楊 梅,張 何,雷湘玲,傅 昕,王 青,周寧濤
(湖南工程學院 化學化工學院,湖南省環(huán)境催化與廢棄物再生化重點實驗室,湖南 湘潭 411104)
重金屬污染指由重金屬或其化合物造成的環(huán)境污染,主要由礦產開采、污水排放和使用重金屬超標制品等人為因素導致。汞(Hg)是環(huán)境中毒性最強的重金屬元素之一,具有生物富集性和生物非降解性,可導致汞中毒并引發(fā)尿血、尿毒癥等疾病[1-3]。二價汞離子是汞在水體中的主要存在形式[4-5],目前傳統(tǒng)的汞離子檢測方法主要有熒光光譜法[6]、電感耦合等離子質譜法(ICP-MS)[7]、高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法(HPLC-ICP-MS)[8]、冷蒸氣原子熒光光譜法[9]、熒光猝滅法[10]等,這些方法具有較好的特異性、準確性及靈敏度,但存在依賴精密儀器,操作過程復雜,成本較高等缺點,難以實現現場快速檢測。因此建立一種靈敏度高、成本低、操作簡單的汞離子傳感技術具有重要的現實意義。
石墨烯(Graphene)在2004 年由英國科學家Geim 等首次成功制備,是一種由 sp2雜化的單層碳原子緊密堆積組成的二維蜂窩狀碳納米材料。石墨烯及其衍生物具有優(yōu)良的光學、力學、熱學及化學性能,在熒光特性方面,石墨烯及其衍生物以環(huán)境友好、光致發(fā)光能力強、機械強度高、水溶性好、表面修飾容易等優(yōu)點,成為一種應用廣泛的新型熒光物質,在生物傳感器、環(huán)境檢測、疾病檢測、細胞成像等領域發(fā)揮著越來越重要的作用[11-13]。研究發(fā)現,胸腺嘧啶與汞離子之間能夠通過N—Hg鍵形成T-Hg2+-T結構,并且該結構中的N—Hg鍵比Watson-Crick氫鍵更穩(wěn)定[14],因此構建富T核酸適配體探針可以實現汞離子的高選擇性識別。目前基于該結構已發(fā)展了許多汞離子檢測新技術,如熒光光度法[15]、電化學方法[16]、表面等離子體共振[17]、表面增強拉曼散射[18]和比色傳感器[19-20]等。
本研究以納米金(AuNPs)復合的氧化石墨烯為熒光材料,以選擇性結合Hg2+離子的巰基化單鏈富T核酸適配體(Aptamer)為分子識別探針,并基于該探針與Hg2+結合后能將氧化石墨烯的熒光猝滅的特性,構建了一種簡單、低成本、免標記、快速的“turn-off”型石墨烯基Hg2+檢測技術,可用于自來水、湖水、河水等環(huán)境水體中汞離子的現場檢測。因為該復合材料比石墨烯、金納米顆粒單獨存在時表面積更大,使得aptamer在AuNPs上的修飾更加容易,同時該材料還具有較大的比表面積,可顯著提高電子轉移速率[21]。
UV-1800 型紫外-可見分光光度計(日本島津公司);Milli-Q Reference 超純水儀(德國默克密理博公司);pH-2602 酸度計(上海天達儀器有限公司);手提式壓力蒸汽滅菌器(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司);真空干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司);電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);高速離心機(艾本德生命科學公司);熒光分光光度計(美國PE公司);超聲波細胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。
石墨粉、硝酸鈉、高錳酸鉀、雙氧水、檸檬酸三鈉、氯金酸、氯化鉀、氯化鎂、二硫蘇糖醇、二氯化汞及其它金屬離子鹽均購自上海生工生物工程股份有限公司。所用試劑均為分析純,使用時未經進一步純化,實驗用水為去離子水。aptamer 探針由上海生工生物工程股份有限公司合成,序列為5'-SH-(CH)6-TTCTTTCT TCGCGTTGTTTGTT- 3'。
1.2.1 Hummers法制備氧化石墨烯(GO)[22-24]搭建實驗裝置,以攪拌器為主體,放上小水盆,利用支架(鐵架臺)固定250 mL三口燒瓶,調整攪拌頭與燒瓶底部的位置,以接觸而不壓住為宜,可開啟攪拌器檢驗效果。
低溫處理:向水盆中加入適量冰塊與水(覆蓋燒瓶1/2體積為宜),燒瓶中加入23 mL濃硫酸并安放好溫度計,在冰水浴下冷卻至5 ℃以下,依次加入1.0 g石墨粉、0.25 g NaNO3(注意盡量不要沾在玻璃容器壁上),在冰水浴5 ℃以下,充分攪拌反應 30 min。
低溫反應:將準備好的3.0 g KMnO4緩慢分批加入,持續(xù)至少0.5 h,并控溫10 ℃以下反應2 h;中溫反應:緩慢升溫至35~40 ℃(可采用水浴法)并恒溫1 h,中溫、低溫時間只能多不能少,此時溶液呈粘稠墨綠色;高溫反應:緩慢小心加入46 mL蒸餾水,使硫酸遇水放出大量的熱,將體系溫度穩(wěn)定在98 ℃左右,若溫度計升溫較快,上升到85 ℃左右時暫停加水,等穩(wěn)定后繼續(xù)添加,防止溫度過高,解離后的石墨片層在高溫下發(fā)生聚合反應,出現黑色顆粒聚集。若達不到預期溫度,用提前備好的沸水水浴或者電熱套等直接加熱,恒溫15 min(95 ℃左右亦可,溶液高溫處理后呈現亮黃色為佳,繼續(xù)加熱10~15 min,整個高溫階段不宜超過30 min);冷卻10 min,達到室溫(可以用冰水冷卻),然后加140 mL蒸餾水稀釋,以3 mL 30% H2O2洗至溶液無氣泡產生,混合溶液呈亮黃色。
抽濾:用5% HCl 50 mL多次洗滌,再用適量蒸餾水洗滌至黑色,然后進行反復加水離心處理,轉速4 000 r/min,待pH值接近中性時停止離心,并收集氧化石墨于燒杯中,取出所得產物,于60 ℃下真空干燥過夜,即得到干燥的氧化石墨烯。
1.2.2 石墨烯-金納米顆粒復合材料的制備[25]稱量30 mg的自制GO,加入30 mL去離子水,使用超聲波細胞破碎儀超聲處理(80 W)2 h,得到質量濃度為1 mg/mL的GO懸浮液。在上述懸浮液中加入0.03 g的檸檬酸三鈉,攪拌并加熱至70~80 ℃,反應10 min;30 min內分3~5次間隔加入1%的氯金酸共5 mL,此時溶液呈現深紫色,繼續(xù)反應5~10 min即可停止反應。12 000 r/min離心15 min,離心洗滌3次后懸浮于去離子水中,得到氧化石墨烯-金納米顆粒復合材料(GO@AuNPs)。
1.2.3 巰基aptamer功能化量取30 mL石墨烯-金納米顆粒復合材料懸浮液(1 mg/mL),超聲處理3 h(400 W,設定超聲2 s間隔3 s)后取1 mL加入100 μL 1 mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)和100 μL 10 μmol/L的aptamer,再用去離子水稀釋至5 mL,常溫孵育24 h;將上述反應溶液離心(12 000 r/min,10 min)并用10 mmol/L PBS進行多次洗滌以去除游離的DNA,最后加入5 mL 10 mmol/L PBS,獲得aptamer-GO@AuNPs懸浮液。
1.2.4 Hg2+的檢測將0.5 mL待測樣品(含不同濃度Hg2+的水溶液)和0.5 mL aptamer-GO@AuNPs懸浮液混合均勻后常溫下反應10 min,分別測定其熒光光譜,選擇615 nm處的熒光值作為測量值,計算熒光猝滅效率(IF0-IF)/IF0,其中IF為樣品熒光測量值,IF0為Hg2+濃度為0時的熒光值。將100 nmol/L的Ag+、Cd2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Pb2+、Co2+、Ca2+分別加入到上述的aptamer-GO@AuNPs懸浮液中,考察該檢測系統(tǒng)的特異性。
通過Hummers法制備出氧化石墨烯(GO),隨后以檸檬酸三鈉為還原劑,在無穩(wěn)定劑、溫和的液相反應條件下,于氧化石墨烯表面原位還原氯金酸形成金納米顆粒,制備出氧化石墨烯負載金納米顆粒復合材料。氧化石墨烯負載的金納米顆粒可以和aptamer上修飾的巰基形成強共價鍵(Au—S)并穩(wěn)定結合形成aptamer-GO@AuNPs。汞離子存在時,由于7個T-Hg2+-T結構的配位作用,aptamer折疊形成剛性的發(fā)夾狀雙鏈DNA結構,并使Hg2+靠近石墨烯表面(少于1 nmol/L),電子可沿著雙鏈DNA通道從石墨烯轉移到汞離子,從而猝滅氧化石墨烯的熒光[26]。納米金的引入使得aptamer探針的修飾變得容易,同時經過納米金修飾的氧化石墨烯比表面積更大,有利于檢測信號的進一步放大。
圖1 基于氧化石墨烯熒光猝滅的免標記Hg2+檢測原理示意圖Fig.1 Principle of the label-free detection of Hg2+ based on quenching of the fluorescence emission of graphene oxide
圖2A為GO薄片的AFM圖像,制備的GO薄片尺寸較為均一,長度為600 nm,寬度為400 nm,高度為20 nm(圖2B)。圖2C是氧化石墨烯負載金納米顆粒的SEM圖像,從圖中可看出大量的金納米顆粒均勻地分布在氧化石墨烯薄片上,粒徑在20 nm左右,而且單層附著的金納米顆粒團聚少,粒徑較為均勻,說明兩者復合效果好。圖2D為氧化石墨烯與不同含量(0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)的氯金酸溶液反應后制備的GO@AuNPs的紫外可見吸收光譜圖,從圖可看出復合材料在540 nm 左右有較強的吸收峰,這與納米金溶液的紫外吸收特征峰基本相符。隨著氯金酸含量的升高,制備的GO@AuNPs復合材料在540 nm左右的吸收峰也相應升高,說明在石墨烯表面生長了更多的納米金顆粒。
圖3 GO及其復合材料的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of GO and its composites
考察了GO、GO@AuNPs、aptamer-GO@AuNPs、aptamer-GO@AuNPs+Hg2+的熒光光譜變化情況(圖3)。從圖3可以看出,GO具有明顯的近紅外熒光,半峰寬較大(接近200 nm);而在制備GO@AuNPs的過程中,檸檬酸三鈉的加入使得GO存在一定程度的還原,導致GO部分發(fā)光中心被去除(700~850 nm),一些發(fā)光中心被保留(600~700 nm),并出現了強的新發(fā)光中心(610 nm),表現為GO@AuNPs的熒光峰半高寬變小(接近90 nm)。GO@AuNPs在修飾上aptamer探針后(aptamer-GO@AuNPs),其熒光光譜的峰位、半峰寬無明顯變化,但熒光強度略有降低,可能是在修飾過程中GO@AuNPs有少量損失,或者aptamer探針修飾在復合材料的表面,對發(fā)光中心的光致發(fā)光性能產生了一定的影響。加入Hg2+后,aptamer-GO@AuNPs復合材料的熒光強度迅速下降,說明Hg2+導致的發(fā)夾狀雙鏈DNA結構能有效將電子從石墨烯傳遞到汞離子,從而猝滅了氧化石墨烯的熒光。
由于在GO@AuNPs復合材料的制備中,當金納米顆粒在石墨烯表面的覆蓋率過高時,將導致石墨烯的熒光被直接猝滅,因此考察了不同含量(0、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)氯金酸形成的GO@AuNPs復合材料(1 mg/mL)在600 nm處的熒光發(fā)射強度。發(fā)現隨著金納米顆粒的負載,氧化石墨烯的熒光逐漸減弱,在氯金酸含量為0.1%~1.0%時,其熒光強度降低較慢,隨后熒光值快速下降(圖4A),因此在后續(xù)實驗中采用1.0%氯金酸制備GO@AuNPs復合材料。
考察了aptamer-GO@AuNPs與Hg2+的孵育時間對熒光猝滅效率的影響,如圖4B所示,當孵育時間為10 min時,其熒光猝滅效率達90%,因此后續(xù)實驗采用10 min作為aptamer-GO@AuNPs復合材料與Hg2+的反應時間。
在aptamer-GO@AuNPs復合材料的懸浮液中分別加入不同濃度(0、0.1、0.5、1、10、20、50、100、500 nmol/L)的Hg2+,考察了Hg2+濃度對反應體系熒光強度的影響。由圖5A可知,隨著Hg2+濃度的增大,反應體系的熒光強度不斷減弱,當Hg2+濃度超過100 nmol/L時,熒光值基本保持穩(wěn)定(圖5B)。Hg2+濃度(c,nmol/L)在0.5~80 nmol/L之間與熒光猝滅效率(IF0-IF)/IF0(y)呈現良好的線性關系,回歸方程為y=0.214+0.007c,線性相關系數r2為0.996。以空白的3倍標準偏差除以標準曲線的斜率得到本方法的檢出限為0.3 nmol/ L,遠低于中國《生活飲用水衛(wèi)生標準》規(guī)定的飲用水中無機Hg2+的最高允許水平(<5 nmol/L)。結果表明,該方法對Hg2+的定量分析具有較高的靈敏度和良好的線性度。
圖6 Hg2+傳感器的選擇性分析Fig.6 Selectivity of the proposed sensor towards detection of Hg2+
考察了8種常見的金屬離子(Ag+、Cd2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Pb2+、Co2+、Ca2+)對體系識別Hg2+的影響。結果顯示,在其它金屬離子存在時,檢測體系的熒光強度無明顯變化(圖6),說明只有富T堿基的aptamer與Hg2+特異性結合后才能折疊形成剛性的發(fā)夾狀雙鏈DNA結構,并使Hg2+靠近石墨烯表面猝滅其熒光;其他金屬離子不能構建GO的電子傳遞通道。綜上所述,由于aptamer對Hg2+的較高特異性,使得該傳感器具有優(yōu)良的選擇性。
為考察本方法用于環(huán)境水體樣品中Hg2+檢測的可行性,分別采集自來水、湘江水以及湖水樣本,進行3個水平(1.0、10.0、50.0 nmol/L)的加標回收實驗,樣品使用前過濾去除懸浮顆粒及雜質。如表1所示,3種不同來源水體樣品的加標回收率為96.0%~105%,相對標準偏差(RSD)為1.4%~3.2%。結果表明,本方法具有良好的準確度和靈敏度,能夠滿足環(huán)境水體中 Hg2+污染檢測的要求。
表1 環(huán)境水體樣品的加標回收實驗結果(n=5)Table 1 Results of spiked recoveries of environmental water samples(n=5)
基于Hg2+能夠猝滅aptamer功能化氧化石墨烯-金納米顆粒復合材料熒光的特性,發(fā)展了一種免標記、快速的Hg2+傳感技術。該技術操作簡單,耗時僅10 min,具有高的靈敏度和選擇性,抗干擾能力強,穩(wěn)定性好,在環(huán)境水體樣本的檢測中表現出良好適應性,為環(huán)境檢測和臨床醫(yī)學診斷提供了一種實用、有效且廉價的檢測方法。