雙季銨鹽化合物的結(jié)構(gòu)表征與抗菌性能測(cè)試

蘇長(zhǎng)鳴，崔本行，侯桂革，王春華

(濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003)

有害細(xì)菌對(duì)人和動(dòng)、植物有極大危害，嚴(yán)重影響人們的健康，甚至危及生命[1-2]。隨著人們對(duì)生活環(huán)境逐漸重視，對(duì)于有害細(xì)菌的抑制及殺滅要求不斷提高。近幾年來(lái)，涌現(xiàn)出大量新型的季銨鹽類(lèi)殺菌劑，同時(shí)也出現(xiàn)了大量的相關(guān)市售產(chǎn)品，如十二烷基二甲基芐基氯化銨(潔爾滅)、十二烷基二甲基芐基溴化銨(新潔爾滅)[3]等。長(zhǎng)鏈烷基季銨鹽類(lèi)殺菌劑具有獨(dú)特的四價(jià)氮結(jié)構(gòu)，其親水的陽(yáng)離子和疏水的長(zhǎng)鏈[4]與細(xì)菌表面結(jié)合后，通過(guò)改變細(xì)菌菌膜的電勢(shì)致使細(xì)菌菌膜破裂，進(jìn)而達(dá)到殺死細(xì)菌的目的。該類(lèi)消毒劑大部分為單季銨鹽[5-6]，如新潔爾滅是單季銨鹽為主要組分的代表類(lèi)市售產(chǎn)品。然而，近期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌對(duì)于單季銨鹽的耐受性增高，敏感性下降，使得單季銨鹽類(lèi)產(chǎn)品的使用受到限制。因此，開(kāi)發(fā)雙季銨鹽殺菌劑具有重要的研究?jī)r(jià)值[7]。

本課題組長(zhǎng)期致力于增強(qiáng)季銨鹽的抗菌效果研究，并取得了一定進(jìn)展[4,8-10]。本研究以二溴丙烷和N,N-二甲基乙醇胺為基本原料，合成了2種具有雙季銨基團(tuán)的季銨鹽(QAS-1、QAS-2，圖1)，通過(guò)FTIR、NMR和元素分析表征了兩者的結(jié)構(gòu)，并采用二倍稀釋法[11-12]測(cè)定了抗菌性能。

圖1 QAS-1和QAS-2的合成路線Fig.1 Synthesis routine of QAS-1 and QAS-2

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

無(wú)水甲醇、乙醚、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、N-甲基二乙醇胺、1,3-二溴丙烷、N,N-二甲基乙醇胺、醋酸氯己定(CA苯扎氯銨(BZK))均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；傅立葉變換紅外光譜儀(Perkin-Elmer公司)；Bruker Avance 400核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)；KYC 1102C型雙層空氣搖床(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SPX-250B-G型培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、Vario EL cube元素分析儀(Elementar公司)。

1.2 QAS-1的合成

取1,3-二溴丙烷(2.0 g,10.0 mmol)和N,N-二甲基乙醇胺(1.78 g,20.0 mmol)置于裝有3 mL DMF的25 mL圓底燒瓶中，薄層分析法(TLC)跟蹤檢測(cè)，60 ℃下攪拌回流反應(yīng)5 h，無(wú)水乙醚沉淀得到粗產(chǎn)物，重結(jié)晶得白色固體QAS-1(3.25 g，85%)。熔點(diǎn)：125～128 ℃。IR(cm-1):3 313(br),2 967(m),1 480(m),1 370(m),1 080(s),1 045(s),997(s),938(s),922(s),849(m)。1H NMR(400 MHz,DMSO-D6)δ:5.31(t,J=4.9 Hz,2H,—OH),3.84(t,J=6.2 Hz,4H,—CH2),3.50(t,J=6.2 Hz,4H,—CH2),3.40(t,J=8.3 Hz,4H,—CH2),3.16(s,12H,—CH3),2.27(m,J=4.6 Hz,2H,—CH2)。13C NMR(100 MHz,DMSO-D6)δ:65.42,60.87,55.29,51.64,17.32。Elemental analysis(%) calcd for C11H28Br2N2O2(378.05):C 34.75,H 7.42,N 7.37;Found:C 34.72,H 7.38,N 7.32。

1.3 QAS-2的合成

取1,3-二溴丙烷(2.0 g,10.0 mmol)和N-甲基二乙醇胺(2.14 g,20.0 mmol)置于裝有3 mL DMF的25 mL圓底燒瓶中，TLC跟蹤檢測(cè)，60 ℃下攪拌回流反應(yīng)5 h，無(wú)水乙醚沉淀得到粗產(chǎn)物，重結(jié)晶得白色固體QAS-2(3.10 g,83%)。熔點(diǎn)：92～95 ℃。IR(cm-1):3 267(br),2 956(m),1 476(m),1 076(s),1 047(s),950(s),897(m)。1H NMR(400 MHz,DMSO-D6)δ:5.30(t,J=4.8 Hz,4H,—OH),3.85(t,J=6.4 Hz,8H,—CH2),3.55(t,J=6.4 Hz,8H,—CH2),3.41(t,J=8.2 Hz,4H,—CH2),3.17(s,6H,—CH3),2.26(m,2H,—CH2)。13C NMR(100 MHz,DMSO-D6)δ:63.63,58.70,54.70,49.31,16.48。Elemental analysis(%) calcd for C13H32Br2N2O4(438.07):C 35.47,H 7.33,N 6.36;Found:C 35.40,H 7.37,N 6.34。

1.4 抗菌活性測(cè)試

供試菌株：細(xì)菌有金黃色葡萄球菌(S.Aureus(ATCC6538))、大腸桿菌(E.Coli(ATCC25922))、綠膿桿菌(P.Aeruginosa(ATCC9027))、變形桿菌(Proteusvulgaris(CMCC(B)49027))；真菌有白色念珠菌(CanidiaAlbicans(ATCC10231)。醋酸氯己定(CA)和苯扎氯銨(BZK)為陽(yáng)性對(duì)照品。

菌液的配制：取復(fù)蘇后的菌液于EP管中，1 000 r/min下離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液配成1.0×108、1.0×106CFU/mL的菌液，備用。

樣品及對(duì)照品溶液的配制：分別取CA、BZK、QAS-1和QAS-2樣品25 mg，配制成濃度為2 500、1 600、1 000、500、100 mg·L-1的待測(cè)藥液。

抑菌圈的測(cè)定：取0.1 mL濃度為1.0×108CFU/mL的菌液涂布于培養(yǎng)基中，將高壓滅菌后的圓形濾紙片(直徑6.0 mm)分別貼在培養(yǎng)基中。設(shè)置2 500、1 000、500、100 mg·L-1藥液組，每組滴加待測(cè)液7 μL，另設(shè)置空白對(duì)照組，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h，測(cè)定抑菌圈的直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定：設(shè)置濃度組別為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg·L-1，另設(shè)空白對(duì)照組，各組試管分別加入0.1 mL濃度為1.0×106CFU/mL菌懸液。各組試管均置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄MIC值。

最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定：將藥品有效抑菌濃度藥液0.1 mL移種至培養(yǎng)皿，并置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。記錄菌落數(shù)，以培養(yǎng)皿中計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落作為最低殺菌濃度(MBC)。

1.5 細(xì)胞毒性測(cè)試

以QAS-1為代表，采用MTT法測(cè)定QAS-1對(duì)人正常肝細(xì)胞(LO2)和人永生化表皮細(xì)胞(HaCat)的細(xì)胞毒性。培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制備細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，棄培養(yǎng)液，加入100 μL制備好的QAS-1、BZK、CA溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，棄上清液，加入200 μL MTT溶液(10%)，于37 ℃孵育4 h后，棄去上清液，加入150 μL DMSO，于570 nm處測(cè)定吸光度值，評(píng)價(jià)QAS-1的細(xì)胞毒性[13-14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成與結(jié)構(gòu)分析

本研究通過(guò)一步法分別合成了2種具有雙季銨基團(tuán)的季銨鹽(QAS-1和QAS-2)，并通過(guò)FTIR、NMR和元素分析確證了其結(jié)構(gòu)(圖2)。由圖可見(jiàn)，QAS-1的1H NMR中，5.31 ppm處的三重峰對(duì)應(yīng)對(duì)稱(chēng)羥基上的2個(gè)質(zhì)子，3.84 ppm和3.40 ppm處的峰對(duì)應(yīng)與N相連的亞甲基上的質(zhì)子，3.50 ppm處對(duì)應(yīng)與—OH連接的亞甲基上的質(zhì)子，3.16 ppm處的12個(gè)氫對(duì)應(yīng)季銨鹽中4個(gè)甲基的質(zhì)子，2.27 ppm處的氫對(duì)應(yīng)丙烷中間亞甲基上的質(zhì)子；在QAS-2的1H NMR中，相同的羥基質(zhì)子氫在5.30 ppm處，中間橋聯(lián)丙基的氫分別在3.42 ppm和2.26 ppm，16個(gè)亞甲基氫的化學(xué)位移在3.85 ppm和3.55 ppm處，6個(gè)甲基氫的化學(xué)位移在3.17 ppm處。13C NMR顯示(圖3)，51.64 ppm對(duì)應(yīng)與羥基相連的2個(gè)亞甲基碳，55.29 ppm則對(duì)應(yīng)4個(gè)甲基上的碳原子，65.42 ppm和60.87 ppm對(duì)應(yīng)與氮原子直接相連的亞甲基的2個(gè)碳原子，而17.32 ppm對(duì)應(yīng)丙基中間的碳原子；QAS-2的羥乙基中碳的化學(xué)位移在63.63、54.70 ppm，橋聯(lián)丙基碳的化學(xué)位移在58.70 ppm和16.48 ppm，甲基碳在49.31 ppm處。另外，紅外光譜數(shù)據(jù)顯示，3 313 cm-1和3 267 cm-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)官能團(tuán)—OH的吸收峰。以上結(jié)構(gòu)分析均證實(shí)了雙季銨鹽QAS-1和QAS-2結(jié)構(gòu)的正確性。

該方法操作簡(jiǎn)便，制備得到的雙季銨鹽QAS-1和QAS-2，產(chǎn)率均在80%以上。目標(biāo)產(chǎn)物均為白色固體，極性較大，在石油醚、乙醚、丙酮等非極性或弱極性有機(jī)溶劑中不易溶解，易溶于水、甲醇、乙醇、DMF、DMSO。

2.2 抗菌活性分析

2.2.1 藥物對(duì)菌種的抑菌圈直徑本研究采用紙片法測(cè)試季銨鹽的抗菌性能，所得3次結(jié)果取平均值。在100、500、1 000 mg·L-1質(zhì)量濃度下，QAS-1和QAS-2對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌和白色念珠菌的抑菌圈直徑均不超過(guò)7.0 mm(表1～2)，與陽(yáng)性對(duì)照藥(CA、BZK)相比，抑菌圈相對(duì)較小，說(shuō)明QAS-1和QAS-2對(duì)革蘭氏陰性菌和真菌的抗菌性能較差。在相同濃度條件下，2種季銨鹽與空白組相比無(wú)顯著性差異，且QAS-1、QAS-2的抑菌圈直徑大小相近，說(shuō)明兩者對(duì)革蘭氏陰性菌及真菌的作用效力并無(wú)明顯差別。但高濃度下，QAS-2對(duì)真菌的作用能力強(qiáng)于QAS-1。在質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時(shí)，QAS-1和QAS-2對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為7.1、7.5 mm，與CA、BZK活性相當(dāng)；在質(zhì)量濃度為500、1 000 mg·L-1時(shí)，兩者對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑逐漸增大，分別為7.6、8.3 mm(QAS-1)和8.1、9.5 mm(QAS-2)，且QAS-2的抑菌圈直徑要明顯大于QAS-1。顯著性分析結(jié)果顯示，QAS-1、QAS-2對(duì)金黃色葡萄球菌作用與空白組相比存在明顯差異?？傮w來(lái)看，兩者對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑隨著藥物濃度的增加而增加，具有一定的劑量依賴(lài)性，且在低濃度時(shí)，兩者抑菌能力差別不大，高濃度下QAS-2抑菌能力優(yōu)于QAS-1。

表1 QAS-1與QAS-2對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌圈直徑Table 1 Diameter of zones of inhibition of Gram-negative bacteria of QAS-1 and QAS-2 d/mm

diameters of zone are expressed as mean ±SD(n=3), compared with the blank group(抑菌直徑取平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(X±S)，X為3次結(jié)果的平均值，各組同空白組紙片的直徑比較);**P<0.01,*P<0.05

表2 QAS-1與QAS-2對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌的抑菌圈直徑Table 2 Diameter of zones of inhibition of Gram-positive bacteria and fungus of QAS-1 and QAS-2 d/mm

diameters of zone are expressed as mean ±SD(n=3), compared with the blank group(抑菌直徑取平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(X±S)，X為3次結(jié)果的平均值，各組同空白組紙片的直徑比較);**P<0.01,*P<0.05

2.2.2 藥物對(duì)菌種的最低抑菌濃度(MIC)最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。QAS-2對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌的MIC值均為200 mg·L-1，表現(xiàn)出較弱的抗菌活性。而QAS-2對(duì)白色念珠菌的MIC值為50 mg·L-1，表明其對(duì)真菌的抑菌效果優(yōu)于細(xì)菌。QAS-1對(duì)5種菌株的抑菌活性均較差，其MIC值為100 mg·L-1或200 mg·L-1，但對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌即金黃色葡萄球菌的MIC值低于其他的細(xì)菌。相比而言，QAS-2對(duì)真菌的抑菌活性比QAS-1強(qiáng)，對(duì)其余細(xì)菌菌株的抗菌活性?xún)烧呦喈?dāng)。

表3 QAS-1與QAS-2的最低抑菌濃度(MIC)Table 3 Determination of minimal inhibition concentration(MIC) of QAS-1 and QAS-2 ρ/(mg·L-1)

2.2.3 最低殺菌濃度(MBC)最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)于細(xì)菌，QAS-1和QAS-2的MBC值為200 mg·L-1或400 mg·L-1，而B(niǎo)ZK和CA的MBC值分別為50、25 mg·L-1，說(shuō)明對(duì)細(xì)菌而言，QAS-1和QAS-2的殺菌效果弱于BZK和CA。而對(duì)于真菌，QAS-1和QAS-2的MBC值均為100 mg·L-1，說(shuō)明其對(duì)真菌的殺菌效果比對(duì)細(xì)菌好，但比CA和BZK的效果差。該結(jié)果與MIC的規(guī)律基本一致。QAS-2對(duì)革蘭氏陰性菌(綠膿桿菌、變形桿菌)的MBC為200 mg·L-1，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)的MBC值為400 mg·L-1，即QAS-2對(duì)革蘭氏陰性菌的殺菌效果優(yōu)于革蘭氏陽(yáng)性菌；2種季銨鹽的殺菌能力相當(dāng)，但QAS-1對(duì)大腸桿菌的殺傷能力強(qiáng)于QAS-2。

表4 QAS-1與QAS-2的最低殺菌濃度Table 4 Determination of minimum bactericidal concentration of QAS-1 and QAS-2 ρ/(mg·L-1)

2.2.4 抗菌作用機(jī)理研究選取QAS-1為代表藥物，研究其對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌作用機(jī)理。未加入QAS-1的金黃色葡萄球菌掃描電子顯微鏡(SEM)及透射電子顯微鏡(TEM)圖顯示，細(xì)菌形態(tài)飽滿、細(xì)胞圓潤(rùn)，具有完整的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)(圖4A、B)。經(jīng)QAS-1作用12 h后，細(xì)菌形態(tài)扭曲，局部發(fā)生塌陷，TEM顯示細(xì)胞壁破裂，胞內(nèi)物質(zhì)流出，菌體瀕臨死亡(圖4C、D)。QAS-1的作用時(shí)間增加至24 h，發(fā)現(xiàn)大量的細(xì)菌形態(tài)發(fā)生皺縮、塌陷(圖4E、F)，此時(shí)的細(xì)菌已不具備完整的結(jié)構(gòu)，細(xì)菌細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物流出，細(xì)菌死亡[12]。這可能是帶正電荷的季銨鹽吸附在帶負(fù)電的細(xì)菌表面，引起細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外流，從而達(dá)到了殺滅細(xì)菌的目的。

表5 QAS-1對(duì)HaCat和LO2的細(xì)胞毒性Table 5 Cytotoxicity of QAS-1 toward HaCat and LO2 cells

2.3 細(xì)胞毒性分析

本研究采用MTT法測(cè)試了QAS-1對(duì)人正常肝細(xì)胞(LO2)和人永生化表皮細(xì)胞(HaCat)的細(xì)胞毒性，相應(yīng)的細(xì)胞半數(shù)致死量(IC50)值見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，QAS-1對(duì)LO2和HaCat的IC50值均高于90 mg·L-1，該數(shù)值遠(yuǎn)大于陽(yáng)性藥BZK、CA的IC50值，表明該季銨鹽對(duì)LO2和HaCat的細(xì)胞毒性顯著低于陽(yáng)性藥。BZK、CA為常用消毒劑主要成分，其較強(qiáng)的細(xì)胞毒性使得此類(lèi)消毒劑的應(yīng)用受到限制。相比而言，QAS-1毒性明顯低于陽(yáng)性藥，預(yù)示著該類(lèi)季銨鹽在臨床使用方面具有潛在價(jià)值[15-16]。

3 結(jié) 論

本文以二溴丙烷、N,N-二甲基乙醇胺、N-甲基二乙醇胺為原料合成雙季銨鹽QAS-1和QAS-2，并通過(guò)FTIR、NMR和元素分析對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，測(cè)試了2種季銨鹽對(duì)S.aureus、E.coli、P.Aeruginosa、Proteusvulgaris和CanidiaAlbicans5種菌株的抗菌性能，并通過(guò)SEM及TEM研究了該類(lèi)季銨鹽的殺菌作用機(jī)理。結(jié)果顯示，2種雙季銨鹽對(duì)所選菌株均具有一定的抑菌活性，且對(duì)真菌的殺菌效果顯著優(yōu)于細(xì)菌;作用機(jī)理研究顯示，該類(lèi)季銨鹽通過(guò)作用于細(xì)菌細(xì)胞壁，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性，從而達(dá)到殺滅細(xì)菌的作用。毒性實(shí)驗(yàn)顯示QAS-1對(duì)細(xì)胞的殺傷能力明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組CA和BZK?？傮w來(lái)看，該類(lèi)季銨鹽的合成工藝簡(jiǎn)單，水溶性和抗菌活性良好，細(xì)胞毒性小，在抗菌領(lǐng)域中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，為開(kāi)發(fā)具有高效、低毒的新型抗菌藥物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。