MUC5AC和TNF-α在大鼠急性分泌性中耳炎模型中的表達變化

王夢航李水靜韓琳余力生

1北京大學國際醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（北京102206）

2北京大學人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（北京100044）

·基礎研究·

MUC5AC和TNF-α在大鼠急性分泌性中耳炎模型中的表達變化

王夢航1李水靜1韓琳2余力生2

1北京大學國際醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（北京102206）

2北京大學人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（北京100044）

目的研究MUC5AC（黏蛋白MUC5AC）和TNF-α（腫瘤壞死因子-α）在大鼠中耳炎黏膜的表達變化。方法40只SD大鼠隨機分為對照組10只、實驗組30只；實驗組建立大鼠急性分泌性中耳炎模型，采用qPCR檢測MUC5AC及TNF-α在第1天,第3天,第7天兩組中耳黏膜的表達變化，并用免疫組織化學染色技術分別檢測MUC5AC和TNF-α在第1天,第3天,第7天在中耳黏膜的表達變化。結果在對照組中，MUC5AC不表達，TNF-α輕度表達，實驗組從第1天到第3天MUC5AC及TNF-α的表達隨著時間的延長而增強，至第7天則表達開始減弱，實驗組與對照組的比較差別具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論MUC5AC和TNF-α在大鼠急性分泌性中耳炎黏膜中表達上調，且與時間相關。

MUC5AC;TNF-α；急性分泌性中耳炎；中耳黏膜

Acknow ledgements This study was supported by the Twelfth-five-year"national science and technology support plan (2012BAI12B01),the National Natural Science Foundation of China(11202018),the Post-doctoral Foundation of China (20110490269,2013T60055)and Peking University InternationalHospitalResearch Fund(YN2016QN03).

Conflictof interestTheauthorsdeclareno conflictsof interest.

分泌性中耳炎(Otitismediawith effusion,OME)是耳科的常見病和多發(fā)病，主要特征為中耳積液及聽力下降。調控中耳黏膜對炎癥損傷反應的機制研究，正在成為我們的重要課題之一。MUC5AC是黏蛋白家族成員之一，是中耳黏液纖毛傳輸系統(tǒng)的重要組成部分，黏蛋白的表達增強可以影響中耳黏膜纖毛的運動功能[1]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是炎癥介質之一，它的啟動與激活，在中耳炎的發(fā)病過程中起重要作用[2-3]。因此，本實驗初步研究MUC5AC（黏蛋白MUC5AC）及TNF-α（腫瘤壞死因子-α）在大鼠急性分泌性中耳炎黏膜的表達變化。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑

主要試劑有引物合成序列測定(Qiagen),熒光定量PCR試劑盒(Invitrogen公司,CA,USA)，鼠抗人MUC5AC單克隆抗體以及配套使用的SP免疫組化試劑盒購自北京中山生物公司，鼠抗人TNF-α單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，細菌內毒素（Endotoxin,ET）購自Sigma公司(St Louis, MO,USA)。

1.2 實驗動物及分組

選用雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，體重100-150g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心供應。實驗前所有大鼠耳廓反應靈敏，用手術顯微鏡觀察雙側鼓膜正常。將篩選后的大鼠隨機分組：對照組（正常組）：10只SD大鼠，不做任何處理，直接處死，取聽泡標本。

實驗組（Secretory otitismedia,SOM組）：內毒素（Endotoxin,ET）組30只[4-5]，均以右耳作為實驗耳，中耳腔注射內毒素ET 40μl;左耳作為對比，用以比較觀察內毒素注射大鼠右耳鼓膜像的變化情況。將注入后的大鼠隨機分為3組，分別于1d,3d, 7d各處死10只。

1.3 動物模型的建立

2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射，麻醉滿意后，固定于小動物立體定位儀。剪開皮膚、皮下及骨膜，暴露聽泡，以尖端接有玻璃微電極的微量注射器吸取準備好的內毒素ET液體或生理鹽水NS 40μl，精確定位后垂直進針至定位刻度，刺入中耳腔，骨蠟封閉骨孔?？p合皮膚，麻醉清醒后正常食水飼養(yǎng)。大鼠急性分泌性中耳炎模型（SOM組）鼓膜像標準：處死大鼠前均用顯微鏡觀察是否形成分泌性中耳炎，入選動物鼓膜像需為混濁內陷、膨出伴有積液者。

1.4 標本收集

先觀察雙側鼓膜情況，然后斷頭取右側聽泡，置于4℃預冷的生理鹽水中，解剖顯微鏡下除去筋膜、軟組織等，將聽泡在濾紙上吸水干燥，在解剖顯微鏡下剝離實驗組大鼠中耳周圍黏膜，置于凍存管，液氮-80℃冷藏保存。聽泡4%多聚甲醛固定后行免疫組化染色。

1.5 定量聚合酶鏈反應(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)檢測

大鼠中耳黏膜樣本分離并均質化后，按照qP?CR試劑盒的說明進行操作。首先進行總RNA的提取及純化，然后調整RNA模板體系，由RNA合成cDNA。最后配制體系進行PCR擴增，qPCR檢測反復重復三次，以SPSS軟件進行統(tǒng)計分析,數據結果分析以±s表示,以*P<0.05認為具有統(tǒng)計學意義。

1.6 免疫組織化學染色

免疫組織化學染色采用SP法。MUC5AC及TNF-α單抗稀釋，稀釋倍數均為1：100，石蠟切片脫蠟、水化;3%H2O2去離子水孵育5～10min;切片滴加一抗(鼠抗人MUC5AC單克隆抗體及TNF-α單克隆抗體),37℃孵育2h,PBS洗片2min×3次;滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體,37℃孵育20min,PBS洗片2min×3次;滴加DAB,光鏡下觀察,自來水沖洗;蘇木素復染、脫水、透明、封片。陽性細胞結果判定：顯微鏡400或200倍鏡下任選5個不同視野觀察并計算陽性細胞著色深淺及百分率，按陽性細胞所占百分比計分，統(tǒng)計分析時（++）（+++）合計為陽性表達[6]。

1.7 統(tǒng)計學分析

數據統(tǒng)計采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析單向方差分析（ANOVA）以及Turkey’s test，且*P<0.05具有顯著性差異。

2 結果

2.1 實驗組及對照組中MUC5ACmRNA的表達情況

收集實驗組（SOM組）及對照組中耳周圍區(qū)域黏膜，提取RNA后行qPCR檢測，具體方法同上。結果發(fā)現，MUC5ACmRNA表達量自內毒素刺激第1天后開始增加，至第3天達到最高，第7天減弱，呈現時間依賴性；所有數據與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（*P<0.05），表明內毒素刺激誘導的大鼠急性分泌性中耳炎模型的中耳黏膜中MUC5ACmRNA表達的上調，有時間依賴性（圖1）。

圖1 MUC5ACmRNA在大鼠中耳黏膜的相對表達量Fig.1 The expression of MUC5ACmRNA in themiddle ear mucosa of each group

2.2 實驗組及對照組中TNF-αmRNA的表達情況

收集實驗組（SOM組）及對照組中耳周圍區(qū)域黏膜，提取RNA后行qPCR檢測，具體方法同上。結果發(fā)現，TNF-αmRNA表達量自內毒素刺激第1天后開始增加，至第3天達到最高，第7天則表達減弱，呈現時間依賴性；所有數據與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（*P<0.05），表明內毒素刺激誘導的大鼠急性分泌性中耳炎模型的中耳黏膜中TNF-αmRNA表達上調，與時間相關（圖2）。

圖2 TNF-αmRNA在大鼠中耳黏膜的相對表達量Fig.2 The expression of TNF-αmRNA in them iddle earmucosaof each group

2.3 實驗組及對照組MUC5AC免疫組化染色觀察結果

黏蛋白MUC5AC免疫組化染色顯示：實驗組黏蛋白MUC5AC在鼓室黏膜上皮的杯狀細胞、腺體細胞的包漿中陽性表達，表現為較均勻的棕黃色的細顆粒狀（圖3-Fig3B,3Cand 3D）；對照組的正常鼓室黏膜無明顯MUC5AC表達（圖3）。MUC5AC在實驗組表達顯著高于對照組，與對照組相比有顯著性差異（*P<0.05）；實驗組的中耳黏膜在第1d組開始陽性表達，3d組陽性表達最強，7d組開始減弱，MUC5AC表達具有時間依賴性（圖5）。

2.4 實驗組及對照組TNF-α免疫組化染色觀察結果

TNF-α免疫組化染色顯示：實驗組（SOM組）腫瘤壞死因子TNF-α在鼓室黏膜上皮細胞、成纖維細胞等的包漿中陽性表達，表現為著色較深的棕黃色的顆粒狀（圖4）；對照組個別大鼠的正常鼓室黏膜有陽性的TNF-α表達（圖3）。TNF-α在實驗組表達顯著高于對照組，與對照組相比有顯著性差異（*P<0.05）；內毒素誘導的大鼠急性分泌性中耳炎模型實驗組的中耳黏膜，在第1天，3天，TNF-α表達隨時間依賴性增多，第7天表達明顯減弱（圖5）。

圖3 黏蛋白MUC5AC在大鼠中耳黏膜的表達(SP×400)Fig.3 The expression of MUC5AC in them iddle earmucosa of each group(SP×400)

圖4 腫瘤壞死因子TNF-α在大鼠中耳黏膜的表達(SP×200)Fig.4 Theexpression of TNF-αin themiddleearmucosaof each group(SP×200)

圖5 黏蛋白MUC5AC和腫瘤壞死因子TNF-α在大鼠中耳黏膜表達的陽性率Fig.5 The positive rate of MUC5AC and TNF-αin the m iddleearmucosaof each group

3 討論

分泌性中耳炎(otitismediawith effusion,OME)是耳科的常見疾病之一，以中耳積液及聽力下降為主要臨床特征，是一種小兒常見的中耳非化膿性疾病，與兒童的語言及智力發(fā)育密切相關[7]。應用內毒素造成大鼠急性分泌性中耳炎模型，快速、有效，是分泌性中耳炎的常見模型之一。

近年來，通過對中耳黏液纖毛傳輸系統(tǒng)的認識，中耳黏膜、中耳積液中的黏蛋白和細胞因子的表達，逐漸成為耳科分子生物學領域的一個研究熱點[8]。黏液纖毛傳輸系統(tǒng)是由中耳黏膜及黏液毯組成，這一系統(tǒng)的主要成分是黏蛋白。至今已發(fā)現13種不同類型的黏蛋白(MUC1—4, MUC5AC,MUC5B,MUC6—12)。 其 中 ，MUC1、MUC4為跨膜型黏蛋白，MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8為分泌型黏蛋白。黏蛋白存在于黏膜表面，起著保護上皮和保持纖毛清除并防止病原體黏附的作用[9-10]。其中MUC5AC由杯狀細胞分泌，是構成黏液毯的主要成分。然而MUC5AC在分泌性中耳炎的作用機理還未完全闡明。

細胞因子是指某些刺激因素作用下，由免疫細胞（單核巨噬細胞、T細胞、B細胞、NK細胞）和某些非免疫細胞(如血管內皮細胞、纖維母細胞等)合成、分泌的一類生物活性物質。其中TNF-α對于炎癥的重要作用，使得它與黏蛋白之間的關系探討顯得尤為重要。在分泌性中耳炎病程初期，中耳腔局部產生的TNF-α可以直接作用于中耳黏膜，造成黏膜水腫、通透性增強，破壞纖毛黏液傳輸系統(tǒng)的功能。并有體外實驗研究表明：經TNF-α處理的鼠中耳黏膜上皮4小時后出現MGP(黏蛋白)分泌，并持續(xù)到24小時，而且具有時間和劑量依賴性[11-12]。然而TNF-α在分泌性中耳炎大鼠實驗模型的作用機制及與黏蛋白的關系，還未完全明確。

本實驗應用內毒素構造急性大鼠分泌性中耳炎模型，采用qPCR和免疫組化染色技術SP法測定MUC5AC和TNF-αmRNA和免疫組化染色中耳黏膜的表達情況。實驗表明：內毒素誘導的大鼠急性分泌性中耳炎模型的中耳黏膜中MUC5AC及TNF-αmRNA表達上調，有時間依賴性。MUC5AC及TNF-α在中耳黏膜免疫組化染色表達上調，隨時間延長而出現陽性表達改變。TNF-α可以刺激杯狀細胞及成纖維細胞等分泌黏液，使病程慢性化，促進了分泌性中耳炎的發(fā)展和遷延不愈。本研究的結果初步證實了TNF-α與中耳黏膜的黏蛋白MUC5AC分泌有一定的關系。提示炎性細胞因子在黏蛋白基因的表達機制中起重要作用，然而何種通路調節(jié)黏蛋白基因表達仍有待進一步研究。

綜上所述，MUC5AC及TNF-α表達于內毒素激發(fā)的急性分泌性大鼠中耳炎模型的中耳黏膜中，在分泌性中耳炎的發(fā)生過程可能發(fā)揮了重要作用，具體機制有待進一步研究。

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Expression ofMUC5AC and TNF-αin M iddle Ear M ucosa in a RatM odelofAcute OtitisM ediaW ith Effusion

WANGMenghang1,LeeSu Jeong1,Han Lin2,YU Lisheng2
1DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,Peking University InternationalHospital,Peking University, Beijing,102206,China
2DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,People’sHospital，Peking University，Beijing 100044，China

YU Lisheng Email：yulish68@163.com

ObjectiveTo study expression of MUC5AC and TNF-αin them iddle earmucosa in ratmodelof acute otitismediaw ith effusion.M ethodsForty adult female Sprague-Daw lay(SD)ratswere random ly divided into a control group and aexperimentalgroup.Rats in the experimentalgroup

injection of endotoxin.The leveland pattern of MUC5AC and TNF-αexpression w ithin themiddle ear epithelium were tested by qPCR and immunohistochemical assays.ResultsqPCR and immunohistochemical staining results showed increased expression of MUC5AC and TNF-αin the experimentalgroup alongw ith time(*P<0.05)and theMUC5ACweremainly concentrated on the gobletcells.ConclusionsExpression ofMUC5AC and TNF-αis increased in ratmiddle ear epithelium w ith acutemedia otitisw ith effusion.Hence,it isspeculated thatMUC5AC and TNF-αmay participate in the processof acutemediaotitisw ith effusion.

MUC5AC;TNF-α;M iddle Ear Epithelium;AcuteMedia OtitisWith Effusion

R764

A

1672-2922（2017）03-329-5

2016-12-21審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.03.011

十二五國家科技支撐計劃（2012BAI12B01），國家自然科學基金科學基金項目（11202018），中國博士后科學基金項目（20110490269,2013T60055），北京大學國際醫(yī)院院內科研基金（YN2016QN03）。

王夢航，博士后，主治醫(yī)師，研究方向:耳科臨床及基礎研究

余力生，Email:yulish68@163.com