加入800 μL pH 2.2稀釋液，充分混勻，進(jìn)樣10、20、30 μL上機(jī)測定17種氨基酸，根據(jù)各氨基酸的響應(yīng)值與濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3??檢測條件??檢測器：檢測器1波長570 nm，檢測器2波長440 nm，進(jìn)樣量20 μL，色譜柱為氨基酸分析的Na⁺專用柱。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel軟件整理后用SPSS 24.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA檢驗，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;采用多元統(tǒng)計分析方法中的因子分析主成分提取方法^[12-13]和系統(tǒng)聚類分析對石斛氨基酸進(jìn)行分析。

2??結(jié)果與分析

2.1石斛中氨基酸含量與組成

由表2可以看出，不同品種石斛的氨基酸含量和組成存在一定差異，其中反瓣、劍葉等10種石斛均含有17種氨基酸和人體所需的7種必需氨基酸;翅萼、龍石斛等11種石斛含有16種氨基酸和人體所需6種必需氨基酸，蛋氨酸未檢出;玫瑰石斛未檢出胱氨酸。通過對22種石斛的17種氨基酸指標(biāo)進(jìn)行描述性統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)（表3），石斛中天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、精氨酸4種氨基酸含量最豐富;蛋氨酸和胱氨酸含量最低，分別為石斛的第一和第二限制性氨基酸。由變異系數(shù)可看出，22種石斛中的氨基酸含量差異較大，呈中變異到高變異，其中蛋氨酸、精氨酸、天冬氨酸3種氨基酸差異最大，分別為118.37%、108.10%、51.65%。

22種石斛中總氨基酸（TAA）、必需氨基酸（EAA）和非必需氨基酸（NEAA）含量有很大差異。TAA含量：50 mg/g以上的石斛有3種;?40～50 mg/g有1種;30～40 mg/g有4種;30 mg/g以下有14種。EAA含量：10 mg/g以上有12種，10?mg/g以下有10種;NEAA含量在（9.16±1.27）～（43.25±?1.17）mg/g，其中，蘇瓣石斛最高，杓唇石斛最低。22種石斛中EAA/TAA比值差異不大，主要集中在35%～40%之間，NEAA/TAA比值主要集中在50%～70%之間。植物蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值主要取決于其必需氨基酸的組成和比例，據(jù)FAO/WHO推薦，質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)EAA/NEAA在60%以上，EAA/TAA為40%左右。線葉石斛、紫瓣石斛等6種石斛蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值更合理，能提高人體對蛋白質(zhì)的吸收利用率，可作為優(yōu)質(zhì)蛋白源。

2.2主成分分析

2.2.1??氨基酸指標(biāo)間相關(guān)性檢驗、KMO和Bartlett球形度檢驗??從相關(guān)系數(shù)矩陣（表4）可以看出，除了胱氨酸與其余16種氨基酸沒有相關(guān)性，其他氨基酸均呈現(xiàn)極顯著相關(guān)，說明大部分信息重疊。經(jīng)KMO和Bartlett球形度檢驗，KMO值為0.803，呈強(qiáng)相關(guān)性，Bartlett球形度檢驗的相伴概率P<0.05（顯著水平）進(jìn)一步說明本研究中石斛各氨基酸指標(biāo)間存在相關(guān)性。因此，本研究采用因子分析主成分提取方法有效。

2.3聚類分析

以17種氨基酸和總氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸為變量進(jìn)行聚類分析（圖2），可以將22中石斛分為3大類，密花石斛、疊鞘石斛、紫瓣石斛等18種石斛聚為一大類;鉤狀石斛、紫菀石斛、金耳石斛3種石斛聚為一類，蘇瓣石斛單獨為一類。以22種石斛綜合得分為變量進(jìn)行聚類分析（圖3），由圖3可看出，可將22種石斛聚類為四類品質(zhì)，蘇瓣石斛單獨聚為一類品質(zhì)，鉤狀石斛、紫菀石斛、金耳石斛3種石斛聚為第二類品質(zhì)，龍石斛、杓唇石斛、密花石斛等8種石斛聚為第三類品質(zhì)，反瓣石斛、豆苗石斛、永福石斛等10種石斛聚為第四類品質(zhì)。

3??討論

本文首次針對22種不同石斛的氨基酸組成進(jìn)行測定分析，結(jié)果表明不同品種石斛的氨基酸含量和組成比例存在一定差異。22種石斛中10種石斛含有17種氨基酸和7種必需氨基酸，11種石斛未檢測出蛋氨酸或胱氨酸，這可能是因為石斛蛋氨酸或胱氨酸的含量很低，經(jīng)酸水解被嚴(yán)重破壞而未能檢出。通過分析可發(fā)現(xiàn)石斛中主要以天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、精氨酸4種氨基酸含量最豐富;蛋氨酸和胱氨酸含量最低，分別為石斛的第一和第二限制性氨基酸。這與欒潔^[14]、汪群紅^[15]、魏靜^[16]研究鐵皮石斛氨基酸的含量結(jié)果相似，但與徐蘭芳^[17]研究鐵皮石斛氨基酸的結(jié)果不一致。徐蘭芳^[17]試驗樣品為不同附生樹上的鐵皮石斛，得出不同活樹附主對鐵皮石斛上的氨基酸含量有影響，含量差異顯著。本研究的石斛樣品均為大棚基質(zhì)栽培，這也說明栽培模式對石斛氨基酸的形成具有影響。徐德利等^[18]研究表明石斛的氨基酸含量受其基因型的影響極大，張愛蓮^[8]研究表明鐵皮石斛中氨基酸含量很大程度上受藥材品種的影響，通過品種選育有望提高鐵皮石斛藥材中的氨基酸。本研究的供試樣品采自同一產(chǎn)地，栽培環(huán)境和基地管理均一致，但采摘樣品生長年限不同，含量差異較大是否受基因型影響較大，需進(jìn)一步開展石斛生長中氨基酸的積累規(guī)律研究，探討影響石斛氨基酸的主要因素。

通過采用多元統(tǒng)計分析方法中的主成分分析和聚類分析，22種石斛中氨基酸存在顯著相關(guān)性，提取2個主成分并分別解釋了83.347%、7.159%的方差，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到90.506%，這表明2個主成分集中了原始氨基酸17個變量信息的90.506%。根據(jù)主成分線性表達(dá)式和石斛氨基酸品質(zhì)綜合評價模型，得出石斛氨基酸品質(zhì)排名。根據(jù)FAO/

WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)，線葉石斛、紫瓣石斛、杓唇石斛、玫瑰石斛、紫菀石斛、疊鞘石斛6種石斛可作為優(yōu)質(zhì)蛋白源。2種方式評價石斛氨基酸的結(jié)果不一致，這可能是分析方法的側(cè)重點不同，主成分分析更側(cè)重于每種氨基酸信息量的權(quán)重，而FAO/WHO推薦是根據(jù)人體所需的氨基酸比例來分析，這就說明不同的分析方法和衡量指標(biāo)獲得不同的結(jié)果，需要根據(jù)目的來具體選擇分析方法。另外，以氨基酸為變量聚類可將22中石斛分為3大類，以石斛氨基酸品質(zhì)綜合得分為變量聚類可將22種石斛聚類為4類品質(zhì)。這就說明以不同的指標(biāo)作為變量也會聚類出不同的結(jié)果，劉威等^[19]的研究結(jié)果有相似的看法，因此，可以多角度、多方位分析研究石斛，為石斛的開發(fā)提供更加全面的新思。

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